專利名稱：金銀花查爾酮異構酶(LjCHI)基因及其編碼的蛋白和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術領域，主要涉及通過構建金銀花cDNA文庫技術獲得查爾酮異構酶基因及其編碼產(chǎn)物，屬于藥用植物基因工程領域。
背景技術：
藥用植物有效成分(次生代謝產(chǎn)物)的形成是植物次生代謝途徑中特有基因群的產(chǎn)物。隨著植物功能基因組研究的廣泛與深入，獨具特色又有廣闊應用前景的藥用植物次生代謝合成相關功能基因的研究逐漸成為研究的熱點，這些基因的克隆將為解析藥用植物有效成分的生物合成途徑及其調控機制和解釋藥材品質的形成提供理論基礎，同時為利用生物技術提高目標成分含量或直接生產(chǎn)有效成分或中間體帶來廣闊的應用空間。黃酮類化合物是植物中重要的次生代謝產(chǎn)物之一，且黃酮類成分也已被2010年藥典作為金銀花的質量控制標準。查爾酮異構酶(chalcone isomerase, CHI)是第1個被認識的黃酮類化合物合成相關酶，也是黃酮代謝途徑中的關鍵酶之一，它催化柚皮苷查爾酮異構化形成有生物活性的二羥基黃烷酮，對植物具有非常重要的生理意義。因此查爾酮異構酶(LjCHI)基因的獲得，為用基因工程手段提高金銀花有效部位的含量提供重要基礎。在本發(fā)明被公布之前，尚未有任何公開或報道過本專利申請中所提及的金銀花黃酮類酶基因及其氨基酸序列。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種金銀花查爾酮異構酶(LjCHI)基因。本發(fā)明第二個目的是提供該基因編碼的蛋白質。本發(fā)明還提供了含有該基因的重組載體和宿主細胞。本發(fā)明的另一個目的在于提供該基因的應用。本發(fā)明所提供的金銀花查爾酮異構酶(LjCHI)，為以下核苷酸序列之一(I)SEQ ID No. 1 的 DNA 序列；(2)在嚴格條件下與SEQ ID No. 1的DNA序列雜交且編碼具有金銀花查爾酮異構酶活性的蛋白質分子的DNA分子；(3)編碼SEQ ID No. 2所示氨基酸序列的核苷酸序列；(4)編碼對SEQ ID No. 2經(jīng)添加、取代、插入或缺失一個或多個氨基酸且具有金銀花查爾酮異構酶活性的蛋白質的核苷酸序列。本發(fā)明所提供的金銀花查爾酮異構酶(LjCHI)，其特征在于，是以下氨基酸序列之(1)具有SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列；(2) SEQ ID No. 2經(jīng)添加、取代、插入或缺失一個或多個氨基酸且具有金銀花查爾酮異構酶活性的序列。含有本發(fā)明的金銀花查爾酮異構酶(LjCHI)基因全序列或部分序列的重組載體，
3如原核類載體，真核類表達載體及RNAi載體均屬于本發(fā)明的保護范圍含有本發(fā)明的金銀花查爾酮異構酶(LjCHI)基因全序列或部分序列的宿主細胞， 如含有上述的重組載體的宿主細胞也屬于本發(fā)明的保護范圍。所述宿主細胞為有價值的活體材料。本發(fā)明的金銀花查爾酮異構酶(LjCHI)基因的應用，包括用所述的重組載體，如植物表達載體轉化植物細胞；或者用所述含有該基因的農(nóng)桿菌與植物細胞共培養(yǎng)，得到轉基因的植物發(fā)根系；或者用所述的發(fā)根細胞再生植株；或者用所述的金銀花查爾酮異構酶 (LJCHI)基因全序列或部分序列轉化獲得轉基因生物體。本發(fā)明技術方案中涉及的概念具體內(nèi)容如下所說的金銀花查爾酮異構酶(LjCHI)基因的DNA分子包括編碼具有金銀花查爾酮異構酶(LjCHI)活性的多肽的核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列與SEQ ID NO. 1 中從核苷酸第1-980位的核苷酸序列有至少70%的同源性；或者所述的核苷酸序列能在 40-55°C條件下與SEQ ID NO. 1中從核苷酸第1_980的核苷酸序列雜交。較佳地，所述的序列編碼具有SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列的多肽。更佳地，所述的序列具有SEQ ID NO. 1 中從核苷酸第1-980位的核苷酸序列。本發(fā)明分離出的金銀花查爾酮異構酶(LjCHI)基因多肽包括具有SEQ ID NO. 2氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。較佳地，該多肽是具有SEQ ID N0.2序列的多肽。本發(fā)明中的DNA分子包含所述的DNA分子中8-100個連續(xù)核苷酸。在本發(fā)明中，“分離的”、“純化的"DNA是指，該DNA 或片段已從天然狀態(tài)下位于其兩側的序列中分離出來，還指該DNA或片段已經(jīng)與天然狀態(tài)下伴隨核酸的組分分開，而且已經(jīng)與在細胞中伴隨其的蛋白質分開。本發(fā)明中術語“金銀花查爾酮異構酶(LjCHI)(或多肽)”基因指編碼具有金銀花查爾酮異構酶(LjCHI)活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO. 1中第1-980位核苷酸序列及其簡并序列。該簡并序列是指，位于SEQ ID NO. 1序列的編碼框第1-980位核苷酸中，有一個或多個密碼子被編碼相同氨基酸的簡并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由于密碼子的簡并性，所以與SEQ ID N0. 1，中第1-980位核苷酸序列同源性低至約70%的簡并序列也能編碼出SEQ ID N0. 2所述的序列。還包括能在中度嚴謹條件下，更佳的在高度嚴謹條件下與SEQ ID NO. 1中從核苷酸第1-980位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。還包括與 SEQ IDN0. 1中從核苷酸第1-980位的核苷酸序列的同源性至少70%，較佳地至少80%，更佳地至少90%，最佳地至少95%的核苷酸序列。