郁金香查爾酮合成酶TfCHS蛋白及其編碼基因的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種郁金香查爾酮合成酶TfCHS蛋白及其編碼基因，所述蛋白質為如SEQ?ID?NO.4所示的氨基酸序列組成的蛋白質或SEQ?ID?NO.4所示的氨基酸序列經過取代、缺失或者添加一個或幾個氨基酸且具有郁金香查爾酮合成酶活性的蛋白質。本發(fā)明還提供了一種編碼上述蛋白質的如SEQ?ID?NO.3所示的核酸序列。將本發(fā)明中郁金香查爾酮合成酶TfCHS基因通過構建正反義表達載體轉化到煙草中后，轉基因煙草查爾酮合成酶基因表達均受到不同程度的抑制，與此同時，轉基因煙草花朵的顏色出現(xiàn)不同程度的變淺，對應的花朵總花色苷含量下降了20%-60%。
【專利說明】郁金香查爾酮合成酶TfCHS蛋白及其編碼基因
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及郁金香花色苷合成途徑中的關鍵酶及其編碼基因，具體涉及一種郁金香查爾酮合成酶TfCHS蛋白及其編碼基因，屬于生物【技術領域】。
【背景技術】
[0002]花的顏色是決定花商品價值和觀賞價值的重要因素之一。改變花色，創(chuàng)新花色，可以增加花卉的商品價值和觀賞價值。花朵的顏色是花瓣細胞中花色素積累的結果，花色素主要包括類黃酮、類胡蘿卜素以及甜菜堿類。類黃酮作為花色素的一大類，使花朵產生從黃到紫的顏色。類黃酮的生物合成途徑為可分為三個階段，第一階段是由苯丙氨酸到香豆酰CoA，這是許多次生代謝共有的；第二階段由香豆酰CoA到二氫黃酮醇，這是類黃酮代謝的關鍵反應，它合成花青素和其它黃酮物質。所有類黃酮合成的前體物都是4-香豆酰CoA和丙二酰CoA在查爾酮合成酶(Chalcone synthase, CHS)的作用下產生查爾酮開始的。第三階段是各種花色素苷的合成。
[0003]由于CHS是合成黃烷酮、黃酮、黃酮醇及花色苷所必需的酶，因此被認為是類黃酮生物合成途徑的一個關鍵酶，為多基因家族編碼。CHS是花色素合成過程中的一個關鍵酶，其活性對花色素的形成起著至關重要的作用，它在植物中的表達量會影響花色素的合成量，進而影響花的顏色。利用基因工程技術對CHS基因的表達進行調控是改變花朵顏色的途徑之一。例如將cDNA反向連接于35S啟動子上，再連接雙元載體轉化矮牽牛會使花色紫紅色變?yōu)榉奂t色，有些花朵完全呈白色；將反義CHS基因導入非洲菊中，使非洲菊的花瓣不能正常著色；將反義CHS基因導入洋桔梗發(fā)現(xiàn)轉基因植株的花色變淺，甚至產生開白花的植株JfCHS基因正向導入開紫色花的矮牽牛中，得到開白花和紫白相間花的轉基因植株；將菊花CHS基因正義導入菊花栽培品種之后產生了白色花和圖案各異的彩瓣花等等。
[0004]目前，在很多植物中發(fā)現(xiàn)了CHS多基因家族，如矮牽牛、葡萄、甘薯、擬南芥、角堇等。但對于球根花丼郁金香(Tulipa fosteriana), CHS基因的克隆、表達模式及CHS蛋白編碼序列目前尚不清楚。目前，未有任何與郁金香CHS蛋白及其編碼基因相關的文獻報道。

【發(fā)明內容】

[0005]本發(fā)明填補郁金香CHS基因家族成員的克隆、表達模式分析、轉基因功能驗證以及郁金香CHS蛋白及其編碼基因的空白。本發(fā)明提供了一種郁金香CHS蛋白序列，本發(fā)明還提供了一種編碼上述蛋白質的核酸序列。本發(fā)明提供了郁金香TfCHS蛋白及其核苷酸序列在郁金香不同器官、不同發(fā)育階段的表達模式，構建了 TfCHS基因正反義表達載體并轉化煙草，分析了 TfCHS基因對轉基因煙草CHS基因表達及花朵中花色苷合成的影響。利用本發(fā)明提供的郁金香查爾酮合成酶基因TfCHS，能為基因工程改變花色，獲得創(chuàng)新花色提供一種有效的技術手段。
[0006]本發(fā)明的目的是提供了一種具有郁金香(Tulipa fosteriana)查爾酮合成酶活性的蛋白質，所述蛋白質是由如SEQ ID N0.4所示的氨基酸序列組成的蛋白質；或由SEQIDN0.4所示的氨基酸序列經過取代、缺失或者添加一個或幾個氨基酸且具有郁金香查爾酮合成酶活性的由(a)衍生的蛋白質。該蛋白質在花朵的不同發(fā)育階段、不同器官內的有無及活性大小存在較大差異。
[0007]優(yōu)選的，所述蛋白質為SEQ ID N0.4所示氨基酸序列經過I~50個氨基酸的缺失、插入和/或取代，或者在C末端和/或N末端添加I~20個以內氨基酸而得到的序列。
[0008]進一步優(yōu)選的，所述蛋白質為SEQ ID N0.4所示氨基酸序列中I~10個氨基酸被性質相似或相近的氨基酸所替換而形成的序列。
[0009]另一方面，本發(fā)明還提供一種編碼上述蛋白質的核酸序列。
[0010]優(yōu)選的，所述核酸序列具體為:
[0011](a)堿基序列如SEQ ID N0.3第I~1179位所示；
[0012]或(b)與SEQ ID N0.3第I~1179位所示的核酸有至少70%的同源性的序列；
[0013]或(c)能與SEQ ID N0.3第I~1179位所示的核酸進行雜交的序列。
