新的短短芽孢桿菌菌株、培養(yǎng)方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種短短芽孢桿菌（brevibacilus brevis)菌株、培養(yǎng)方法及其制備生防菌劑防治半夏塊莖腐爛病等的應(yīng)用。 技術(shù)背景
[0002] 半夏為天南星科（學(xué)名：Araceae)半夏屬多年生草本植物，為一味傳統(tǒng)中藥，臨床 應(yīng)用廣泛。傳統(tǒng)藥用主要集中于化痰濕，止嘔，治咽喉腫痛等。隨著藥理研宄的深入，生半 夏還廣泛用于腫瘤、肺癌、三叉神經(jīng)痛、失眠、腰痛、結(jié)石治療，療效顯著。為滿足不斷增加 的市場需求，半夏人工種植面積不斷擴(kuò)大，但不容忽視的是在種植進(jìn)程中，各種病害相繼出 現(xiàn)，尤其是半夏塊莖腐爛病的普遍發(fā)生，嚴(yán)重影響了半夏的產(chǎn)量和質(zhì)量，制約了半夏產(chǎn)業(yè)的 健康持續(xù)發(fā)展，迫切需要開發(fā)高效的防治方法。
[0003] 塊莖腐爛病已成為危害半夏的主要病害之一。一旦發(fā)生，半夏塊莖會在短時間內(nèi) 腐爛，輕者一周腐爛80%，嚴(yán)重地塊在3~5天的時間內(nèi)，半夏塊莖全部爛掉，整個地塊的 土壤和空氣中散發(fā)出腥臭的氣味，發(fā)病率高達(dá)15%~30%。病菌侵染半夏塊莖的初期，塊 莖的周邊出現(xiàn)不規(guī)則的黑色斑點，此斑點向四周迅速擴(kuò)展，3~4天后，眾多的病菌斑點聯(lián) 在一起，繼續(xù)向塊莖內(nèi)部侵染，此時，半夏根系開始萎縮，地上部的葉片逐漸由綠色變黃、枯 萎。1周后，半夏塊莖呈圓水泡狀，似熟透了的葡萄，塊莖內(nèi)全是黑水，全株死亡，最后只剩下 薄薄的外皮。蔓延的病菌會迅速侵染其他半夏塊莖，短期內(nèi)使整個半夏地塊全部感染而腐 爛，先爛大塊莖，后向小塊莖蔓延，最后只留下小于Icm的珠芽。此病害也是目前人工栽培 半夏最常見、難治療、危害大、范圍廣的病害。
[0004] 當(dāng)前，在半夏生產(chǎn)上尚未培育出有效的抗病品種，也無防治該病的特效藥劑。而且 長期大量使用各種化學(xué)藥劑，還會導(dǎo)致病原菌產(chǎn)生抗藥性、生態(tài)環(huán)境遭受嚴(yán)重污染、農(nóng)產(chǎn)品 農(nóng)殘超標(biāo)等直接威脅用藥安全。因此，探索有效的防治手段具有重要意義，而生物防治被認(rèn) 為是最有潛力的防治方法，短短芽孢桿菌作為生防菌，在植物病害防治方面，國內(nèi)外均有報 道。
[0005] 如 Edwards SG 等在 Mode of antagonism of Brevibacillus brevis against Botrytis cinerea in vitro. 一文中披露了在短短芽胞桿菌或短桿菌肽S存在時，可以有 效抑制大白菜的灰霉病菌生長（JAppl Microbiol. 2001，91 (4) :652-659);郝曉娟等在短 短芽孢桿菌JK-2菌株對番茄枯萎病的抑菌作用及其小區(qū)防效中公開了短短芽胞桿菌JK-2 可以抑制蕃茄枯萎病的菌絲生長（中國生物防治，2007, 23 (3) :233-236)，對病原菌孢子的 萌發(fā)也具有明顯的抑制作用，同時，還可引起菌絲消解，產(chǎn)生泡狀物，破壞生長點，引起細(xì)胞 內(nèi)含物外溢等，對番茄枯萎病的盆栽防效和田間防效分別為83. 82%和74. 7%;陳莉在棉花 生防芽孢桿菌A57、A178的抑菌機(jī)理、拮抗活性物質(zhì)及防病、促生作用中公開了短短芽胞桿 菌A57對棉花的立枯病、枯萎病等病原真菌具有明顯的抑制作用（2007,新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士 學(xué)位論文）；易有金等在煙草內(nèi)生短短芽孢桿菌的分離鑒定及對煙草青枯病的防效中公開 了從煙草莖桿中分離得到的一種短短芽孢桿菌屬的內(nèi)生細(xì)菌對由青枯雷爾氏菌引起的煙 草青枯病具有一定的防效（植物病理學(xué)報，2007, 37 (3) :301-306)。專利CN201010296437. 6 公開了一種新的短短芽孢桿菌菌株及其應(yīng)用，該短短芽孢桿菌菌株FJAT-0809-GLX的發(fā)酵 液可以獲得一種能夠?qū)堁圻M(jìn)行保鮮的微生物保鮮菌劑；專利CN201010607988. X公開了 防治植物真菌病害的短短芽孢桿菌及其用途，該菌株可以有效地應(yīng)用于瓜枯萎病的防治， 并可以用于制備一種安全、高效的生物農(nóng)藥?？梢姸潭萄挎邨U菌的應(yīng)用正在逐漸增多。但 本發(fā)明從半夏根際土壤分離獲得的短短芽孢桿菌菌株，及其在防治半夏塊莖腐爛病中的應(yīng) 用，國內(nèi)外未見報道與利用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是針對化學(xué)品不安全和半夏生防產(chǎn)品研宄較少的不足，提供一種從 半夏根際土壤中分離獲得的短短芽孢桿菌菌株以用于對半夏塊莖腐爛病的防治。
