專利名稱：一種環(huán)氧化物水解酶基因(eh-b)原核表達及手性環(huán)氧氯丙烷的制備的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及來源于宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)EOOl菌株的一種新型B型環(huán)氧化物水解酶(Aus EH-B)基因成熟肽cDNA序列的克隆及原核表達，利用生物手性拆分制備手性環(huán)氧苯乙烯的方法，屬于生物工程技術領域。
背景技術：
手性化合物是重要的手性配體，廣泛用于各類不對稱反應中，特別是在藥物合成領域的應用更為廣泛。手性環(huán)氧氯丙烷是一種重要的有機合成關鍵中間體，用以制備多種高光學純度藥物中間體和天然產(chǎn)物，如芳氧丙醇胺類藥物、環(huán)戊酮的衍生物、抗真菌藥(S)-霉康靈、阿伐他汀、L-肉堿等。目前，外消旋的環(huán)氧氯丙烷價廉易得，而手性環(huán)氧氯丙烷的價格昂貴，后者的報價基本在前者6倍以上，因此通過拆分外消旋環(huán)氧氯丙烷制備其手性單體具有很大的工業(yè)化應用前景。其拆分剮產(chǎn)物3-氯-1，2-丙二也是一種重要的手性合成原料。拆分外消旋環(huán)氧氯丙烷的方法可分為化學法和生物法兩類化學法通常使用昂貴的S Ien-Co催化劑，可獲得ee達到99%的(S)-環(huán)氧氯丙烷收率可達30%，其缺點是成本高而且環(huán)境污染嚴重。
環(huán)氧化物水解酶(^Epoxide hydrolase, EC, 3.3.2·-)又稱環(huán)氧化物水合酶或環(huán)氧水化酶，是一類催化水分子立體選擇性的加成環(huán)氧化物水解為相應1，2- 二醇的水解酶類。 在化學法和生物法制備手性純環(huán)氧化物的方法中，酶動力學拆分法由于其高的對映體選擇一直受成為廣大研究者的重視。該酶廣泛存在于植物、昆蟲、哺乳動物及微生物體內。環(huán)氧化物水解酶是一種不依賴輔因子的酶，其來源廣泛，底物譜寬廣，對映體選擇性高，具有很高的工業(yè)化應用前景，對其研究已成為當前研究的熱點。
環(huán)氧化物水解酶微生物來源廣泛，但具有良好手性拆分作用的環(huán)氧化物水解酶較少，Botes等以1，2-環(huán)氧辛烷為底物從187個菌株中篩選出25個不同屬的酵母具有環(huán)氧化合物水解酶活性的菌株，Yeates等以硝基環(huán)氧苯乙烯為底物從409個菌株中篩選出45 個不同屬的酵母具有水解底物活性，但只有3個擔子菌屬菌株酵母的環(huán)氧化合物水解酶選擇性較高，即毛孢子菌屬(Trichosporon)、紅冬孢子屬(Rhodosporidium)和紅酵母屬 (Rhodotorula)。Furstoss 和 Archelas 等從眾多菌株中篩選一株 Aspergillus niger LCP 521進行環(huán)氧化合物的不對稱水解，合成了 6，7_雙羥基香葉醇。目前對于環(huán)氧化物水解酶的研究，主要集中于對原始菌株培養(yǎng)條件的優(yōu)化以增加產(chǎn)酶量或者是提高酶活，也有一部分研究者采用基因工程技術和蛋白質工程技術來提高環(huán)氧化物水解酶的立體選擇性。
本發(fā)明來源于宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)EOOl菌株具有環(huán)氧化物水解酶酶活性，提供一種新型B型環(huán)氧化物水解酶(Aus EH-B)基因成熟肽cDNA序列的克隆及原核表達?；蚬こ汰h(huán)氧化物水解酶純度高、不含其他蛋白酶，立體選擇性更強；大腸桿菌表達系統(tǒng)具有高效胞內表達重組蛋白，成本低廉、生產(chǎn)率高、操作簡單等優(yōu)勢；且由于一般底物為有機溶劑，酶分子受底物濃度抑制作用，胞內表達宿主菌包膜形成天然保護屏障，更有利于在高底物濃度下進行生物催化，適應工業(yè)化生產(chǎn)要求；本發(fā)明利用重組環(huán)氧化物水解酶制備手性環(huán)氧苯乙烯的研究未見報道。發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種源于Aspergillus usamii EOOl的新型B類環(huán)氧化物水解酶基因成熟肽cDNA序列的克隆及原核表達，利用重組環(huán)氧化物水解酶制備手性環(huán)氧苯乙烯的方法，為該環(huán)氧化物水解酶的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎。根據(jù)酶的亞細胞定位及底物的特異性將EH分為可溶性環(huán)氧化物水解酶(sEH)、微粒體環(huán)氧化物水解酶(mEH)， 保幼激素環(huán)氧化物水解酶(JhEH)，膽固醇環(huán)氧化物水懈酶(ChEH)，羥環(huán)氧烯酸水解酶 (hepoxi I inhydrolase),白三烯A4水解酶(LAH)以及朽1檬烯水解酶(LEH)七個亞家族。 生物信息學分析表明，來源于宇佐美曲霉EOOl菌株的一種新型環(huán)氧化物水解酶屬于微粒體環(huán)氧化物水解酶(mEH)類，屬于曲霉EH中一類新型環(huán)氧化物水解酶。由于與研究較多 A. Niger LCP521EH同源性僅為56 %，將該酶命名為Aus EH-B，其相應的基因命名為Aus EH-B。Aus EH-B具有較高的催化活性和手性選擇性，在手性環(huán)氧化物生產(chǎn)中有較大的工業(yè)化生產(chǎn)和應用潛力及經(jīng)濟價值。
A. usamii EOOl菌株由江南大學篩選和保藏，已于2005年在《食品與發(fā)酵工業(yè)》雜志的Vol. 31，No. 4，Pg. 50公開，本發(fā)明人承諾該菌株在20年內向公眾發(fā)放。
本發(fā)明的技術方案一種源自A. usamii EOOl的新型的B類環(huán)氧化物水解酶(Aus EH-B)，其基因(Aus EH-B)成熟肽cDNA核苷酸序列為SEQ ID Ν01ο
所述的由成熟肽cDNA序列所推導的Aus EH-B氨基酸序列為SEQ ID NO :2。
所述的重組Aus EH-B的活性測定方法
在1. 5mLEP管中各加入O. 85mL磷酸鉀緩沖液(pH7. O)稀釋適當重組酶菌液，在 30°C下預溫5min，然后各加入150 μ L200mM環(huán)氧氯丙烷立即記時反應20min后。取ImL轉化液加適量無水硫酸鈉，振蕩后離心(12000r/min，5min)，取上清液進行手性氣相分析。酶活單位定義30°C下，每分鐘催化IymoL外消旋環(huán)氧氯丙烷所需的酶量定義為一個酶活力單位(U)，環(huán)氧化物水解酶酶活力以每毫克干菌體所含有的酶活力單位表示(U/mg)。
所述的Aus EH-B成熟肽cDNA序列的克隆和表達的方法如下
(I)從已克隆的A. usamii EOOl基因cDNA序列，然后對該序列進行開放讀碼框分析和信號肽預測，根據(jù)預測的結果設計一對特異性引物，引物序列如下
AuEHB-F 5/ -GAATTCATGGCACTCGCTTACAGCAA-3'，含 EcoR I 酶切位點；
AuEHB-R 5/ -GCGGCCGCTCATTTTCTACCAGCCCATAC-3;，含 Not I 酶切位點；
提取A. usamii EOOl 的總 RNA,按照 TaKaRa 生產(chǎn)的 RNA PCR Kit (AMV) Ver. 3. O 中的說明書進行RT-PCR :以Oligo dT-Adaptor Primer為引物進行反轉錄合成cDNA的第一條鏈;以 M13Primer M4 和 AuEHB-F 為引物進行第一輪 PCR(94°C，2min ;94°C，30s，51°C，30s， 72°C，80s, 30個循環(huán)；72°C，lOmin)；以第一輪的PCR產(chǎn)物為模板、AuEHB-F和AuEHB-R為引物進行第二輪PCR(94°C，2min ;94°C，30s，55°C，30s，72°C，70s，30 個循環(huán)；72°C, lOmin);將兩輪PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳分析，250bp DNA LadderMarker做對照,將目的條帶割膠回收并與PUCm-T連接，轉化JM109獲重組質粒pUCm-T-AusEH-B，經(jīng)酶切鑒定后送上海生工進行序列測定，得到Aus EH-B成熟肽cDNA序列。
(2)將測序結果正確的pUCm-T-AusEH-B與pET-28-a-c (+)質粒均用EcoR I和 Not I進行雙酶切，割膠回收的酶切產(chǎn)物在T4DNA連接酶的作用下進行連接，得到重組質粒 pET-28a-AusEH-B，并對重組質粒進行序列測定。
