芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶和芽孢的發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及蛋白酶和發(fā)酵培養(yǎng)基，尤其是涉及芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶和芽孢的發(fā)酵培 養(yǎng)基及發(fā)酵方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 伴隨著養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展、集約化程度的提高以及沿海水質(zhì)的日益惡化，水產(chǎn)養(yǎng) 殖動物爆發(fā)性病害日益增多。雖抗生素及化學(xué)藥物的應(yīng)用在一定程度上緩解和控制了水產(chǎn) 生物病害的發(fā)生和蔓延，但隨之而來的弊端也日漸顯露。它不僅違背人們所倡導(dǎo)的健康養(yǎng) 殖宗旨，同時也干擾養(yǎng)殖環(huán)境及水生動物微生態(tài)平衡，導(dǎo)致水產(chǎn)動物對病原微生物的易感 性，更嚴(yán)重的是病原菌的耐藥性增強(qiáng)，使得水產(chǎn)養(yǎng)殖病害防治工作越加困難。另外，抗生素 在水生動物體內(nèi)的殘留、富集，使得水產(chǎn)品質(zhì)量降低，成為了水產(chǎn)品銷售量和出口貿(mào)易量的 限制因素。
[0003] 1986年，Kozasa等首次利用芽抱桿菌處理日本饅麵降低了由于感染愛德華氏菌 而引起的死亡后，益生菌在水產(chǎn)研宄方面得到迅速發(fā)展。益生菌是指"當(dāng)攝入一定量時對 宿主健康有作用的微生物活體"，具有無毒副作用、無殘留、無耐藥性等優(yōu)點。現(xiàn)階段益生菌 在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用，主要體現(xiàn)在通過改善養(yǎng)殖對象體內(nèi)外的微生物群落，增大養(yǎng)殖對象 對飼料的攝食率，增強(qiáng)其營養(yǎng)價值，同時提高養(yǎng)殖對象的免疫能力，以此提高養(yǎng)殖對象的產(chǎn) 量，在魚類與貝類的養(yǎng)殖中都發(fā)揮積極的作用。近年來，對益生菌制劑在水產(chǎn)養(yǎng)殖方面的理 論與應(yīng)用研宄已逐漸成為世界范圍內(nèi)的熱潮。我國農(nóng)業(yè)部公布了 5種能夠應(yīng)用于動物養(yǎng)殖 的微生物，包括乳酸桿菌、芽孢桿菌、酵母菌、糞鏈球菌和雙歧桿菌。
[0004] 芽孢桿菌，多屬芽孢桿菌屬，革蘭氏染色陽性，大多為好氧或兼性厭氧。其具有分 解轉(zhuǎn)化和適應(yīng)能力強(qiáng)，可代謝產(chǎn)生蛋白酶、淀粉酶、酯酶等多種酶類，提高養(yǎng)殖對象對飼料 的吸收與轉(zhuǎn)化，促進(jìn)動物生長，同時其對養(yǎng)殖對象和人類無害等特點，使其在作為飼料微生 態(tài)添加劑和水體微生態(tài)調(diào)節(jié)劑上都有廣闊的應(yīng)用前景。芽孢桿菌作為益生菌的作用機(jī)理表 現(xiàn)在（1)降低養(yǎng)殖水體中有毒物質(zhì)含量，改善水環(huán)境；(2)提高動物的機(jī)體免疫力、減少病 害發(fā)生幾率；(3)提高動物消化酶活力、促進(jìn)快速生長；(4)調(diào)節(jié)動物體內(nèi)微生態(tài)平衡等方 面。因此，提高益生菌的消化酶活力，有利于促進(jìn)宿主健康生長。芽孢桿菌的一個重要特征 是，當(dāng)環(huán)境苛刻或營養(yǎng)供給不足時，在芽孢桿菌內(nèi)會形成一個近似圓形的內(nèi)生孢子，成為芽 孢。此時，細(xì)菌的新陳代謝幾乎停止，對不利的條件具有極強(qiáng)的抵抗性，具有耐高溫、耐干 燥、耐酸堿的特點。因此芽孢桿菌制劑易于保存與運(yùn)輸，在惡劣條件下仍不影響其品質(zhì)，活 化后可以繼續(xù)投入使用。微生態(tài)制劑中芽孢桿菌形成的芽孢數(shù)量是一個判斷微生態(tài)制劑質(zhì) 量的重要指標(biāo)。
[0005] 目前，對益生芽孢桿菌的研宄包括兩個方面：其一，篩選優(yōu)良菌株，構(gòu)建龐大的益 生菌資源庫。其二，對于已知的有益菌株，通過研宄優(yōu)化其培養(yǎng)條件，降低培育成本、提高菌 株產(chǎn)量與活性，具有重要的現(xiàn)實意義。芽孢桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)是工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)芽孢桿菌 制劑的如提。
[0006] 本申請人在中國專利201210016016. 2中公開一種用于鮑養(yǎng)殖的腸道益生菌粉及 其制備方法，其中披露了芽孢桿菌（B.stratosphericus)A3440,該菌于2011年09月17日 保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCCNo. 5253。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于提供一種芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶和芽孢的發(fā)酵培養(yǎng)基。
[0008] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種采用芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶和芽孢的發(fā)酵培養(yǎng)基用 于鮑養(yǎng)殖的腸道益生菌的發(fā)酵方法。
