專利名稱：：植物花色素苷形成的關(guān)鍵酶-查爾酮合成酶編碼基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及與植物花色素苷形成相關(guān)的酶編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：植物花中主要含有三大類色素，即類黃酮、類胡蘿卜素及生物堿類色素，其中類黃酮是主要色素。參與花色形成的類黃酮主要有兩大類一類是花色素苷，這是一類水溶性色素，產(chǎn)生的顏色范圍是從紅色到紫色；另一類是黃色2-苯甲川基苯呋喃酮?；ㄉ剀账嫉谋壤诤艽蟪潭壬夏軟Q定花的最終顏色。第一個(gè)類黃酮分子是由查爾酮合成酶(Chalconesythase，CHS)，催化類黃酮和花色素合成途徑的第一步反應(yīng)，是類黃酮類物質(zhì)生物合成途徑的限速酶。催化一分子4—香豆酰COA與三分子丙二酸單酰輔酶A縮合形成査爾酮分子的形式形成的(孟繁靜.植物花發(fā)育的分子生物學(xué).中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社[M],2000,12:225-256.)，查爾酮分子的異構(gòu)化和功能基團(tuán)的進(jìn)一步取代都能導(dǎo)致黃酮、異黃酮和花色素苷的合成，這些化合物為自然界提供了顏色，并且參與了多禾中生理過程(LiJ,OuLeeT,RabaR，etal.ArabidopsisflavonoidmutantsarehypersensitivetoUVBirradiation.PlantCelU993,5:171-179.)。査爾酮提供了類黃酮的基本碳骨架，CHS表達(dá)量的增加或減少都可能導(dǎo)致植物花色的變異(邵莉,楊美珠，陳章良等.查爾酮合酶基因?qū)D(zhuǎn)基因植物花色和育性的影響.植物學(xué)報(bào)[J].1996，38(7):517-524.)。CHS體外酶活性最早是1972年德國(guó)科學(xué)家Kreuzaler等從歐芹懸浮細(xì)胞培養(yǎng)液抽提物中檢測(cè)到的。CHS催化1分子4-香豆酰-CoA與3分子丙二酰-CoA縮合形成4，5，7-三羥基黃烷酮(naringeninechalcone)。4，5,7-三羥基黃垸酮為類黃酮化合物的前體。研究表明，CHS是由兩個(gè)亞基組成，酶功能的實(shí)現(xiàn)是在兩個(gè)亞基合作下完成的。也有報(bào)道顯示，兩個(gè)亞基可以單獨(dú)催化反應(yīng)(TropfS,KarcherB，SchroderQSchroderJ,Reactionmechanismsofhomodimericplantpolyketidesynthases(stilbeneandchalconesynthase):Asingleactivesiteforthecondensingreactionissufficientforsynthesisofstilbenes,chalcones,and6'-deoxychalcones.JBiolChem,1995,270:7922-7928.)。CHS具有多個(gè)酶活性位點(diǎn)，對(duì)于苜蓿蛋白晶體的分析表明其活性位點(diǎn)為Cysl64、Phe215、His303、Asn336(FewerJL,JezJM,BowmanME,etal.Structureofchalconesynthaseandthemolecularbasisofplantpolyketidebiosynthesis,NatureStructuraland.MolecularBiology,1999，6(8):775-784.)。在掌葉大黃的研究中，Gly256決定底物選擇性的起始，1111"197位于隱藏的催化袋的入口處以控制聚酮化合物的長(zhǎng)度，56^38的作用類似€乂5164-引導(dǎo)線性聚酮化合物中間產(chǎn)物進(jìn)入催化袋進(jìn)行下一步合成(AbeI,WatanabeT,MoritaH,etal.Engineeredbiosynthesisofplantpolyketides:manipulationofchalconesynthase.OrgLett,2006,8(3):499-502.)。這些位點(diǎn)中認(rèn)為Cys是4-香豆酰-CoA的結(jié)合位點(diǎn)，是酶活性所必需的(JezJM，NoelJRMechanismofchalconesynthase:pKaofthecatalyticcysteineandtheroleoftheconservedhistidineinaplantpolyketidesynthaseJBiolChem,2000，275:396—411.)。以上這些酶活性位點(diǎn)都位于第二亞基上。其蛋白序列長(zhǎng)約400個(gè)氨基酸，相對(duì)分子質(zhì)量4.2><104，以同源二聚體形式行使催化功能。