[0014]優(yōu)選的，所述核酸序列具體為SEQ ID N0.3第I~1179位所示的核酸序列中I~90個核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加60個以內核苷酸形成的序列。
[0015]在本發(fā)明中，“分離的”、“純化的” DNA是指，該DNA或片段已從天然狀態(tài)下位于其兩側的序列中分離出來，還指該DNA或片段已經與天然狀態(tài)下伴隨核酸的組分分開，而且已經與在細胞中相伴隨的蛋白質分開。
[0016]在本發(fā)明中，術語“TfCHS蛋白編碼序列”指編碼具有郁金香TfCHS蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID N0.3所示序列中第I~1179位核苷酸序列及其簡并序列。該簡并序列是指:位于SEQ ID N0.3所示序列的第I~1179位核苷酸中，有一個或多個密碼子被編碼相同氨基酸的簡并密碼子所取代后而產生的序列。由于密碼子的簡并性，所以與SEQ ID N0.3所示序列中第I~1179位核苷酸序列同源性低至約70%的簡并序列也能編碼出SEQ ID N0.4所示的氨基酸序列。該術語還包括與SEQ ID N0.3所示序列中從核苷酸第I~1179位的核苷酸序列的同源性至少70%的核苷酸序列。
[0017]該術語還包括能編碼具有與天然的郁金香TfCHS相同功能的蛋白的SEQ ID N0.3所示序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于):通常為I~90個核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加為60個以內核苷酸。
[0018]在本發(fā)明中，術語“ TfCHS蛋白”指具有郁金香TfCHS蛋白活性的SEQ ID N0.4所示序列的多肽。該術語還包括具有與天然郁金香TfCHS相關相同功能的、SEQ ID N0.4所示序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于):通常為I~50個氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或為20個以內氨基酸。例如，在本領域中，用性能相近或相似的氨基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數個氨基酸通常也不會改變蛋白質的功能。該術語還包括郁金香TfCHS蛋白的活性片段和活性衍生物。
[0019]本發(fā)明的郁金香TfCHS蛋白的變異形式包括:同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導突變體、在高或低的嚴謹條件下能與郁金香TfCHS相關DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用郁金香TfCHS蛋白的抗血清獲得的多肽或蛋白。
[0020]在本發(fā)明中，“郁金香TfCHS保守性變異多肽”指與SEQ ID N0.4所示的氨基酸序列相比，有至多10個氨基酸被性質相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據表1進行替換而產生。
[0021]表1
[0022]
【權利要求】
1.一種如下(a)或(b)的蛋白質:(a)由如SEQID N0.4所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(b)SEQID N0.4所示的氨基酸序列經過取代、缺失或者添加一個或幾個氨基酸且具有郁金香查爾酮合成酶活性的由(a)衍生的蛋白質。
2.如權利要求1所述的蛋白質，其特征是，所述蛋白質為SEQID N0.4所示氨基酸序列經過I~50個氨基酸的缺失、插入和/或取代，或者在C末端和/或N末端添加I~20個以內氨基酸而得到的序列。
3.如權利要求2所述的蛋白質，其特征是，所述蛋白質為SEQID N0.4所示氨基酸序列中I~10個氨基酸被性質相似或相近的氨基酸所替換而形成的序列。
4.一種編碼權利要求1所述蛋白質的核酸序列。
5.如權利要求4所述的核酸序列，其特征是，所述核酸序列具體為:Ca)堿基序列如SEQ ID N0.3第I~1179位所示；或(b)與SEQ ID N0.3第I~1179位所示的核酸有至少70%的同源性的序列；或(c)能與SEQ ID N0.3第I~1179位所示的核酸進行雜交的序列。
6.如權利要求4所述的核酸序列，其特征是，所述核酸序列具體為SEQID N0.3第I~1179位所示的核酸序列中I~90個核苷酸的缺失、插入和/或取代，或者在5’和/或3’端添加60個以內核苷酸形成的·序列。
【文檔編號】C12N15/54GK103589698SQ201310531081
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2013年10月30日 優(yōu)先權日:2012年10月31日
【發(fā)明者】袁媛, 史益敏, 唐東芹, 馬曉紅 申請人:上海交通大學