一種重組鹵醇脫鹵酶、突變體、工程菌及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種鹵醇脫鹵酶、其基因及突變體，含有該基因及突變體的重組表達(dá) 載體及重組菌，利用重組菌制備重組酶的方法，以及該重組鹵醇脫鹵酶制備環(huán)氧化物、手性 環(huán)氧化物、0 -取代醇的方法。 (二）
【背景技術(shù)】
[0002] 鹵醇脫鹵酶，也叫鹵醇-鹵化氫裂解酶，通過分子內(nèi)親核取代機(jī)制催化芳香族或 者脂肪族鄰鹵醇轉(zhuǎn)化為環(huán)氧化物和鹵化氫。鹵醇脫鹵酶不但可以催化碳-鹵鍵的斷裂進(jìn) 行脫鹵反應(yīng)，也可以高選擇性地催化接受除了鹵離子以外的一系列非自然親核試劑，如N3' N02'Cf等所介導(dǎo)的環(huán)氧化物開環(huán)反應(yīng)。鹵醇脫鹵酶主要通過蛋白結(jié)構(gòu)中保守的絲氨酸與 底物羥基氧原子之間形成氫鍵，穩(wěn)定與底物結(jié)合，通過精氨酸降低酪氨酸的pKa值，酪氨酸 從底物上的氧原子作為親核試劑，進(jìn)攻鄰位鹵素取代的碳原子，進(jìn)而釋放鹵離子，形成環(huán)氧 化物。鹵醇脫鹵酶介導(dǎo)的生物催化反應(yīng)，優(yōu)勢(shì)主要體現(xiàn)在：1.酶催化反應(yīng)條件溫和；2.酶催 化手性選擇高。3.酶催化轉(zhuǎn)化率高
[0003] 鹵醇脫鹵酶可以廣泛應(yīng)用于合成環(huán)氧化物以及取代醇。其中疊氮化醇、氰取 代醇以及硝基醇是合成氨基醇的前體；手性氨基醇在生物制藥領(lǐng)域是一類很重要的化合 物，可用來合成多種生物活性物質(zhì)。異硫氰酸取代醇和噁唑烷酮在農(nóng)用化學(xué)試劑、醫(yī)藥和 高分子化學(xué)領(lǐng)域中有著廣泛應(yīng)用。鹵醇脫鹵酶更已成功應(yīng)用于他汀類藥物關(guān)鍵手性中間體 (R) -4-氰基-3-羥基丁酸乙酯的合成。
[0004] 手性環(huán)氧氯丙烷在醫(yī)藥、農(nóng)藥、化工、材料等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。隨著手性藥物行業(yè)的 發(fā)展，使得手性環(huán)氧氯丙烷作為一種重要醫(yī)藥中間體的地位更加突出。目前，合成手性環(huán)氧 氯丙烷主要有化學(xué)法和生物法拆分兩大類。生物法拆分法具有反應(yīng)條件溫和、環(huán)境友好的 優(yōu)點(diǎn)。但是生物拆分法獲得的手性環(huán)氧氯丙烷的最高收率只有50%。利用鹵醇脫鹵酶直 接不對(duì)稱脫鹵合成手性環(huán)氧氯丙烷，其理論收率可以達(dá)到100%，原子經(jīng)濟(jì)效益高，具有潛 在的工業(yè)應(yīng)用前景。但是利用鹵醇脫鹵酶直接不對(duì)稱脫鹵合成手性環(huán)氧氯丙烷的文獻(xiàn)較 少。Tetsuji等利用來源于Corynebacteriumsp.N-1074 中的HheB催化 5mM1，3_ 二氯丙 醇生成（R)_環(huán)氧氯丙烷。反應(yīng)初始階段（R)_環(huán)氧氯丙烷的ee值最大可達(dá)90%，但隨著 反應(yīng)的進(jìn)行，ee值慢慢下降直至最終為零。LutjeSpelberg等利用來源于Agrobacterium radiobacterAD1的鹵醇脫鹵酶HheC催化1,3-二氯丙醇或2,3-二氯-1-丙醇合成環(huán)氧 氯丙烷，其ee值小于5%。本課題組也從運(yùn)動(dòng)替斯崔納菌中克隆得到了新的鹵醇脫鹵酶，催 化1，3-DCP不對(duì)稱脫鹵合成（S)-環(huán)氧氯丙烷，但是ee值最高只有60 %，而且隨著反應(yīng)的進(jìn) 行，ee值同樣在下降（CN104263713A) 〇