CHS富含亮氨酸，可能用于形成亮氨酸拉鏈，參與CHS同源二聚體的形成。CHS的C端有一保守區(qū)域GFGFLVGW，被稱為CHS標(biāo)簽，只有極少數(shù)序列的W突變?yōu)長(zhǎng)、V或者Y。1985年用歐fC/K基因?yàn)樘结?，克隆了矮牽牛的CHS探針。目前約2000余條CHS相關(guān)的DNA序列在Genebank上做了登錄，觀賞植物中主要有:矮牽牛、牽牛、菊花(GuttersonNC,NapoliC,LemieuxC,etal.Modificationofflowercolorinflorist'schrysanthemum:ProductionofawhitegeneticsBio/technolog1994，12:268—271.)、翠菊、蝴蝶蘭、金魚草、夏蓳等等。C/K基因的ORF約1200bp左右，編碼400左右的氨基酸序列，其中第一外顯子編碼3060個(gè)氨基酸，第二外顯于編碼340個(gè)左右f的氨基酸。目前，雙子葉植物中的査爾酮合成酶己經(jīng)成為研究的焦點(diǎn)，菜豆中己發(fā)現(xiàn)8個(gè)CHS基因，矮牽牛中鑒定出8個(gè)甚至更多CHS基因(KoesRE,SpeltCE,MolJNM,GeratsAGM.ThechalconesynthasemultigenfamilyofPetuniahybrida:sequencehomology,chromosomallocationandevolutionaspects.Plant.Mol.Biol,1987，10:159-169,;KoesRE，SpdtCE,vandenElzenPJM,MolJNM.CloningandmolecularcharacterizationofthechalconesynthasemultigenefamilyofPetuniahybrida.Gene,1989,81:245-257.;RyderTB,CramerCL,BellJN,RobbinsMP，DixonRA，LambCJElicitorrapidlyinduceschalconesynthasemRNAinPhaseolusvulgariscellsattheonsetofthephytoalexindefenseresponse—ProceedingsNationalAcademyofScienceUSA,1984,81:5724-5728.;DurbinML,McCaigB,CleggMT.Molecularevolutionofchalconesynthasemultigenefamilyinthemorningglorygenome.PlantMol.Biol,2000,42:79-92.)。盡管Lo禾口Nicholson在兩色蜀黍(Sorphumbicolor)中己經(jīng)分離得到7個(gè)查爾酮合成酶基因，(gi(5305906)，gi(5305908),gi(5305910)，gi(5305912)，gi(5305914),gi(5305916)'gi(5305918))'但研究表明，在單子葉禾本科植物中的大部分屬(例如，玉米、稻、大麥、黑麥)只含有2個(gè)CHS基因(WienandU，WeydemannU,Nielsbach-KloesgenU,PetersonPAl,SaedlerH.MolecularcloningoftheC2locusofZeamays,thegenecodingforchalconesynthase.Mol,Gen.Genet,1986,203:202-207,;FrankenP，Niesbach-KlosgenU,WeydemannU,Marechal-DrouardL,SaedlerH,WienandU.TheduplicatedchalconesynthasegenesC2andWhp(whitepollen)ofZeamaysareindependentlyregulated;evidencefortranslationalcontrolofWhpexpressionbytheanthocyaninintensifyinggene.EMBOJ,1991，10:2605-2612.;RhodeW，DorrS,SalaminiF,BeckerD.StructureofachalconesynthasegenefromHordeumwulgare.PlantMol.Biol,1991,16:1103-1106.)。CHS是一個(gè)較大的基因家族，其編碼區(qū)比較保守，外顯子2的保守性高于外顯子1，種屬間氨基酸序列的同源性一般在75%99%,裸子植物與被子植物之間氨基酸序列同源性一般在60%。CHS是一個(gè)多基因家族，多數(shù)種內(nèi)的Ci/S基因同源性較高，個(gè)別種的C/7S基因分屬于其它的家族。CHS基因的拷貝數(shù)在不同的物種之間差異較大。矮牽牛中有12個(gè)CiK同源基因，大豆中至少有8個(gè)C/K基因，水生三葉草至少有9個(gè)，黑麥有4個(gè)，玉米中有2個(gè)，而金魚草和擬南芥只有一個(gè)拷貝。