(3)E. coli Rosetta(DE3)/EH-B的構建、表達、產(chǎn)物純化及活性測定將 pET-28-a-AusEH-B轉化E. coli Rosetta(DE3)，在含有氯霉素及Kna抗性平板上篩選轉化子。重組質粒EcoR I和Not I酶切驗證。挑去陽性轉化子于2mL含Kna/氯霉素抗性的LB 培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)過夜，以I %的接種量轉接到30mL相同培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長中期(0D600為O. 6 O. 8)，加人IPTG至終濃度為O. 5mmol/L，誘導過夜。同時以未誘導工程菌及含空質粒的菌株為陰性對照。誘導結束后，收集菌體并冷凍干燥，利用手性氣相色譜測定環(huán)氧化物水解酶活性。
本發(fā)明的有益效果本發(fā)明的目的是提供一種源于Aspergillus usamii EOOl的新型B類環(huán)氧化物水解酶基因成熟肽cDNA序列的克隆及原核表達，利用重組環(huán)氧化物水解酶制備手性環(huán)氧苯乙烯的方法。生物信息學分析表明該環(huán)氧化物水解酶屬于此類酶的B 類，所以命名為Aus EH-B，其相應的基因命名為Aus EH-B。產(chǎn)環(huán)氧化物水解酶重組菌的成功構建 ，經(jīng)氣相結果檢測顯示了較高的酶活性質以及對映體選擇性。因此，在環(huán)氧氯丙烷的手性拆分動力學研究中起到重要作用。本發(fā)明為該酶的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)奠定了理 論基礎，有較大的工業(yè)化生產(chǎn)和應用潛力及經(jīng)濟價值，也為其他菌株新型環(huán)氧化物水解酶的研究奠定了理論基礎。


圖1 :重組質粒pET-28a-AusEH_B的構建示意圖
圖 2 :重組 E. coli Rosetta(DE3)/Aus EH-B 的 SDS-PAGE 電泳圖具體實施方式
以下結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明的操作方法。但是這些實施例僅用于詳細說明本發(fā)明，而不用于限制本發(fā)明的范圍。
實施例1 A. usamii E001EH-B成熟肽cDNA序列的克隆
提取A. usamii EOOl 的總 RNA,按照 TaKaRa 生產(chǎn)的 RNA PCR Kit (AMV) Ver. 3. O 中的說明書進行RT-PCR :以Oligo dT-Adaptor Primer為引物進行反轉錄合成cDNA的第一條鏈;以 M13Primer M4 和 AuEHB-F 為引物進行第一輪 PCR(94°C，2min ;94°C，30s，51°C，30s， 72°C，80s, 30個循環(huán)；72°C，lOmin)；以第一輪的PCR產(chǎn)物為模板、AuEHB-F和AuEHB-R為引物進行第二輪PCR(94°C，2min ;94°C，30s，55°C，30s，72°C，70s，30 個循環(huán)；72°C, lOmin);將兩輪PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳分析，250bp DNA LadderMarker做對照,將目的條帶割膠回收并與PUCm-T連接，轉化JM109獲重組質粒pUCm-T-AusEH-B，經(jīng)酶切鑒定后送上海生工進行序列測定，得到Aus EH-B成熟肽cDNA序列。
實施例2 Aus EH-B成熟肽基因在中E. coli Rosetta(DE3)的表達
將測序結果正確的pUCm-T-AusEH-B與pET-28-a-c (+)質粒均用EcoR I和Not I進行雙酶切，割膠回收的酶切產(chǎn)物在T4DNA連接酶的作用下進行連接，得到重組質粒 pET-28a-AusEH-B，并對重組質粒進行序列測定。
E. coli Rosetta(DE3)/EH-B的構建、表達、產(chǎn)物純化及活性測定將 pET-28-a-AusEH-B轉化E. coli Rosetta(DE3)，在含有氯霉素及Kna抗性平板上篩選轉化子。重組質粒EcoR I和NotI酶切驗證。挑去陽性轉化子于2mL含Kna/氯霉素抗性的LB 培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)過夜，以I %的接種量轉接到30mL相同培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長中期(0D600為O. 6 O. 8)，加人IPTG至終濃度為O. 5mmol/L,誘導過夜。同時以未誘導工程菌及含空質粒的菌株為陰性對照。誘導結束后，收集菌體并冷凍干燥。經(jīng) SDS-PAGE電泳顯示重組Aus EH-B的分子量為43kDa ;測定環(huán)氧化物水解酶活性達750U/mg， 手性氣相柱分析rffi對(R)-環(huán)氧氯丙烷具有良好的立體選擇性，生產(chǎn)(S)-環(huán)氧氯丙烷對映體過量 值達99 %，產(chǎn)率為19.8%。
