紅花查爾酮異構(gòu)酶chi基因及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了紅花查爾酮異構(gòu)酶CHI基因，是以紅花花瓣的RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，進(jìn)行3’、5’race克隆，分別得到紅花CHI基因的3’、5’端序列，通過拼接得到紅花CHI序列，全長基因?yàn)?161bp，開放閱讀框長度為654bp，命名為ct-CHI，將其在ncbi上進(jìn)行序列比對分析，發(fā)現(xiàn)該基因與青木香CHI基因的同源性達(dá)到82%，經(jīng)實(shí)驗(yàn)表明，超表達(dá)ct-CHI基因能夠促進(jìn)黃酮的合成，ct-CHI基因被抑制后能夠降低黃酮含量，在培育高含量黃酮化合物轉(zhuǎn)基因植物方面具有廣闊的前景。
【專利說明】紅花查爾酮異構(gòu)酶CHI基因及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及紅花查爾酮異構(gòu)酶CHI基因及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]^LHCarthamus tinctorius L.)為一年生草本植物，屬菊科植物的干燥管狀花。紅花具有活血通經(jīng)，去瘀療傷，宣毒透疹等功效，其主要有效成分為紅花黃色素和紅花紅色素。紅花黃色素為紅花中多種水溶性查爾酮成分的混合物，不但是很有價(jià)值的食用色素，而且具有活血通絡(luò)、消炎鎮(zhèn)痛等功效，在血管性疾病、高血壓、糖尿病并發(fā)癥等發(fā)面亦有重要作用。查爾酮異構(gòu)酶(Chalcone isomerase，CHI ;EC5.5.1.6)是植物黃酮化合物合成途徑中的關(guān)鍵酶之一，在黃酮化合物合成中將查爾酮異構(gòu)化產(chǎn)生槲皮素。目前，國內(nèi)外關(guān)于查爾酮異構(gòu)酶的研究報(bào)道較多，主要集中在葫蘆巴、青木香屬、苜蓿、水稻、柑橘、桑樹、金茶花、水仙、花生等多種作物中。但在紅花中關(guān)于查爾酮異構(gòu)酶基因的克隆及表達(dá)分析還未見報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是為提高植物中黃酮化合物含量，提供一種紅花查爾酮異構(gòu)酶CHI基因。
[0004]紅花查爾酮異構(gòu)酶CHI基因，其堿基序列如序列表SEQ ID N0.1或2所示； 一種表達(dá)載體，它插入了包括序列表SEQ ID N0.2所示基因；
所述的表達(dá)載體，為pCAMBIA1304-bar，它是用bar基因序列替換了 pCAMBIA1304中的
潮霉素抗性基因的。
[0005]紅花查爾酮異構(gòu)酶CHI基因在培育高含量黃酮化合物轉(zhuǎn)基因植物的應(yīng)用。
[0006]本發(fā)明提供了紅花查爾酮異構(gòu)酶CHI基因，是以紅花花瓣的RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，進(jìn)行3’、5’ race克隆，分別得到紅花CHI基因的3’、5’端序列，通過拼接得到紅花CHI序列，全長基因?yàn)?161bp，開放閱讀框長度為654bp，命名為ct-βΥ/，將其在ncbi上進(jìn)行序列比對分析，發(fā)現(xiàn)該基因與青木香CHI基因的同源性達(dá)到82%，經(jīng)實(shí)驗(yàn)表明，超表達(dá)Ct-GYJ基因能夠促進(jìn)黃酮的合成，ct-βΥ/基因被抑制后能夠降低黃酮含量，在培育高含量黃酮化合物轉(zhuǎn)基因植物方面具有廣闊的前景。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0007]圖1為紅花花瓣RNA提取電泳結(jié)果圖；
圖2為CHI基因中間片段驗(yàn)證電泳圖，其中，A = RT-PCR結(jié)果；B:菌液PCR ;C:酶切圖譜；圖3為CHI基因中間片段驗(yàn)證電泳圖，其中，A:CHI基因3’端PCR產(chǎn)物，B:CHI基因5’端PCR產(chǎn)物，C =CHI基因全長驗(yàn)證電泳圖；