菊屬植物如菊花腦、甘菊、毛華菊等，目前至少分離了24個(gè)拷貝。菊花和非洲菊的拷貝數(shù)為3個(gè)?；蚣易宓某蓡T表達(dá)部位也不同，如矮牽牛中只有和C/iS/在花中表達(dá)(戴思蘭.菊花查爾酮合成酶基因的克隆與序列分析:[博士學(xué)位論文],北京:北京林業(yè)大學(xué),2006.)?；蛞话阒缓幸粋€(gè)內(nèi)含子，而且這個(gè)內(nèi)含子的位置在已發(fā)現(xiàn)的序列中均相同，即位于第65位(以歐洲赤松Pinussylvestri的PSCHS為標(biāo)準(zhǔn))的半胱氨酸密碼子內(nèi)第1和2位堿基之間長(zhǎng)度從幾十堿基對(duì)到兒千堿基不等。金魚草是目前發(fā)現(xiàn)的僅有的具有兩個(gè)內(nèi)含子的CHS同源基因。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種與植物花色素苷形成相關(guān)的蛋白及其編碼基因本發(fā)明所提供的與植物花色素苷形成相關(guān)的酶，名稱為7WK7//5，來源于蘋果屬王族海棠(Matoio戸/zy),是如下l)或2)的蛋白質(zhì)1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；2)將序列表中序列2的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物花色素苷形成相關(guān)的由l)衍生的酶。上述與植物花色素苷形成相關(guān)的酶的cDNA基因也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。與植物花色素苷形成相關(guān)的酶的cDNA基因具體可為如下l)-4)中任一所述的基因1)其編碼序列是序列表中序列l(wèi)的自5'末端第1-1536位脫氧核糖核苷酸；2)其核苷酸序列是序列表中的序列l(wèi);3)在嚴(yán)格條件下可與序列表中序列l(wèi)限定的DNA序列雜交且編碼上述與植物花色素苷形成相關(guān)的酶的DNA分子；4)與l)的基因具有95%以上的同源性，且編碼上述與植物花色素苷形成相關(guān)的酶的DNA分子。序列表中的序列1由1536個(gè)堿基組成，其開放閱讀框架(ORF)為自5'末端第1-1536位堿基，編碼氨基酸序列是序列表中序列2的CHS。擴(kuò)增上述C/ZS基因全長(zhǎng)或任一片段的引物對(duì)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法，所用引物合成及測(cè)序工作均由上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司完成。限制性內(nèi)切酶EcoRl、Hindin和T叫酶，T4DNA連接酶均購(gòu)自大連寶生物工程有限公司，pUC18-TVector購(gòu)自寶生物工程公司，BDSMARTRACEcDNAAmplificationKit購(gòu)自Clontech公司。Amp抗生素、Tris飽和酚、水飽和酚、DEPC、DL2000DNAMarker、瓊脂糖、酵母提取物、胰蛋白胨均購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司。一、MrC/ZS保守序列的獲得以王族海棠(A^/^Wqy"/zy)(北京農(nóng)學(xué)院海棠種質(zhì)資源圃)為實(shí)驗(yàn)材料，提取其葉的總RNA，將提取得到的總RNA用50pl的DEPC水溶解，電泳檢測(cè)。經(jīng)甲醛變性凝膠電泳分析，結(jié)果如圖1所示。從圖中可以清晰地看到28SrRNA和18SrRNA兩條帶，且28SrRNA和18SrRNA含量之比大約為1:1-2:1。結(jié)果表明，提取得到的RNA是完整的，染色結(jié)果顯示，提取得到的總RNA可以用來進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。以上述提取得到的葉總RNA為模板，將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA。再以此cDNA為模板，跟據(jù)蘋果屬植物査爾酮合成酶基因保守區(qū)段的上游和下游序列，設(shè)計(jì)一對(duì)MrCHS兼并性引物(序列表中序列3、4)用于CHS保守序列的擴(kuò)增反應(yīng)混合物_體積dd腦10取10xPCRBuffer2|xL2.5mMdNTPMix1.6|iL模板(反轉(zhuǎn)錄的單鏈cDNA)lnLprimer1(12.5pM)2pLprimer2(12.5(jM)2pL650xAdvantage2PolymeraseMix0.5^LPCR反應(yīng)條件先94。