一株耐低溫石油降解芽孢桿菌、培養(yǎng)方法及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及耐低溫石油降解菌株、培養(yǎng)方法、及其應(yīng)用。本發(fā)明的耐低溫菌芽孢桿菌的培養(yǎng)方法包括：將石油污染土樣利用生理鹽水溶解，搖床振蕩后靜置分層，將菌懸液接入原油無機鹽液體培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)后取液體培養(yǎng)基中適量下層發(fā)酵液，接種至新鮮無機鹽液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，如此反復(fù)進行5次。對所得菌液進行梯度稀釋，涂布至原油無機鹽固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，觀察培養(yǎng)基菌落數(shù)量，選擇數(shù)量適中的培養(yǎng)基，進行劃線培養(yǎng)；反復(fù)馴化、劃線培養(yǎng)，直至得到多株純菌。本發(fā)明的耐低溫菌芽孢桿菌優(yōu)先降解原油組分中的中長鏈飽和烷烴，該菌可應(yīng)用于石油烴降解和土壤或水體石油污染的生物修復(fù)中，尤其可用于低溫環(huán)境。
【專利說明】一株耐低溫石油降解芽孢桿菌、培養(yǎng)方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于環(huán)境污染物生物處理【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及在低溫環(huán)境下降解石油烴的菌株、其培養(yǎng)方法，以及其在土壤環(huán)境污染修復(fù)中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]石油是一種粘稠易燃的、顏色從黃到黑的氣態(tài)、液態(tài)和固態(tài)碳氫化合物的混合物，天然條件下存在于地表之下，含有多種烴類(正烷烴、支鏈烷烴、芳烴、脂環(huán)烴)及少量其他有機物(硫化物、氮化物、環(huán)烷酸類等)的復(fù)雜混合物。作為目前世界上最重要的一次能源之一，同時也是許多化學(xué)工業(yè)產(chǎn)品如化肥、殺蟲劑、塑料等的原料，石油具有非常重要的戰(zhàn)略地位以及龐大的消耗量，世界各國都十分重視石油的開采和使用。目前，世界上石油開采主要分為陸地開采和海洋開采，其中陸地開采產(chǎn)量約占全球開采量的70%以上。我國已經(jīng)找到的油氣田大約500多個，同時已經(jīng)開發(fā)了包括克拉瑪依、大慶、勝利、華北、遼河、中原等一系列大的油田。大規(guī)模開采的同時也引發(fā)了諸多的環(huán)境污染問題。石油進入土壤，不但破壞土壤生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能，降低土壤質(zhì)量，還可以附著在植物的根系表面，影響作物的根系生長。此外，石油烴污染物可隨地面降水滲透到地下水，進而污染淺層地下水環(huán)境，影響飲用水的水質(zhì)。而且石油中所含的多環(huán)芳烴物質(zhì)具有致癌、致畸、致突變等作用，能通過食物鏈在動植物體內(nèi)逐級富集，嚴重威脅到農(nóng)作物的質(zhì)量和人類健康。
[0003]諸多研究表明，土壤環(huán)境中的天然微生物種群對石油烴的降解作用是石油烴類污染物從土壤環(huán)境中消除的基本途徑之一。與物理、化學(xué)等修復(fù)技術(shù)相比，生物修復(fù)技術(shù)具有安全、高效、生態(tài)友好和經(jīng)濟等特點。微生物利用自我調(diào)控機制以及對污染物的綜合凈化功能處理土壤中的石油烴類污染物，使這些污染物在微生物的新陳代謝過程中得到較為徹底的轉(zhuǎn)化和降解，如轉(zhuǎn)化成毒性較低的物質(zhì)或CO2和水，不會產(chǎn)生二次污染，是應(yīng)用前景最為樂觀的土壤石油污染物處理方法。