還包括能編碼具有與天然的金銀花查爾酮異構酶(LjCHI)相同功能的蛋白的SEQ ID NO. 1中開放閱讀框序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為，1-90個，較佳地，1-60個，更佳地，1-20個，最佳地1-10個)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加數(shù)個(通常為60 個以內(nèi)，較佳地為30個以內(nèi)，更佳地為10個以內(nèi)，最佳地為5個以內(nèi))核苷酸。本發(fā)明中術語“金銀花查爾酮異構酶(LjCHI)蛋白或多肽”指具有金銀花查爾酮異構酶(LjCHI)活性的SEQ ID N0. 2序列的多肽。該術語還包括具有與天然金銀花查爾酮異構酶(LjCHI)相同功能的SEQ ID N0. 2序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個(通常為20個以內(nèi)，較佳地為10個以內(nèi)，更佳地為5個以內(nèi))氨基酸。例如，在本領域中，用性能相近或相似的氨
4基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個氨基酸通常也不會改變蛋白質的功能。該術語還包括金銀花查爾酮異構酶(LjCHI)的活性片段和活性衍生物，還包括能夠可操作地連于信號肽、啟動子或者核糖體結合位點序列所組成的衍生物。本發(fā)明的金銀花金銀花查爾酮異構酶(LjCHI)多肽的變異形式包括 同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導突變體、在高或低的嚴謹條件下能與金銀花查爾酮異構酶(LjCHI) DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用金銀花查爾酮異構酶(LjCHI)多肽的血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明中金銀花查爾酮異構酶(LjCHI)保守性變異多肽指與SEQ ID NQ. 2的氨基酸序列相比，有至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個氨基酸性質相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽可根據(jù)表1，進行替換而產(chǎn)生。本發(fā)明還包括金銀花查爾酮異構酶(LjCHI)或多肽的類似物。這些類似物與天然金銀花查爾酮異構酶(LjCHI)多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導的遺傳變異體。誘導變異體可以通過各種技術得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機誘變，還可通過定點誘變法或其他已知分子生物學的技術。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基 (如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、Y-氨基酸) 的類似物。應理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。所述修飾(通常不改變一級結構)形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學衍生形式如乙?；螋然?。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進一步加工步驟中進行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過將多肽露于進行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。在本發(fā)明中，可選用本領域已知的各種載體，如市售的載體，包括質粒，粘粒等。表1 保守性變異多肽中的取代殘基
權利要求
1.一種金銀花查爾酮異構酶(LjCHI)基因，其特征在于，它是下列核苷酸序列之一(1)SEQID No. 1 的 DNA 序列；(2)在嚴格條件下與SEQID No. 1的DNA序列雜交且編碼具有金銀花查爾酮異構酶活性的蛋白質分子的DNA分子；(3)編碼SEQID No. 2所示氨基酸序列的核苷酸序列；(4)編碼對SEQID No. 2經(jīng)添加、取代、插入或缺失一個或多個氨基酸且具有金銀花查爾酮異構酶活性的蛋白質的核苷酸序列。
2.一種金銀花查爾酮異構酶(LjCHI)，其特征在于，是以下氨基酸序列之一(1)具有SEQID No. 2所示的氨基酸序列；(2)SEQ ID No. 2經(jīng)添加、取代、插入或缺失一個或多個氨基酸且具有金銀花查爾酮異構酶活性的序列。
3.重組載體，其特征在于含有權利要求1所述的金銀花查爾酮異構酶(LjCHI)基因全序列或部分序列。
4.宿主細胞，其特征在于其含有權利要求1所述的金銀花查爾酮異構酶(LjCHI)基因全序列或部分序列。
5.要求1所述的基因和權力要求2所述的氨基酸序列在金銀花育種中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種查爾酮異構酶基因及其編碼的蛋白酶與用途，該基因為首次從金銀花的cDNA文庫中得到，填補了我國傳統(tǒng)中藥材金銀花中分離克隆出查爾酮異構酶基因的空白。本發(fā)明所提供的查爾酮異構酶基因具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列或者添加、取代、插入或缺失一個或多個核苷酸的同源序列或其等位基因及其衍生的核苷酸序列。所述基因編碼的蛋白質具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列或者添加、取代、插入或缺失一個或多個氨基酸的同源序列。本發(fā)明提供的查爾酮異構酶基因可以通過生物技術提高金銀花中黃酮類活性成分金銀花黃酮類的含量，有助于金銀花藥材的品質改良，同時可以進行品種選育，具有很好的應用前景。
文檔編號C12N1/19GK102465136SQ201010533198
公開日2012年5月23日 申請日期2010年11月5日 優(yōu)先權日2010年11月5日
發(fā)明者秦雙雙, 袁媛, 黃璐琦 申請人:中國中醫(yī)科學院中藥研究所