C預(yù)變性4min;然后94'C變性lmin;58'C退火lmin，共30個(gè)循環(huán)；最后72'C延伸10min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。二、MrC/ffi基因3'端序列的獲得以步驟一獲得的保守序列為模板，在其3'端設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增A^C7/S基因的3'端序列。MasterMix預(yù)混物體系如下預(yù)混物_體積(nL)ddH2010PCR緩沖液dNTPMixture(2.5mM)Taq酶(5U/1)總體積34pL，將上述MasterMix預(yù)混物平均分成2管，每管，按照下表加入引物:_雙引物對(duì)照_樣品3R(序列表中序列5)1nL1nL3PF1(序列表中序列6)1nL1nL模板一1pLPCR反應(yīng)條件先95'C預(yù)變性3min;然后95'C變性15S;68。C退火6min，共30個(gè)循環(huán)；最后72'C延伸7min。將第一輪PCR產(chǎn)物稀釋100倍，取lpL作為模板，以3R和3PF2(序列表中序列7)為引物，進(jìn)行巢式PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)條件與第一輪相同。取10nL第二輪PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖2所示，其中，M為2000bp的DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，1為樣品組的PCR擴(kuò)增結(jié)果，2為兩個(gè)單引物對(duì)照組的PCR擴(kuò)增結(jié)果。結(jié)果表明，兩個(gè)單引物對(duì)照組都沒有擴(kuò)增出特異條帶，只有樣品組擴(kuò)增得到760bp的片段。切下目的條帶，純化回收后按照pUC18-TVector(寶生物工程公司)說明書將PCR產(chǎn)物連接到pUC18-T載體上，進(jìn)行測(cè)序。經(jīng)同源性比較分析后確定獲得的758bp片段即是M"C/^基因的3'端序列。25.843.21三、MC/fS基因5'端序列的獲得以步驟一獲得的保守序列為模板，在其5'端設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增A/K7/^基因的5'端序列。MasterMix預(yù)混物體系如下預(yù)混物_體積(pL)ddH2025.810PCR緩沖液4dNTPMixture(2,5mM)3.2Taq酶(5U/1)1總體積34^L，將上述MasterMix預(yù)混物平均分成2管，按照下表加入引物:_雙引物對(duì)照_樣品5F(序列表中序列5)11HL5PR1(序列表中序列8)1pL1HL模板一1|iLPCR反應(yīng)條件945'C預(yù)變性4min—30個(gè)擴(kuò)增循環(huán)(94'C變性lmin—65'C退火lmin—72'C延伸lmin)—15個(gè)擴(kuò)增循環(huán)(94。C變性lmin—55。C退火lmin—72。C延伸lmin)—72。C繼續(xù)延伸10min。將第一輪PCR產(chǎn)物稀釋100倍，取1^L作為模板，以5F和5PR2(序列表中序列9)為引物，進(jìn)行巢式PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)條件與第一輪相同。取10pL第二輪PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖3所示，其中，M為200bp的DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，1為樣品組的PCR擴(kuò)增結(jié)果，2為兩個(gè)單引物對(duì)照組的PCR擴(kuò)增結(jié)果。結(jié)果表明，兩個(gè)單引物對(duì)照組沒有擴(kuò)增出特異條帶，只有樣品組擴(kuò)增得到1OOObp的片段。切下目的條帶，純化回收后按照pUC18-TVector(寶生物工程公司)說明書將PCR產(chǎn)物連接到pUC18-T載體上，進(jìn)行測(cè)序。經(jīng)同源性比較分析后確定獲得的1000bp片段即是JW一C/ff基因的5'端序列。四、MrCHS基因全長(zhǎng)cDNA序列的獲得將上述PCR擴(kuò)增獲得的7WK7/ffi基因5，端序列以及3'端序列進(jìn)行同源性比較，利用DNAMAN等生物軟件進(jìn)行拼接校正，拼接出MrC/K基因全長(zhǎng)cDNA序列。