[0007] 本發(fā)明的技術(shù)方案是：
[0008] 本發(fā)明所述短短芽孢桿菌菌株，是從貴州省大方縣的半夏根際土壤中分離獲得 的，命名為短短芽孢桿菌（brevibacillus brevis)菌株GZDF3,保藏于中國微生物菌種保 藏管理委員會普通微生物中心（CGMCC)，地址為：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，保藏 日期為2014年12月01日，保藏編號為CGMCC No. 10121。
[0009] 本發(fā)明的短短芽孢桿菌（brevibacilus brevis)菌株GZDF3具有下述性質(zhì)：
[0010] 形態(tài)特征：菌株在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（NA)中菌落表面光滑，邊緣不整齊，無光 澤，不透明，淺黃色，圓形或橢圓形，革蘭氏染色呈陽性，顯微鏡下，菌體細(xì)胞為桿狀。見圖1。
[0011] 生理生化鑒定指標(biāo)如下：
[0012]
[0013] 注：+表示有作用或有反應(yīng)；一表示無作用或無反應(yīng)
[0014] 將上述各指標(biāo)結(jié)合16SrDNA分子生物學(xué)鑒定，與模式菌株brevibacilus brevis 100599,短短芽孢桿菌菌株FJAT-0809-GLX，短短芽孢桿菌X23等進(jìn)行序列比對，構(gòu)建系 統(tǒng)進(jìn)化樹，鑒定該菌株為短短芽孢桿菌（brevibacilus brevis)，且為一新亞種。該菌株 16SrDNA 大小為 I. 5kb，Genbank 登錄號 KP137562。
[0015] 本發(fā)明短短芽孢桿菌GZDF3的分尚培養(yǎng)方法是：
[0016] (1)稱取IOg半夏根際土壤（5cm)，倒入盛有90ml無菌水的三角瓶中，搖床震蕩 18-24min，再放入75-85°C的恒溫水浴鍋中攪拌10_15min，靜置4-6min后吸取ImL進(jìn)行梯 度稀釋，選用稀釋度為1〇_ 5、1〇_4、1〇_3;
[0017] (2)吸取步驟⑴的土壤稀釋液各IOOyl涂布于NA培養(yǎng)基平板上，然后將平板倒 置于28°C恒溫箱中培養(yǎng)2-3d，挑取單菌落接種在新的培養(yǎng)基上純化，重復(fù)3-4次，獲得純菌 落；
[0018] (3)拮抗試驗：采用瓊脂打孔法對半夏塊莖腐爛病的抑制效果進(jìn)行評價：即分別 將半夏塊莖腐爛病病原細(xì)菌懸液、病原真菌孢子懸液均勻涂布于PDA平板上，然后每個平 板分別用打孔器在距離平板中央2cm處打孔，直徑8mm，每個平板打4個孔，分別在每個孔加 入150 μ L菌培養(yǎng)液，于28-32 °C恒溫培養(yǎng)46-50小時后觀察，采用無菌水做陰性對照，農(nóng)用 硫酸鏈霉素500倍液做陽性對照，通過測量抑菌圈大小篩選分離獲得拮抗菌。
[0019] 所述NA培養(yǎng)基配方為：牛肉膏3.0g/L，蛋白胨10.0g/L，氯化鈉 5.0g/L，瓊脂 15. Og/L, pH7. 0〇
[0020] 本發(fā)明還提供了采用短短芽孢桿菌（brevibacillus brevis)菌株GZDF3的發(fā)酵 液，獲得一種能夠防治半夏塊莖腐爛病的生防菌劑。
[0021] 本發(fā)明的菌劑經(jīng)下列步驟得到：
[0022] (1)菌株活化：從_80°C超低溫冰箱取出菌種GZDF3,用接種環(huán)劃線于培養(yǎng)基平板 上，28-32°C恒溫培養(yǎng)26-30小時，長出單菌落；
[0023] (2)種子液的制備：挑取上述單菌落接種于30mL NA液體培養(yǎng)基中，28-30 °C， 200rpm搖床振蕩培養(yǎng)10-12小時，獲得種子液；
[0024] (3)制備液體發(fā)酵液：將種子液按接種量I :3. 5倍的比例接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中培 養(yǎng)，初始PH7-8、培養(yǎng)溫度為30-32°C、200rpm搖床振蕩培養(yǎng)36-38小時后，離心收集上清，儲 存作為生防菌劑。
[0025] 所述菌株培養(yǎng)基為NA培養(yǎng)基，組分為：牛肉膏5. Og/L，蛋白胨10.0 g/L，氯化鈉 5. 0g/L，瓊脂 15. 0g/L，ρΗ7· 0。
[0026] 所述種子NA液體培養(yǎng)基的組分：牛肉膏5. 0g/L，蛋白胨10. 0g/L，氯化鈉 5. 0g/L， pH7. 0〇
[0027] 所述發(fā)酵培養(yǎng)基組分：1%脫脂奶粉、0.1%酵母提取物、3.7!111腿2?0 4、2.91111 Κ2ΗΡ04、2· OmM MgSO4 ·7Η20,、0· 7mM NaCl、0. 05mM MnCl2 ·4Η20、0· 036mM FeSO4 ·5Η20、0· 15mM CaCl2, pH7. 0〇
[0028] 本發(fā)明的再一目的是提供該菌株生防菌劑在防治半夏塊莖腐爛病中的應(yīng)用，其中