權利要求
1.一種來源于Aspergillus usamii EOOl的新型B類環(huán)氧化物水解酶,其cDNA序列和氨基酸序列分別為SEQ IDNO 1和SEQ IDNO :2。
2.A. usamii EOOl新型環(huán)氧化物水解酶B基因序列克隆及表達的方法 (1)從已克隆的A.usamii EOOl基因cDNA序列,然后對該序列進行開放讀碼框分析和信號肽預測，根據(jù)預測的結果設計一對特異性引物，引物序列如下AuEHB-F 5/ -GAATTCATGGCACTCGCTTACAGCAA-3'，含 EcoR I 酶切位點；AuEHB-R 5/ ~GCGGCCGCTCATTTTCTACCAGCCCATAC~3/，含 Not I 酶切位點；提取 A. usamii EOOl 的總 RNA,按照 TaKaRa 生產(chǎn)的 RNA PCR Kit (AMV) Ver. 3. O 中的說明書進行RT-PCR :以Oligo dT-Adaptor Primer為引物進行反轉錄合成cDNA的第一條鏈；以M13Primer M4和 AuEHB-F為引物進行第一輪PCR(94°C, 2min ；94°C, 30s, 51°C, 30s, 72°C,80s，30個循環(huán)；72°C，IOmin)；以第一輪的PCR產(chǎn)物為模板、AuEHB-F和AuEHB-R為引物進行第二輪PCR(94°C，2min ;94°C，30s，55°C，30s，72°C，70s，30 個循環(huán)；72°C, IOmin);將兩輪PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳分析，250bp DNA LadderMarker做對照,將目的條帶割膠回收并與pUCm-T連接，轉化JM109獲重組質粒pUCm-T-AusEH-B，經(jīng)酶切鑒定后送上海生工進行序列測定，得到Aus EH-B成熟肽cDNA序列； (2)將測序結果正確的pUCm-T-AusEH-B與pEH-28-a-c(+)質粒均用EcoR I和NotI進行雙酶切，割膠回收的酶切產(chǎn)物在T4DNA連接酶的作用下進行連接，得到重組質粒pEH-28-a-AusEH-B,并對重組質粒進彳了序列測定； (3)E.coli Rosetta(DE3)/EH-B的構建、表達、產(chǎn)物純化及活性測定將pEH-28-a-AusEH-B轉化E. coli Rosetta(DE3)，在含有氯霉素及Kna抗性平板上篩選轉化子；重組質粒EcoR I和Not I酶切驗證；挑去陽性轉化子于2mL含Kna/氯霉素抗性的LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)過夜，以I %的接種量轉接到30mL相同培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長中期(0D600為O. 6 O. 8)，加人IPTG至終濃度為O. 5mmol/L，誘導過夜；同時以未誘導工程菌及含空質粒的菌株為陰性對照；誘導結束后，收集菌體并冷凍干燥，測定手性氣相色譜環(huán)氧化物水解酶活性。
全文摘要
本發(fā)明提出一種源于Aspergillus usamii E001的新型B類環(huán)氧化物水解酶基因成熟肽cDNA序列的克隆及原核表達方法，其核苷酸序列為SEQ ID NO1，相應的氨基酸序列為SEQID NO2，相應的基因命名為Aus EH-B。手性氣相柱分析rEH對(R)-環(huán)氧氯丙烷具有良好的立體選擇性，生產(chǎn)(S)-環(huán)氧氯丙烷對映體過量值達99％。為該環(huán)氧化物水解酶的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎，對EH酶動力學拆分法研究為生物催化技術產(chǎn)業(yè)化制備手性環(huán)氧氯丙烷提供基礎。
文檔編號C12N15/55GK102994470SQ20121056263
公開日2013年3月27日 申請日期2012年12月24日 優(yōu)先權日2012年12月24日
發(fā)明者李劍芳, 胡蝶, 王春娟, 朱天地, 鄔敏辰 申請人:江南大學