根據(jù)拼接的MrCi/S基因全長(zhǎng)cDNA序列設(shè)計(jì)引物MCF和MCR(序列表中序列10和序列11)，提取王族海棠葉的8總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA,利用RT-PCR方法擴(kuò)增全長(zhǎng)MCi/S基因，用高保真Pfo酶替換rag酶，PCR反應(yīng)混合物如下<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>PCR反應(yīng)條件945。C預(yù)變性4min—30個(gè)擴(kuò)增循環(huán)(94'C變性lmin—68'C退火lmin—72'C延伸lmin)—15個(gè)擴(kuò)增循環(huán)(94。C變性lmin—55。C退火lmin—72'C延伸lmin)—72'C繼續(xù)延伸10min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行P/。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖4所示，其中，M為2000bp的DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，l為il/rC/^基因全長(zhǎng)cDNA序列的PCR產(chǎn)物。結(jié)果表明獲得約1000bp的條帶。切下該目的條帶，純化回收后按照pUC18-TVector(寶生物工程公司)說明書將PCR產(chǎn)物連接到pUC18-T載體上。對(duì)擴(kuò)增得到的JWK://S基因全長(zhǎng)cDNA序列進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明，獲得1000bp的條帶，該1000bp的核苷酸片段即為AfrC7/S的CDS序列，71/rCi/S序列全長(zhǎng)如序列表中序列1所示，其編碼的氨基酸序列如序列表中序列2所示。圖1為王族海棠葉總RNA的提取結(jié)果圖2為M"C/K基因的3'RACEPCR擴(kuò)增結(jié)果圖3為M"CflS基因的5'RACEPCR擴(kuò)增結(jié)果圖4為M"C/^基因全長(zhǎng)cDNA序列的PCR擴(kuò)增結(jié)果序列表序列一DNA蘋果屬王族海棠(Ma/w57q^/;y)1CGGGAAGAATGGTTGTGCTGCTGACACCCTTTACCTCCTCTCTTACTTACCCTTGCAACG61TCCTCTAACTCCTCCTCTCTTCGATCTTTCTTGACGACCCGATCAAAATGGTGACCGTCG121AAGAAGTTCGCAAGGCTCAACGGGCTGAGGGTCCGGCCACTGTTTTGGCCATTGGGACAG181CAACTCCTCCCAACTGTGTGGATCAAGCCACATACCCCGACTATTACTTTCGTATCACCA241ACAGTGAGCACAAGACTGAGCTCAAAGAAAAATTCCAGCGCATGTGTGACAAATCTATGA301TCAAGACGCGTTACATGTACTTGACTGAAGAAATTCTGAAAGAGAACCCAACCGTGTGCG361AGTACATGGCTCCCTCACTCGATGCTCGGCAGGACATGGTGGTTGTTGAAGTCCCAAGGC421TTGGCAAAGAGGCTGCCACCAAGGCCATTAAGGAATGGGGACAGCCCAAGTCCAAAATCA481CCCACTTGGTCTTTTGCACTACCAGCGGTGTCGACATGCCCGGCGCCGACTACCAACTCA541CCAAGCTCTTGGGCCTCCGCCCCTCCGTCAAGCGCCTCATGATGTACCAACAAGGGTGCT601TCGCCGGCGGGACGGTCCTCCGTTTGGCCAAGGACTTGGCCGAGAACAACAAGGGTGCAC661GTGTTCTTGTTGTGTGCTCTGAGATCACCGCAGTCACCTTCCGCGGGCCTAGTGACACCC721ACCTTGACAGTCTTGTGGGTCAAGCCTTGTTTGGTGACGGTGCAGCGGCCGTCATCATTG781GTTCGGATCCAGTGCCCGAAGTCGAGAAGCCCTTGTTTGAATTGGTGTCAGCAGCACAAA841CCATTCTTCCCGACAGTGATGGGGCTATTGACGGCCATCTCCGTGAAGTAGGGCTTACAT901TTCACCTTCrCAAGGACGTTCCCGGGCTTATTTCCAAGAATATCGAAAAGAGCCTTAACG961AGGCCTTCAAGCCTATAGGCATTTCAGACTGGAACTCGCTCTTCTGGATTGCACACCCAG1021GTGGCCCTGCTATTCTGGACCAAGTAGAGTCCAAGTTGGCCCTTAAGCCGGAGAAACTAG1081AAGCTACAAGGCAAGTGCTGTCTGATTACGGCAACATGTCGAGTGCGTGTGTCTTGTTTA1141TTTTGGACGAAGTGAGGAGGAAGTCTGCTGAGAAAGGACTCAAAACAACTGGAGAAGGAC1201TGGAGTGGGGCGTACTCTTCGGATTTGGGCCTGGCCTCACTGTTGAGACCGTTGTGCTTC1261ACAGTGTGGGTGCTTGATGACATGAAAATCGGTGTTGATTTATCTATCTG10CTTCGTTTAT1321GTATTGTTTCCGCCTTTTCTGGTTAGAATTTGGCTTTTGGGACATTGTGTGTGGGCGTCA1381TGGGGTTAACTTGGTGCAAGGAAGGACCCTTACTTTCATGTTGTTTACTGCAATATTGAT1441GAAAAAAGGGCCCTGATTGGGCAATGTACTGATGAGTAGAATATGGATTGACGAATAATA1501CTACTCTTTGATTTTCATGAAAAAAAAAAA序列二PRT蘋果屬王族海棠(Ma/W5ioya/O01MVTVEEVRKAQRAEGPATVLAIGTATPPNCVDQATYPDYYFRITNSEHKTELKEKFQRMC61DKSMIKTRYMYLTEEILKENPTVCEYMAPSLDARQDMVWEVPRLGKEAATKAIKEWGQP121KSKITHLVFCTTSGVDMPGADYQLTKLLGLRPSVKRLMMYQQGCFAGGTVLRLAKDLAEN181NKGARVLVVCSEITAVTFRGPSDTHLDSLVGQALFGDGAAAVIIGSDPVPEVEKPLFELV241SAAQTILPDSDGAIDGHLREVGLTFHLLKDVPGLIS腿EKSLNEAFKPIGISD麗SLFW301IAHPGGPAILDQVESKLALKPEKLEATRQVLSDYGNMSSACVLFILDEVRRKSAEKGUCT361TGEGLEWGVLFGFGPGLTVETVVLHSVGA序列三DNA人工序列CHS1:5，-CACTYgACATgTgCgTAATC-3，。序列四DNA人工序列CHS2:5，-gggCCYAgYgAYACCCAYCTTg-3，。序列五DNA人工序列3R和5F:Long(0.4nM):5'~CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCACGCAGAGT—3'Short(2nM):5'~CTAATACGACTCACTATAGGGC—3'序列六DNA人工序列3PFR1:5，-GGACATCTCCGTGAAGTAGGG-3，序列七DNA人工序列3PF2:5，-CAAgCCTATTgggATTTCgg-3'序列八DNA人工序列5PR1:5，-CGGGAAGAATGGTTTGTGCTGCT-3'序列九DNA人工序列5PR2:5，-GGCGGAAACAATACATAAACGAAGC-3，序列十DNA人工序列MCF:5'-GCGCTACTAGTAGGTGACCGTCGAAGAAGTTC-3'12序列十一DNA人工序列MCR:5，-GTATGGTACCTCAAGCACCCACACTGTG-3，權(quán)利要求1、一種蛋白，是如下1)或2)的蛋白質(zhì)1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；2)將序列表中序列2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物花色素苷形成相關(guān)的由1)衍生的蛋白質(zhì)。2、權(quán)利要求l所述蛋白的編碼基因。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的編碼基因，其特征在于所述蛋白的cDNA基因?yàn)槿缦耹)-4)中任一所述的基因1)其編碼序列是序列表中序列l(wèi)的自5'末端第l-1536位脫氧核糖核苷酸；2)其核苷酸序列是序列表中的序列l(wèi);3)在嚴(yán)格條件下可與序列表中序列1限定的DNA序列雜交且編碼權(quán)利要求1所述蛋白的DM分子；4)與l)的基因具有95%以上的同源性且編碼編碼權(quán)利要求1所述蛋白的DM分子。4、擴(kuò)增權(quán)利要求2或3所述基因的全長(zhǎng)或任一片段的引物對(duì)。全文摘要本發(fā)明公開了一種植物花色素苷形成關(guān)鍵酶的編碼基因。該蛋白，是如下1)或2)的蛋白質(zhì)1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；2)將序列表中序列2的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且能改變植物花色或葉色的由1)衍生的蛋白質(zhì)。文檔編號(hào)C12N15/52GK101580819SQ20081022558公開日2009年11月18日申請(qǐng)日期2008年11月6日優(yōu)先權(quán)日2008年11月6日發(fā)明者姚允聰,宋婷婷,沈紅香,佶田申請(qǐng)人:北京農(nóng)學(xué)院;姚允聰