一種環(huán)氧化物水解酶突變體、工程菌及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種環(huán)氧化物水解酶突變體及其編碼基 因，含有所述環(huán)氧化物水解酶突變體基因的重組表達載體和重組工程菌，其重組酶和該重 組酶的制備方法，以及該環(huán)氧化物水解酶在對映選擇性水解拆分外消旋環(huán)氧氯丙烷制備高 光學(xué)活性的（S)-環(huán)氧氯丙烷中的應(yīng)用。 (二）
【背景技術(shù)】
[0002] 環(huán)氧化物水解酶（EC 3. 3. 2. 3)是一組功能相似的酶系，能夠立體選擇性催化環(huán) 氧化合物生成光學(xué)活性的環(huán)氧化物和相應(yīng)鄰位二醇。作為一種水解酶它具有一般水解酶的 特點如：1.反應(yīng)不需要添加輔助因子。2.具有廣泛的來源。3.在非水介質(zhì)中仍能保留一定 的活性。4.反應(yīng)條件溫和，無污染，符合"綠色化學(xué)"趨勢。5.這些反應(yīng)常常顯示出化學(xué)、 區(qū)域和立體對映選擇性，能夠?qū)ν愋蛷V泛的底物進行作用。
[0003]環(huán)氧化物水解酶廣泛存在于自然界中，在哺乳動物、昆蟲、微生物和植物中均有發(fā) 現(xiàn)。哺乳動物環(huán)氧化物水解酶參與了體內(nèi)有害異體物質(zhì)的代謝，并有調(diào)控血壓等功能；植物 環(huán)氧化物水解酶能參與角質(zhì)以及抗菌物質(zhì)的合成；昆蟲環(huán)氧化物水解酶具有分解代謝昆蟲 發(fā)育過程中重要的化合中間體保幼激素以及代謝植物釋放的化學(xué)預(yù)防化合物的重要功能； 而微生物是環(huán)氧化物水解酶的重要的來源。由于微生物種類的多樣性、生長速度快、易于培 養(yǎng)和產(chǎn)量高等優(yōu)點，從微生物中篩選獲得環(huán)氧化物水解酶是目前主要的途徑。近年，已從多 種微生物中發(fā)現(xiàn)了環(huán)氧化物水解酶，如Rhodococcus equi，Rhodococcus ruber，Mycoplana rubra，Bacillus megaterium，Diplodia gossipina，Streptomyces striana, Rhodotorula glutinis，Bacillus subtilis，Sphingomonas echinoides，Rhodotorula araucariae， Rhodosporidium toruloides，Agrobacterium radiobacter，Mycobacter tuberculosis， Aspergillus niger，Caulobacter crescentus，Trichosporon loubierii，Sphingomonas sp? Novosphingobium aromaticivorans? Saccharomyces cerevisiae等。其中部分環(huán)氧化 物水解酶的基因已被克隆并在不同的宿主（大腸桿菌、畢赤酵母、耶氏酵母等）中表達，獲 得產(chǎn)酶活力較高的基因工程菌，并應(yīng)用于不對稱拆分外消旋環(huán)氧化物。
[0004]手性環(huán)氧氯丙烷在醫(yī)藥、農(nóng)藥、化工、材料等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。隨著手性藥物行業(yè)的 發(fā)展，使得手性環(huán)氧氯丙烷作為一種重要醫(yī)藥中間體的地位更加突出。目前，合成手性環(huán)氧 氯丙烷主要有化學(xué)法和生物法拆分兩大類。生物法拆分法具有反應(yīng)條件溫和、環(huán)境友好的 優(yōu)點。（S)-ECH的生物合成方法主要有環(huán)氧化物水解酶的對映選擇性拆分方法。Woo等人 利用大腸桿菌表達了Novosphingobium aromaticivorans EH，將它應(yīng)用于250mM環(huán)氧氯丙 烷的拆分，獲得了99% ee和17. 3%收率的（S)-ECH。金火喜等人分離得到的Aspergillus niger菌株可用于催化拆分64mM外消旋環(huán)氧氯丙烷，獲得98 % ee和17. 5 %收率的（S)-環(huán) 氧氯丙烷。單取代型環(huán)氧化物特別是環(huán)氧氯丙烷，由于其空間位阻極小，給手性識別帶來困 難，是現(xiàn)代環(huán)氧化物水解酶研宄領(lǐng)域的一個難點。由于環(huán)氧氯丙烷的底物，目前已發(fā)現(xiàn)的環(huán) 氧化物水解酶對其活性和選擇性都很低。