[0004]但是，以往的研究.多集中在利用常溫或高溫微生物進行環(huán)境污染生物治理，對于低溫環(huán)境的研究較少。在高山、高緯地區(qū)，尤其是我國北方的油田地區(qū)，氣候寒冷的條件下微生物存活率較低、自然降解能力較差，嚴重影響了石油污染地區(qū)土壤質(zhì)量。近年來，低溫環(huán)境對有機污染物的影響的研究越來越受到環(huán)境微生物學(xué)者的重視。有研究表明在北極、南極和高山凍土地區(qū)的土壤中存在大量耐冷的或嗜冷的土著石油烴降解微生物。此外，在石油污染的鹽堿土壤中也存在一些耐鹽的石油烴降解菌。這些嗜冷菌、嗜熱菌或者耐鹽微生物為特殊條件下的石油污染修復(fù)提供了種質(zhì)資源。常見的低溫石油降解菌主要有假單胞菌屬(Pseudoalteromonas)、諾卡氏菌屬(Nocardia)、惡臭假單胞菌屬(Pseudomonasputida)、沙門氏菌屬(Salmonella)、變形菌門(Proteobacteria)等。這些菌能在低溫環(huán)境中發(fā)揮對石油烴類物質(zhì)的生物利用。因此，篩選低溫環(huán)境條件下優(yōu)勢石油降解菌株將為建立適合低溫環(huán)境石油污染土壤的生物治理技術(shù)提供重要技術(shù)支撐。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0005]本發(fā)明的目的是針對上述現(xiàn)有低溫條件下利用微生物修復(fù)石油烴污染土壤存在的難題，提供能高效降解石油的土壤微生物。
[0006]本發(fā)明所提供的高效降解菌來源于天津大港油田附近石油污染的土壤，經(jīng)人工馴化、分離純化得到。
[0007]本發(fā)明提供的一種菌株Bacillus sp.DG24，屬于革蘭氏染色陽性蠟狀芽孢桿菌，菌落呈紅棕色，不透明，菌落直徑大約1.5mm (24h)，菌株16SrDNA的GenBank登錄號為JN216879，該菌株于2011年7月11日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址:北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學(xué)院微生物研究所；郵政編碼:100101)保藏，保藏編號為CGMCC N0.5051，分類學(xué)命名為芽孢桿菌(Bacillus sp.)，屬于革蘭氏染色陽性菌。
[0008]本發(fā)明還涉及Bacillus sp.DG24的培養(yǎng)方法，即馴化及純化方法，包括以下步驟:
[0009](I)將石油污染土樣利用生理鹽水溶解，搖床振蕩后靜置分層，將菌懸液接入原油無機鹽液體培養(yǎng)基中，在10-15°C搖床培養(yǎng)10-15天，后取液體培養(yǎng)基中適量下層發(fā)酵液接種至新鮮原油無機鹽液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)10-15天，如此反復(fù)進行3-5次。
[0010](2)吸取定量步驟(I)所得原油無機鹽液體培養(yǎng)基中發(fā)酵液，進行梯度稀釋，分別均勻涂布至原油無機鹽固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)8-15天，觀察培養(yǎng)基菌落數(shù)量，選擇數(shù)量適中的培養(yǎng)基，進行劃線培養(yǎng)。
[0011](3)反復(fù)馴化、劃線培養(yǎng)，直至得到多株純菌。
[0012]優(yōu)選地，步驟(I)所用原油無機鹽液體培養(yǎng)基，每IOOOml培養(yǎng)基液體中含:0.4gNa2HPO4,0.15g KH2PO4,0.1gNH4Cl, 0.05g MgSO4.7Η20，0.0015g CaCl2,0.1g NaNO3,0.0OlgFeSO4.7Η20，ImL微量元素，其中微量元素由每IOOmL純水中加入0.5mg CuSO4.5H20, 1.0mgH3BO3, 1.0mg MnSO4.5Η 20，7.0mg ZnSO4配制得到，其中，1000ml培養(yǎng)基液體還包括0.5?2g滅菌原油，優(yōu)選lg。