圖4為紅花CHI基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建圖； 圖5為紅花CHI基因菌液PCR鑒定；圖6為紅花CHI基因酶切鑒定圖；
圖7為超表達(dá)ct-βΥ/基因的轉(zhuǎn)基因植株的黃酮含量對比；
圖8為RNAi干擾表達(dá)ct-βΥ/基因的轉(zhuǎn)基因植株的黃酮含量對比。
【具體實(shí)施方式】
[0008]實(shí)施例1紅花花瓣RNA提取
將紅花“塔城紅花”(購買于新疆塔城)種子播在裝好砂的營養(yǎng)缽中，放在智能人工氣候室中適當(dāng)?shù)臈l件下培養(yǎng)，采集紅花花瓣。
[0009]I)鑷子、研缽、研棒和藥匙用錫箔紙包好，放在180°C烘箱里干熱滅菌4h，備用；
2)1.5mL離心管、移液器吸頭用0.1% DEPC水處理過夜，然后120°C高壓滅菌20min，放置到60°C烘箱中干燥，備用；
3)取紅花花瓣約lOOmg，加入液氮迅速研磨至細(xì)粉，分裝到兩個1.5mLEP管中，各加入ImL RNAiso Plus后混合均勻，室溫靜置5min ；
4)4°C，12000rpm離心5min,取上清液轉(zhuǎn)移到新的1.5mL離心管中；
5)加入1/5RNAiso Plus體積量的氯仿，振蕩，混勻，室溫靜置5min ;
6)4°C, 12000rpm離心15min,取上清液轉(zhuǎn)移到新的1.5mL離心管中；
7)加入與上清液等體積的異`丙醇，室溫靜置IOmin,4°C, 12000rpm離心IOmin ；
8)棄上清取沉淀，向沉淀中加入ImL75%乙醇清洗沉淀,4°C, 12000rpm離心5min,此步驟重復(fù)一次；
9)棄上清保留沉淀，室溫晾干；
10)RNA-Free水回溶RNA，提取的RNA保存于_80°C備用。
[0010]11)紅花總RNA樣品濃度用NanoDrop2000超微量分光光度計(jì)(購自Thermo公司)測定。
[0011]12)用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA純度，電泳結(jié)束后用核酸染料染色，在紫外凝膠成像系統(tǒng)上拍照，紅花花瓣總RNA提取見圖1，由圖1可以看到28S和18S清晰的兩條帶，且28S條帶的亮度約為18S的2倍。說明RNA提取完整，無降解，可以滿足后續(xù)試驗(yàn)需要。
[0012]實(shí)施例2第一條鏈cDNA的合成
取_80°C保存的RNA，通過nanogrop檢測RNA的濃度，提取的RNA濃度均在1000ng/ul左右。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒的操作說明進(jìn)行cDNA的反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系見表1和表2，反轉(zhuǎn)錄后的cDNA保存于_20°C冰箱中備用。
【權(quán)利要求】
1.紅花查爾酮異構(gòu)酶CHI基因，其堿基序列如序列表SEQID N0.1或2所示。
2.一種表達(dá)載體，它插入了包括序列表SEQ ID N0.2所示的基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種表達(dá)載體為pCAMBIAl304-bar，它是用bar基因序列替換了 pCAMBIA1304中的潮霉素抗性基因的表達(dá)載體。
4.權(quán)利要求1所述的紅花查爾酮異構(gòu)酶CHI基因在培育高含量黃酮化合物轉(zhuǎn)基因植物的應(yīng)用。`
【文檔編號】C12N15/84GK103820478SQ201410045521
【公開日】2014年5月28日 申請日期:2014年2月8日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月8日
【發(fā)明者】劉秀明, 李海燕, 李校堃, 楊文婷, 姚娜 申請人:吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)