[0005] 從壤霉菌（Agromycesmediolanus)CCTCCM2012299克隆得到的環(huán)氧化物水解酶 An￡H可催化多種環(huán)氧化物對映選擇性水解拆分制備高光學(xué)活性的手性環(huán)氧化物，該酶已經(jīng) 在大腸桿菌（Escherichiacoli)中重組過量表達（ProcessBiochem2014,49:409-417 ; CN102978220A)。該酶能夠優(yōu)先催化（R)-ECH底物水解。但該重組酶對底物的對映選擇性 并不高，從而限制了它在高附加值藥物前體的手性合成中的應(yīng)用潛力。通過已報道的環(huán)氧 化物水解酶晶體結(jié)構(gòu)，利用分子模擬手段，確定該酶的空間結(jié)構(gòu)和可能的預(yù)催化選擇性和 活性相關(guān)的氨基酸，通過定點突變技術(shù)提高環(huán)氧化物水解酶對外消旋環(huán)氧氯丙烷的催化活 性和選擇性，將具有較強的工業(yè)應(yīng)用價值。 (三）
【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，針對之前報道的環(huán)氧化物水解酶對環(huán)氧氯丙烷的 催化選擇性和活性，特別是催化選擇性較低的問題，提供一種環(huán)氧化物水解酶突變體蛋白 質(zhì)及其編碼基因，含有該基因的重組表達載體和重組工程菌，將該環(huán)氧化物水解酶突變體 蛋白質(zhì)或表達該環(huán)氧化物水解酶突變體蛋白質(zhì)的重組工程菌作為催化劑催化外消旋環(huán)氧 氯丙烷進行水解拆分反應(yīng)，制備光學(xué)純（S)_環(huán)氧氯丙烷。與野生型環(huán)氧化物水解酶相比， 本發(fā)明提供的環(huán)氧化物水解酶突變體蛋白質(zhì)具有更高的催化底物選擇性和活性。
[0007] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：
[0008] 本發(fā)明提供一種環(huán)氧化物水解酶突變體，所述環(huán)氧化物水解酶突變體是將SEQID NO. 13所示氨基酸序列的第182位、第207位和/或第240位進行單位點突變或多位點突變 獲得的；所述單位點突變是將第182位的色氨酸突變?yōu)楸奖彼?、?07位絲氨酸突變?yōu)槔i 氨酸或第240位的天冬酰胺突變?yōu)樘於彼?，具體優(yōu)選為下列之一：
[0009] (1)將SEQIDN0. 13所示氨基酸序列的第182位的色氨酸突變?yōu)楸奖彼?，氨?酸序列為SEQIDNO. 1所示，核苷酸序列為SEQIDN0. 7所示；
[0010] (2)將SEQIDNO. 13所示氨基酸序列的第207位的絲氨酸突變?yōu)槔i氨酸，氨基酸 序列為SEQIDN0. 2所示，核苷酸序列為SEQIDN0. 8所示；
[0011] (3)將SEQIDNO. 13所示氨基酸序列的第240位的天冬酰胺突變?yōu)樘於彼?，?基酸序列為SEQIDN0. 3所示，核苷酸序列為SEQIDN0. 9所示；
[0012] (4)將SEQIDNO. 13所示氨基酸序列的第182位的色氨酸突變?yōu)楸奖彼?，?第207位的絲氨酸突變?yōu)槔i氨酸，氨基酸序列為SEQIDN0. 4所示，核苷酸序列為SEQID NO. 10所示；
[0013] (5)將SEQIDNO. 13所示氨基酸序列的第207位的絲氨酸突變?yōu)槔i氨酸，且第 240位的天冬酰胺突變?yōu)樘於彼?，氨基酸序列為SEQIDN0. 5所示，核苷酸序列為SEQID NO. 11所示；
[0014] (6)將SEQIDNO. 13所示氨基酸序列的第182位的色氨酸突變?yōu)楸奖彼幔?07 位的絲氨酸突變?yōu)槔i氨酸，同時第240位的天冬酰胺突變?yōu)樘於彼?，氨基酸序列為SEQID NO. 6所示，核苷酸序列為SEQIDNO. 12所示?