[0013]優(yōu)選地,步驟(2)所用原油無機鹽固體培養(yǎng)基由下述方法得到:在每IOOOml由0.4g Na2HPO4, 0.15g KH2PO4, 0.1gNH4Cl, 0.05g MgSO4.7Η20，0.0015g CaCl2,0.1g NaNO3,0.0Olg FeSO4.7Η20, ImL微量元素組成的培養(yǎng)基液體中，其中微量元素由每IOOmL純水中加入 0.5mg CuSO4.5H20, 1.0mg H3BO3, 1.0mg MnSO4.5H20, 7.0mg ZnSO4 配制得到，另外加入15?20g瓊脂，再在培養(yǎng)基表面均勻涂20?30 μ I滅菌原油。
[0014]優(yōu)選地，Bacillus sp.DG24的培養(yǎng)方法還包括保存步驟，具體為:將含Bacillussp.DG24菌體的乳化原油無機鹽液體培養(yǎng)基，置于4°C條件下保存，每隔40-50天吸取該乳化原油液體培養(yǎng)基下層水相10_20ml接入新鮮已滅菌且還沒有加入降解菌的原油液體培養(yǎng)基中按馴化方法進行操作，10-15天后將發(fā)生乳化現(xiàn)象的原油液體培養(yǎng)基置于4°C條件下再次保存；所述乳化原油液體培養(yǎng)基通過下述方法得到:用滅菌接種環(huán)挑取反復(fù)馴化純化后在原油無機鹽固體培養(yǎng)基中劃線培養(yǎng)的Bacillus sp.DG24菌落接入原油無機鹽液體培養(yǎng)基中，放于培養(yǎng)箱中10°C培養(yǎng)。
[0015]優(yōu)選地，Bacillus sp.DG24的培養(yǎng)方法的保存步驟之后，還包括富集培養(yǎng)步驟，具體為:吸取上述保存步驟的置于4°C條件下保存的含Bacillus sp.DG24菌體的乳化原油無機鹽液體培養(yǎng)基(乳化原油液體培養(yǎng)基)水相液體50-100 μ I接入LB液體培養(yǎng)基中，于10°C條件下置于搖床中培養(yǎng)，在無菌操作臺中將含有DG24菌體的LB液體培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至已滅菌離心管中，離心收集菌體,并用滅菌無機鹽液體培養(yǎng)基清洗菌體,將菌體重懸于無機鹽液體培養(yǎng)基中置于4°C條件下待用。
[0016]本發(fā)明還涉及Bacillus sp.DG24菌在降解原油中的應(yīng)用，優(yōu)選在10-30°C溫度下進行降解；在10°c條件下，降解環(huán)境的其他條件優(yōu)選為:pH6.0-8.0,以NaCl計的鹽度為0.5-1.5%,原油和磷元素質(zhì)量比W(原油):ff (P)為10:1-40:1,原油和氮元素質(zhì)量比W(原油):ff(N)為5:1-20:1，原油的濃度為100-2000mg.-Λ優(yōu)選100-800mg.L'
[0017]Bacillus sp.DG24菌用于降解原油中的石油烴，所述石油烴優(yōu)選為飽和烷烴，更優(yōu)選中長鏈飽和烷烴，碳原子數(shù)在十二到二十八范圍內(nèi)的飽和烷烴，更優(yōu)選中鏈飽和烷烴，進一步優(yōu)選正十二烷、正十四烷、正十六烷、正十八烷或正十九烷，最優(yōu)選正十二烷和正十四烷。
[0018]Bacillus sp.DG24菌在降解原油的應(yīng)用中，原油的濃度為100-2000mg.L-1時，石油烴的降解速率范圍為1.76-20.78mg.L-1.d-1。
[0019]本發(fā)明還涉及Bacillus sp.DG24菌在土壤或水體石油污染的生物修復(fù)中的應(yīng)用，優(yōu)選地，在10-30°C溫度下進行修復(fù)。
[0020]優(yōu)選地，在10°C條件下，土壤中石油污染的生物修復(fù)的條件為:原油的濃度為3000 -30000mg.kg-1
[0021]優(yōu)選地，在10°C條件下，土壤中石油污染的生物修復(fù)時，原油的濃度為3000-30000mg.kg-1時，石油烴的降解率可達15.18%-50.52%,降解速率達到0.018-0.055g.kg-1.cf1。