[0005] 近年來，已從多種微生物中發(fā)現(xiàn)了鹵醇脫鹵酶，部分鹵醇脫鹵酶的基因已被克隆 并在大腸桿菌中表達(dá)，獲得產(chǎn)酶活力較高的基因工程菌，并應(yīng)用于催化合成環(huán)氧化物及 0-取代醇。目前已知的鹵醇脫鹵酶，僅有8種已成功在大腸桿菌中表達(dá)，并進(jìn)行了催化特 性的研宄。但是目前發(fā)現(xiàn)的鹵醇脫鹵酶，催化特性優(yōu)異的鹵醇脫鹵酶不易獲得，使得大多數(shù) 不對(duì)稱脫鹵反應(yīng)，收率低，產(chǎn)物ee值低，無法真正應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)。因此，開發(fā)新型且具有 應(yīng)用潛力的鹵醇脫鹵酶一直是生物脫鹵和生物開環(huán)的重點(diǎn)研宄方向之一。隨著DNA測(cè)序技 術(shù)的進(jìn)步，急劇增加的生物信息為新酶的開發(fā)帶來了前所未有的機(jī)遇，近年來基因數(shù)據(jù)挖 掘技術(shù)已成為快速開發(fā)新酶的有力手段。利用已獲得的鹵醇脫鹵酶序列作為探針，在整個(gè) 基因數(shù)據(jù)庫(kù)中挖掘同源序列，獲得候選酶基因，利用蛋白質(zhì)工程手段可以進(jìn)一步改造所獲 得的天然酶，從而得到具有所需催化特性的突變酶。通過隨機(jī)突變、定點(diǎn)突變等蛋白質(zhì)工程 的手段對(duì)鹵醇脫鹵酶進(jìn)行立體選擇性的改造，提高其對(duì)應(yīng)選擇性，將具有較高的應(yīng)用價(jià)值。 (三）
【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明所要解決的問題是，針對(duì)之前報(bào)道的鹵醇脫鹵酶催化1，3-二氯丙醇不對(duì) 稱脫鹵合成手性環(huán)氧氯丙烷ee值偏低的問題，提供一種鹵醇脫鹵酶及其編碼基因、鹵醇脫 鹵酶突變體及其編碼基因，含有所述編碼基因的重組表達(dá)載體和重組工程菌，以及將該鹵 醇脫鹵酶、突變體、表達(dá)該鹵醇脫鹵酶或突變體的重組工程菌作為催化劑催化1，3-二氯丙 醇，制備光學(xué)純（S)_環(huán)氧氯丙烷。本發(fā)明同時(shí)還提供了該重組鹵醇脫鹵酶和突變體在催化 其它鹵代醇生物脫鹵或不對(duì)稱拆分環(huán)氧化物合成手性環(huán)氧化物和0 _取代醇中的應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：
[0008] 本發(fā)明提供一種來源于Sneathiella glossodoripedis的重組齒醇脫齒酶，所述 重組鹵醇脫鹵酶的氨基酸序列如SEQIDNo. 2所示，所述重組鹵醇脫鹵酶的編碼基因的核 苷酸序列為SEQIDNo.1所示。
[0009] 本發(fā)明的鹵醇脫鹵酶基因具體制備方法為：以來源于運(yùn)動(dòng)替斯崔納菌（Tistrella mobilisZJB1405，CN104263713A)的鹵醇脫鹵酶作為探針，在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)搜索同源 氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)該序列與Genbank中收錄的預(yù)測(cè)為Sneathiellaglossodoripedis hypotheticalprotein(GenbankNo.WP_037493663)的同源性為 42%，通過序列比對(duì)發(fā)現(xiàn) 該hypotheticalprotein具有與鹵醇脫鹵酶相同的催化三聯(lián)體和一些關(guān)鍵的保守序列，推 測(cè)該水解蛋白為疑似鹵醇脫鹵酶。因NCBI未公布該hypotheticalprotein的基因序列， 根據(jù)其氨基酸序列，以及在大腸桿菌異源表達(dá)的密碼子偏好性，設(shè)計(jì)合成基因，交送上海旭 冠生物科技發(fā)展有限公司合成。堿基序列如SEQIDNo. 1所示的基因，命名為HHDHSg，全長(zhǎng) 732bp，氨基酸編碼序列從第1個(gè)堿基至第729個(gè)堿基止，起始密碼子為ATG，終止密碼子為 TAA，其編碼的氨基酸序列如SEQIDNo. 2所示。
[0010] 本發(fā)明涉及一種所述重組鹵醇脫鹵酶編碼基因構(gòu)建的重組載體。其可通過本領(lǐng) 域常規(guī)方法將本發(fā)明的重組鹵醇脫鹵酶基因連接于各種表達(dá)載體上構(gòu)建而成。所述的載 體可為本領(lǐng)域常規(guī)的各種載體，如市售的質(zhì)粒、粘粒、噬菌體或病毒載體等，優(yōu)選質(zhì)粒為 pET28a(b)。較佳的，可通過下述方法制得本發(fā)明的重組表達(dá)載體：設(shè)計(jì)合成基因并在兩端 引入XbaI和XhoI酶切位點(diǎn)，交由上海旭冠生物技術(shù)有限公司合成，之后將合成基因與表 達(dá)載體pET28b用限制性內(nèi)切酶XbaI和XhoI雙酶切，形成互補(bǔ)的粘性末端，再經(jīng)T4DNA 連接酶連接，形成含有本發(fā)明的鹵醇脫鹵酶基因的重組表達(dá)載體pET28b-HHDHSg。