[0015] 本發(fā)明使用定點飽和突變技術(shù)對環(huán)氧化物水解酶AmEH編碼基因進行突變，連接 表達載體后轉(zhuǎn)化宿主大腸桿菌，誘導(dǎo)表達后再通過高通量篩選方法和氣相手性檢測方法 將正突變檢出，然后利用定點突變方法，疊加有益突變點，得到對映選性進一步提高的突變 體。獲得的突變體能催化（lmM~800mM)外消旋環(huán)氧氯丙烷拆分，制備高光學(xué)純和收率的 (S)-環(huán)氧氯丙烷。
[0016]具體方法如下：來源于AgromycesmediolanusCCTCCM2012299 (CN102978220A) 的環(huán)氧化物水解酶（GenBankno.JX467176)由288氨基酸殘基組成，已成功構(gòu)建表達載體 pET28_AmEH，功能正常的酶蛋白在大腸桿菌BL21(DE3)中實現(xiàn)過量表達（ProcessBiochem 2014, 49:409-417 ;)。然后經(jīng)過同源建模和分子對接，根據(jù)最優(yōu)構(gòu)象選擇潛在的可能影響酶 活性或選擇性的位點；或者對建模獲得的模型進行HotSpotWizard分析，識別其中的功能 性氨基酸。設(shè)定定點飽和突變的位點，再設(shè)計并合成適當(dāng)?shù)囊?，以所述的含親本環(huán)氧化物 水解酶基因的載體質(zhì)粒為模板，PCR擴增全長突變基因的質(zhì)粒。通過將該含有全長突變的 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，經(jīng)培養(yǎng)、誘導(dǎo)表達、篩選出具有高對映選擇性環(huán)氧化物水解酶 的陽性突變子。最后從陽性突變子中抽提出質(zhì)粒DNA，進行DNA測序分析，以確定引物的突 變。在本發(fā)明環(huán)氧化物水解酶的突變體的制備中，可以采用任何適當(dāng)?shù)妮d體。
[0017] 本發(fā)明還提供一種所述環(huán)氧化物水解酶突變體的編碼基因，具體的，所述基因為 5￡〇10吣.7-5￡〇10吣.12所示核苷酸序列：5￡〇10勵.7(編碼5￡〇10吣.1所示突變 體），SEQIDN0. 8 (編碼SEQIDNo. 2 所示突變體），SEQIDN0. 9 (編碼SEQIDNo. 3 所 示突變體），SEQIDNO. 10 (編碼SEQIDNo. 4 所示突變體），SEQIDNO. 11 (編碼SEQID No. 5所示突變體），SEQIDNO. 12 (編碼SEQIDNo. 6所示突變體）。
[0018] 本發(fā)明還涉及一種含環(huán)氧化物水解酶突變體編碼基因的重組質(zhì)粒，所述重組質(zhì)粒 含有上述任一環(huán)氧化物水解酶突變體的編碼基因序列。
[0019] 本發(fā)明提供一種由所述重組質(zhì)粒構(gòu)建的重組基因工程