[0022]Bacillus sp.DG24能利用石油作為唯一碳源和能源生長繁殖,不但可以將石油乳化，而且大量降解其中的飽和烷烴組分。經(jīng)35天培養(yǎng)，原油培養(yǎng)基中的原油被乳化完全，溶液呈深棕色，且菌液濃稠。同樣條件下，常溫菌的降解率不足10%，而上述菌的石油烴降解率最高達到50%。
[0023]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本技術(shù)發(fā)明涉及的Bacillus sp.DG24可以應(yīng)用于低溫及常溫環(huán)境石油污染土壤中，且有較好的活性及降解性能。在未投加任何表面活性劑的土壤中，10°c低溫條件下，經(jīng)過80天，Bacillus sp.DG24對污染濃度為28.86g.kg-1 土壤中的石油烴的降解率為15.18%。與已有的菌株相比，該菌具有較高的適應(yīng)能力，范圍較寬的生長溫度，高效的降解能力，且對于石油烴中的烷烴組分有較的優(yōu)先生物利用性。從環(huán)境保護與修復(fù)角度而言，Bacillus SP.DG24對于低溫環(huán)境中土壤石油污染的治理具有重大價值，為低溫環(huán)境降解菌的研究工作提供支持。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0024]圖Ι-a為試驗例4Bacillus sp.DG24在10°C條件下對土壤中石油烴的生物降解率；
[0025]圖Ι-b為試驗例4Bacillus sp.DG24在25°C條件下對土壤中石油烴的生物降解率；
[0026]圖2為試驗例5Bacillus sp.DG24在10°C條件下優(yōu)先降解的原油組分的GC-MS圖
[0027] 圖3為試驗例6Bac i I Ius sp.DG24在I (TC條件下對不同飽和烷烴的生物降解率?！揪唧w實施方式】
[0028]材料準(zhǔn)備:
[0029]土壤:2010年4月20日花菲、寧少尉采自天津大港油田油井附近受污染土壤。
[0030]原油無機鹽液體培養(yǎng)基:
[0031 ] 無機鹽(1OX)液體培養(yǎng)基母液(超純水溶液):4g Na2HPO4,1.5g KH2PO4,1gNH4Cl，0.5g MgSO4.7Η20，0.015g CaCl2,1g NaNO3,0.0lg FeSO4.7Η20，超純水定容至 1000ml ；
[0032]無機鹽液體培養(yǎng)基:無機鹽液體培養(yǎng)基母液(IOX ) 100ml,另加入微量元素Iml(IOOml 純水中加入 0.5mg CuSO4.5H20, 1.0mg H3BO3, 1.0mg MnSO4.5H20, 7.0mg ZnSO4 配制得到)，以超純水定容至1000ml，利用0.2M氫氧化鈉或者0.1M鹽酸調(diào)節(jié)pH=7.0-7.2 ；
[0033]原油無機鹽液體培養(yǎng)基:無機鹽液體培養(yǎng)基1000ml，加入0.5-2g滅菌原油，優(yōu)選lg°
[0034]原油無機鹽固體培養(yǎng)基:
[0035]原油無機鹽液體培養(yǎng)基1000ml，加入瓊脂15-20g，在固體培養(yǎng)基表面均勻涂20-30 μ1滅菌原油。
[0036]試驗方法及應(yīng)用方法:
[0037]Bacillus sp.DG24 的培養(yǎng)方法:
[0038](1)馴化步驟
[0039]傳統(tǒng)的菌的培養(yǎng)方法是直接將菌液與液體培養(yǎng)基混合繼續(xù)培養(yǎng)，本發(fā)明的繼續(xù)培養(yǎng)使用的是下層含有菌體的發(fā)酵液，具體的，將石油污染土樣利用生理鹽水溶解，一般每Ig土壤用IOml生理鹽水(0.9%NaCl)溶解，搖床振蕩后靜置分層，將菌懸液接入新配制的原油無機鹽液體培養(yǎng)基中，在10_15°C搖床培養(yǎng)10-15天，后取下層含有菌體的發(fā)酵液，一般取5-10ml，轉(zhuǎn)移至新配制的原油無機鹽液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)8-15天，如此反復(fù)進行3-5次，得到菌液。將最后一次馴化的原油無機鹽液體培養(yǎng)基置于4°C保存待用，其水相發(fā)酵液中包含能降解原油的混合微生物菌群。