[0009] 所述芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶和芽孢的發(fā)酵培養(yǎng)基的原料配方為：蛋白胨7g/L、酵母膏 7g/L、NaC120g/L、CaCl20. 2g/L，pH為 9. 0;所述芽抱桿菌為芽抱桿菌（B.stratosphericus) A3440,該菌于2011年09月17日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心， 保藏編號為CGMCCNo. 5253 (參見本申請人的在先中國專利申請201210016016. 2)。
[0010] 所述采用芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶和芽孢的發(fā)酵培養(yǎng)基用于鮑養(yǎng)殖的腸道益生菌的發(fā) 酵方法如下：在錐形瓶中裝入已消毒滅菌的芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶和芽孢的發(fā)酵培養(yǎng)基，再將 芽孢桿菌（B.stratosphericus)A3440的種子液接種至錐形瓶中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，即完成采 用芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶和芽孢的發(fā)酵培養(yǎng)基用于鮑養(yǎng)殖的腸道益生菌的發(fā)酵。
[0011] 所述錐形瓶可采用250mL錐形瓶，發(fā)酵培養(yǎng)基的加入量可為30mL;所述消毒滅菌 的溫度可為120°C，消毒滅菌的時間可為30min;所述接種的接種量按質(zhì)量百分比可為芽孢 桿菌產(chǎn)蛋白酶和芽孢的發(fā)酵培養(yǎng)基的8% ;所述發(fā)酵培養(yǎng)的條件可置于恒溫?fù)u床上進(jìn)行發(fā) 酵培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度30°C，培養(yǎng)時間24h。
[0012] 本發(fā)明通過優(yōu)化發(fā)酵條件，提高了菌液的芽孢率與蛋白酶活力。經(jīng)試驗，在優(yōu)化條 件下芽孢率為94. 3%，較出發(fā)培養(yǎng)基提高8. 77% ;蛋白酶活力為294. 44U/mL，較出發(fā)培養(yǎng) 基提高76. 67%。有利于芽孢桿菌的培養(yǎng)，降低后續(xù)工作的成本。
[0013] 本發(fā)明優(yōu)化了芽孢桿菌（B.stratosphericus)A3440的培養(yǎng)條件，為芽孢桿菌制 劑的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)與技術(shù)支持。
【附圖說明】
[0014] 圖1是本發(fā)明中酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0015] 圖2是本發(fā)明中芽孢桿菌（B.stratosphericus)A3440的生長曲線。
[0016] 圖3是本發(fā)明中不同碳源對芽孢桿菌（B.stratosphericus)A3440產(chǎn)蛋白酶的影 響圖。
[0017] 圖4是本發(fā)明中不同碳源對芽孢桿菌（B.stratosphericus)A3440產(chǎn)芽孢的影響 圖。
[0018] 圖5是本發(fā)明中不同氮源對芽孢桿菌（B.stratosphericus)A3440產(chǎn)蛋白酶的影 響圖。
[0019] 圖6是本發(fā)明中不同氮源對芽孢桿菌（B.stratosphericus)A3440產(chǎn)芽孢的影響 圖。
[0020] 圖7是本發(fā)明中不同無機(jī)鹽對芽孢桿菌（B.stratosphericus)A3440產(chǎn)蛋白酶的 影響圖。
[0021] 圖8是本發(fā)明中不同無機(jī)鹽對芽孢桿菌（B.stratosphericus)A3440產(chǎn)芽孢的影 響圖。
[0022] 圖9是本發(fā)明中不同金屬離子對芽孢桿菌（B.stratosphericus)A3440產(chǎn)蛋白酶 的影響圖。
[0023] 圖10是本發(fā)明中不同金屬離子對芽孢桿菌（B.stratosphericus)A3440產(chǎn)芽孢的 影響圖。
[0024] 圖11是本發(fā)明中不同溫度對芽孢桿菌（B.stratosphericus)A3440產(chǎn)蛋白酶的影 響圖。
[0025] 圖12是本發(fā)明中不同溫度對芽孢桿菌（B.stratosphericus)A3440產(chǎn)芽孢的影響 圖。
[0026] 圖13是本發(fā)明中不同接種量對芽孢桿菌（B.stratosphericus)A3440產(chǎn)蛋白酶的 影響圖。
[0027] 圖14是本發(fā)明中不同接種量對芽孢桿菌（B.stratosphericus)A3440產(chǎn)芽孢的影 響圖。
[0028] 圖15是本發(fā)明中不同裝液量對芽孢桿菌（B.stratosphericus)A3440產(chǎn)蛋白酶的 影響圖。
[0029] 圖16是本發(fā)明中不同裝液量對芽孢桿菌（B.stratosphericus)A3440產(chǎn)芽孢的影 響圖。
[0030] 圖17是本發(fā)明中不同初始pH值對芽孢桿菌（B.stratosphericus)A3440產(chǎn)蛋白 酶的影響圖。
[0031] 圖18是本發(fā)明中不同初始pH值對芽孢桿菌（B.stratosphericus)A3440產(chǎn)芽孢 的影響圖。
【具體實施方式】
[0032] 以下實施例將結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。
[0033] 芽抱桿菌（B.stratosphericus)A3440,于2011年09月17日保藏于中國微生物菌 種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCCNo. 5253(參見本申請人的在先中國 專利申請 201210016016. 2)。
[0034] 1材料與