[0011] 本發(fā)明涉及一種所述重組載體構(gòu)建的重組基因工程菌。其可通過將本發(fā)明的重組 表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至宿主微生物中制得。所述的宿主微生物可為本領(lǐng)域常規(guī)的各種宿主微生 物，只要能滿足重組表達(dá)載體可穩(wěn)定的自行復(fù)制，且所攜帶的本發(fā)明的重組鹵醇脫鹵酶基 因可被有效表達(dá)即可。本發(fā)明優(yōu)選大腸桿菌，更優(yōu)選大腸埃希菌（E.coli)BL21(DE3)。將前 述重組表達(dá)質(zhì)粒pET28b-HHDHTm轉(zhuǎn)化至（E.coli)BL21(DE3)中，即可得本發(fā)明優(yōu)選的基因工 程菌株，即E.coliBL21 (DE3)/pET28b-HHDHSg。
[0012] 本發(fā)明還涉及重組鹵醇脫鹵酶的制備方法，其中包括如下步驟：將所述含重組鹵 醇脫鹵酶基因的重組載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中，獲得的重組基因工程菌進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，培養(yǎng) 液分離得到含有重組鹵醇脫鹵酶的菌體細(xì)胞。培養(yǎng)本發(fā)明的重組工程菌，獲得重組表達(dá)鹵 醇脫齒酶，所述的培養(yǎng)重組工程菌所用的培養(yǎng)基可為本領(lǐng)域任何可使重組工程菌生長(zhǎng)并產(chǎn) 生本發(fā)明的鹵醇脫鹵酶的培養(yǎng)基，優(yōu)選LB培養(yǎng)基：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl10g/L， 溶劑為去離子水，pH7.0。培養(yǎng)方法和培養(yǎng)條件沒有特殊的限制，可以根據(jù)宿主類型和培養(yǎng) 方法等因素的不同按本領(lǐng)域普通知識(shí)進(jìn)行適當(dāng)?shù)倪x擇，只要使重組工程菌能夠生長(zhǎng)并產(chǎn)生 本發(fā)明所述的鹵醇脫鹵酶即可。其他培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體具體操作均可按本領(lǐng)域常規(guī)操作進(jìn)行，優(yōu) 選下述方法：將本發(fā)明涉及的重組大腸桿菌重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體接種至含有終濃度50mg/L卡 那霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)液的光密度0D_達(dá)到0. 8時(shí)，在終濃度為0. 2mM的異丙 基-0-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG)的誘導(dǎo)下，高效表達(dá)本發(fā)明的重組鹵醇脫鹵酶。
[0013] 本發(fā)明還涉及一種所述重組鹵醇脫鹵酶在催化鹵代醇制備手性環(huán)氧化物中的應(yīng) 用，所述的應(yīng)用為：以含重組鹵醇脫鹵酶基因的工程菌經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)獲得的濕菌體為催化劑， 以鹵代醇為底物，在pH值為7~11(優(yōu)選8-10)的緩沖液中，于10-50°C(優(yōu)選20-40°C， 更優(yōu)選35°C)、150r/min條件下反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液分離純化，獲得手性環(huán)氧化物； 所述鹵代醇為1，3-二氯丙醇、1，3-二溴丙醇、2-氯-1-苯乙醇或2, 3-二溴丙醇，所述濕菌 體的用量為1~50g/L緩