[0040]另外，在轉(zhuǎn)接菌懸液或每次轉(zhuǎn)接發(fā)酵液之前，在新配制的無機鹽液體培養(yǎng)基中加入滅菌原油作為微生物生長的碳源，以制成原油無機鹽液體培養(yǎng)基。該滅菌原油的量每次控制在0.5-2g，優(yōu)選加入lg，即原油無機鹽液體培養(yǎng)基的原油濃度控制500-2000mg.L-1比較有利于菌的生長。在轉(zhuǎn)接過程中使用新配制的原油無機鹽液體培養(yǎng)基主要是為了保持環(huán)境的無菌性，以及確保培養(yǎng)基的成分穩(wěn)定。
[0041](2)分離純化步驟
[0042]定量吸取步驟(1)所得發(fā)酵液進行梯度稀釋，例如，稀釋梯度依次為10-3、10-6、10-9，一般取50-lOOul，涂布至原油無機鹽固體培養(yǎng)基上，在10°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8-15天后，進行劃線培養(yǎng)，待長出菌落后，觀察培養(yǎng)基菌落數(shù)量，選擇菌落數(shù)量適中的培養(yǎng)基，用接種環(huán)挑取單菌落于原油無機鹽固體培養(yǎng)基中劃線培養(yǎng)。
[0043](3)反復(fù)馴化、劃線培養(yǎng)
[0044]反復(fù)馴化、劃線培養(yǎng)，一般馴化3-5次，直至得到多株純菌。
[0045]步驟(3)之后，還可包括保存步驟，具體為:將含Bacillus sp.DG24菌體的乳化原油無機鹽液體培養(yǎng)基，置于4°C條件下保存，每隔40-50天吸取乳化原油液體培養(yǎng)基下層水相10-20ml接入新鮮已滅菌且還沒有加入降解菌的原油無機鹽液體培養(yǎng)基中按馴化方法進行操作，10-15天后將發(fā)生乳化現(xiàn)象的原油液體培養(yǎng)基置于4°C條件下再次保存；所述乳化原油液體培養(yǎng)基通過下述方法得到:用滅菌接種環(huán)挑取反復(fù)馴化純化后的在原油無機鹽固體培養(yǎng)基中劃線培養(yǎng)的BaciIIus sp.DG24菌落接入原油無機鹽液體培養(yǎng)基中，放于培養(yǎng)箱中10°C培養(yǎng)，一般培養(yǎng)15天。
[0046]保存步驟之后，還可包括富集培養(yǎng)步驟，具體為:吸取上述保存步驟所得的保存在4°C條件下的乳化原油液體培養(yǎng)基下層水相液體50-100 μ I接入LB液體培養(yǎng)基中，于10°C條件下置于搖床中培養(yǎng)，搖床條件為150r/min, —般培養(yǎng)2d,這樣保證Bacillus sp.DG24進入對數(shù)生長期，且生物量達到最大，在無菌操作臺中將含有Bacillus sp.DG24菌體的LB液體培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至已滅菌離心管中，離心收集菌體，并用滅菌無機鹽液體培養(yǎng)基清洗菌體，將菌體重懸于無機鹽液體培養(yǎng)基中，優(yōu)選菌體密度控制在A_為1.5-2.0，置于4°C條件下待用；所述乳化原油液體培養(yǎng)基通過下述方法得到:用滅菌接種環(huán)挑取反復(fù)馴化純化后在原油無機鹽固體培養(yǎng)基中劃線培養(yǎng)的Bacillus sp.DG24菌落接入原油無機鹽液體培養(yǎng)基中，放于培養(yǎng)箱中10°c培養(yǎng),一般培養(yǎng)15天。
[0047]用于馴化培養(yǎng)Bacillus sp.DG24菌的原油無機鹽液體培養(yǎng)基:
[0048]本發(fā)明涉及的原油無機鹽液體培養(yǎng)基，每IOOOml培養(yǎng)基液體中含:0.4gNa2HPO4,0.15g KH2PO4,0.1gNH4Cl, 0.05g MgSO4.7Η20，0.0015g CaCl2,0.1g NaNO3,0.0OlgFeSO4.7Η20, ImL微量元素，其中微量元素每IOOmL純水中加入0.5mg CuSO4.5H20, 1.0mgH3BO3, 1.0mg MnSO4.5Η20，7.0mg ZnSO4配制得到，其中，1000ml培養(yǎng)基液體還包括0.5?2g滅菌原油，優(yōu)選lg。
[0049]用于馴化培養(yǎng)Bacillus sp.DG24菌的原油無機鹽固體培養(yǎng)基:
[0050]本發(fā)明涉及的原油無機鹽固體培養(yǎng)基由下述方法得到:在每IOOOml由0.4gNa2HPO4,0.15g KH2PO4, 0.1gNH4Cl, 0.05g MgSO4.7Η20，0.0015g CaCl2,0.1g NaNO3,0.0OlgFeSO4.7Η20，ImL微量元素組成的培養(yǎng)基液體中，其中微量元素由每IOOmL純水中加入0.5mgCuSO4.5Η20，1.0mg H3BO3, 1.0mg MnSO4.5Η20，7.0mg ZnSO4 配制得到，另外加入 15 ?20g 瓊脂，再在培養(yǎng)基表面均勻涂20?30 μ I滅菌原油。
[0051]Bacillus sp.DG24 菌的保存方法:
[0052]本發(fā)明提供了高效原油降解菌Bacillus sp.DG24的保存方法。常見的微生物保存方法多將微生物保存在固體或斜面半固體培養(yǎng)基中。此外，大量文獻表明石油烴降解菌的降解特性與菌體內(nèi)質(zhì)粒上的基因片段有關(guān)，在實驗中發(fā)現(xiàn)長期將Bacillus sp.DG24保存在碳源為非石油烴的培養(yǎng)基中，如LB培養(yǎng)基，該菌體對原油的降解性會大大降低，為保持Bacillus sp.DG24對原油的持續(xù)高效降解性，本發(fā)明中將Bacillus sp.DG24保存在乳化原油液體培養(yǎng)基中。乳化原油液體培養(yǎng)基為在原油高效降解菌作用下發(fā)生乳化現(xiàn)象的原油液體培養(yǎng)基，通過用滅菌接種環(huán)挑取反復(fù)馴化純化后在原油固體培養(yǎng)基中劃線培養(yǎng)的Bacillus sp.DG24菌落，接入原油無機鹽液體培養(yǎng)基中，放于培養(yǎng)箱中10°C培養(yǎng)15天獲得。此時培養(yǎng)基水相呈棕色，原油發(fā)生乳化現(xiàn)象，并有大小不等的原油油滴分散在水相中，將上述含Bacillus sp.DG24菌體的乳化原油無機鹽液體培養(yǎng)基，置于4°C條件下保存，其中下層水相發(fā)酵液中含有Bacillus Sp.DG24單菌種，進行Bacillus sp.DG24富集培養(yǎng)時可從此原油無機鹽液體培養(yǎng)基中吸取適量發(fā)酵液作為接種液。[0053]Bacillus sp.DG24的保存方法的具體操作為:將乳化原油無機鹽液體培養(yǎng)基(含Bacillus sp.DG24菌體)置于4?條件下保存，每隔40-50天，優(yōu)選45天吸取該乳化原油液體培養(yǎng)基下層水相10-20ml接入新鮮已滅菌的原油液體培養(yǎng)基中按馴化方法進行操作，10-15天后將發(fā)生乳化現(xiàn)象的原油液體培養(yǎng)基置于4°C條件下再次保存。每次轉(zhuǎn)接過程中Bacillus sp.DG24的保存周期為40-50天,優(yōu)選45天。這種保存方法操作方便，同時也保證了 Bacillus sp.DG24對原油的高效降解性。
[0054]Bacillus sp.DG24菌的富集培養(yǎng)方法:
[0055]本發(fā)明還提供了一種快速便捷的原油降解菌Bacillus sp.DG24的富集培養(yǎng)方法。在實驗過程中發(fā)現(xiàn)在接種量及其它實驗條件相同時，原油液體培養(yǎng)中Bacillus Sp.DG24的生物量遠低于LB液體培養(yǎng)中該菌的生長量，為滿足批量實驗對菌體的需求，需要研發(fā)一種既能保持Bacillus SP.DG24高效原油降解性又能同時獲得大量菌體的富集培養(yǎng)方法。具體操作為:每次實驗前吸取4°C保存的乳化原油液體培養(yǎng)基或直接從培養(yǎng)好的乳化原油液體培養(yǎng)基下層水相液體50-100 μ I接入LB液體培養(yǎng)基中，于10°C條件下置于搖床中培養(yǎng)，一般搖床條件設(shè)為150r/min,培養(yǎng)2d后,這樣保證Bacillus sp.DG24進入對數(shù)生長期，且生物量達到最大,離心收集菌體,并用滅菌無機鹽液體培養(yǎng)基清洗菌體,一般清洗3-5遍后，將菌體重懸于無機鹽液體培養(yǎng)基中，菌體密度控制在A_為1.5-2.0,置于4°C條件下待用。
[0056]Bacillus sp.DG24菌在降解原油中的應(yīng)用:
[0057]本發(fā)明還涉及Bacillus sp.DG24在降解原油中的應(yīng)用，最佳降解溫度為10_30°C;另外，在低溫條件下降解原油的應(yīng)用中，優(yōu)選在IO V條件下進行降解。
[0058]在10°C條件下對原油降解的最佳環(huán)境條件為:pH6.0-8.0 ;鹽度(NaCl)0.5-1.5% ；原油與磷元素質(zhì)量比W(原油):W(P)為10:1?40:1 ;原油與氮元素質(zhì)量比W(原油):W(N)為5:1?20:1，原油的濃度為100?2000mg.?Λ優(yōu)選100?800mg.L'
[0059]在降解原油的應(yīng)用中，原油濃度為100?2000mg.1時，石油烴的降解速率范圍可達到為 1.76 ?20.78mg.I71.cf1。
[0060]Bacillus sp.DG24在降解原油中的應(yīng)用，降解原油中的石油烴，優(yōu)選飽和烷烴組分，優(yōu)選中長鏈的飽和烷烴組分，優(yōu)選碳原子數(shù)為十二至二十八范圍內(nèi)的飽和烷烴，例如正十二烷至正二十八烷范圍內(nèi)的飽和烷烴，進一步優(yōu)選中鏈飽和烷烴，如正十二烷、正十四烷、正十六烷、正十八烷、正十九烷，最優(yōu)選正十二烷和正十四烷。
[0061]Bacillus sp.DG24菌在石油污染生物修復(fù)的應(yīng)用:
[0062]Bacillus sp.DG24對水體或土壤石油污染生物修復(fù)中的應(yīng)用，該修復(fù)應(yīng)用優(yōu)選在10-30°C條件下，在25°C效果最佳，然而10°C也能達到令人滿意的效果。
[0063]10°C條件下，在土壤石油污染生物修復(fù)中能被降解的原油的濃度為3000?30000mg.kg'此時石油烴降解率為15.18%?50.52%,降解速率達到0018?
0.055g.kg-1.cf1。
[0064]以下結(jié)合具體實施例來對本發(fā)明做進一步說明。
[0065]實施例
[0066]實施例1Bacillus sp.DG24的分離與馴化
[0067]現(xiàn)場采集天津大港油田油井附近受污染土壤，以原油為唯一碳源，采用無機鹽液體培養(yǎng)基母液經(jīng)無菌水稀釋定容，添加原油而成。
[0068]無機鹽(IOX)液體培養(yǎng)基母液(超純水溶液):4g Na2HPO4,1.5g KH2PO4, IgNH4Cl，0.5g MgSO4.7Η20，0.015g CaCl2, Ig NaNO3,0.0lg FeSO4.7Η20，超純水定容至 1000ml ；
[0069]無機鹽液體培養(yǎng)基:無機鹽液體培養(yǎng)基母液(IOX ) 100ml,另加入微量元素Iml(100ml 純水加入 0.5mg CuSO4.5H20, 1.0mg H3BO3, 1.0mg MnSO4.5H20, 7.0mg ZnSO4 配制得到)，以超純水定容至1000ml，利用0.2M氫氧化鈉或者0.1M鹽酸調(diào)節(jié)pH=7.0 ；
[0070]原油無機鹽含液體培養(yǎng)基:無機鹽液體培養(yǎng)基1000ml, Ig滅菌原油。
[0071]原油無機鹽含油廢水固體培養(yǎng)基成分為:原油無機鹽液體培養(yǎng)基1000ml，加入瓊脂15g，固體培養(yǎng)基表面均勻涂30 μ I滅菌原油。
[0072]本發(fā)明專利申請書中“菌液”指馴化過程中，石油污染土樣加入到生理鹽水中振蕩一定時間，靜置后的上清液，包含土壤中的微生物?！鞍l(fā)酵液”是指將Bacillus sp.DG24加入到原油無機鹽液體培養(yǎng)基中，對發(fā)生乳化現(xiàn)象的水相液體的稱呼。
[0073]馴化步驟:在滅菌100ml三角瓶中加入滅菌生理鹽水100ml，然后加入Ig的石油污染土樣，于10°C，在150r/min條件下置于搖床中振蕩約4h，取出三角瓶靜置分層后，吸取Iml菌懸液接入裝有100mL “原油無機鹽液體培養(yǎng)基”的250mL錐形瓶中，每種液體培養(yǎng)基做三個重復(fù)。10°C，在150r/min條件下置于搖床中培養(yǎng)15d ;然后取5ml的上述培養(yǎng)基中的發(fā)酵液接入裝有100mL相應(yīng)原油液體培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，同等溫度條件下繼續(xù)培養(yǎng)15d,連續(xù)重復(fù)5次同等實驗。
[0074]分離與純化步驟:第5次馴化后的“原油無機鹽液體培養(yǎng)基”水相發(fā)酵液進行梯度稀釋(10-3、10-6、10-9)，分別吸取50ul發(fā)酵液涂布至相應(yīng)的原油固體馴化培養(yǎng)基上，用進口封口膜將培養(yǎng)皿封閉后，培養(yǎng)皿倒置(培養(yǎng)基成分朝上)放于培養(yǎng)箱中10°C培養(yǎng)15天。培養(yǎng)后得到數(shù)量不同的菌落平板，選取濃度均勻、可分辨的平板，即稀釋梯度為10-6的平板，用接種環(huán)沾取平板上的菌落(多種)溶解于滅菌水中，再吸取適量菌懸液劃線至原油無機鹽固體培養(yǎng)基中。用進口封口膜將培養(yǎng)皿封閉后，培養(yǎng)皿倒置(培養(yǎng)基成分朝上)放于培養(yǎng)箱中10°C培養(yǎng)15天后，得到多種單一純菌落。
[0075]分別將得到的多種單一純菌落再經(jīng)過5代原油無機鹽液體培養(yǎng)基馴化，在原油無機鹽固體培養(yǎng)基中劃線培養(yǎng)，得到多株純菌，將純菌經(jīng)接種至原油無機鹽液體培養(yǎng)基中驗證其降解石油的能力。最終得到了一株高效石油降解菌，Bacillus sp.DG24,該菌屬于臘狀芽孢桿菌。
[0076]本實施例表明分離所得的Bacillus sp.DG24可在低溫環(huán)境下利用石油作為唯一碳源和能源進行生長繁殖。
[0077]實施例2Bacillus sp.DG24的保存及富集培養(yǎng)方法
[0078]試驗例2-1原油降解菌Bacillus sp.DG24的保存方法
[0079]原油無機鹽液體培養(yǎng)基組分:每IOOOml含0.4g Na2HPO4,0.15g KH2PO4,0.1gNH4Cl, 0.05g MgSO4.7Η20，0.0015g CaCl2,0.1g NaNO3,0.0Olg FeSO4.7Η20，微量元素Iml (100ml 純水中加入 0.5mg CuSO4.5H20, 1.0mg H3BO3, 1.0mg MnSO4.5H20, 7.0mg ZnSO4配制得到)，超純水定容至1000ml，用2mol.L-1HCl或2mol.L-1HCl調(diào)節(jié)無機鹽液體培養(yǎng)基的PH為7.0，0.1g滅菌原油。
[0080]乳化原油液體培養(yǎng)基:用滅菌接種環(huán)挑取純化又反復(fù)馴化5次的在原油無機鹽固體培養(yǎng)基中劃線培養(yǎng)的BaciIIus sp.DG24菌落接入原油無機鹽液體培養(yǎng)基中，放于培養(yǎng)箱中10°C培養(yǎng)15天，此時培養(yǎng)基水相呈棕色，原油發(fā)生乳化現(xiàn)象，并有大小不等的原油油滴分散在水相中，將發(fā)生乳化現(xiàn)象的原油液體培養(yǎng)基稱之為乳化原油液體培養(yǎng)基。
[0081]將上述已發(fā)生乳化現(xiàn)象的原油液體培養(yǎng)基(含Bacillus sp.DG24菌體)置于4°C條件下保存，每隔45天吸取乳化原油液體培養(yǎng)基下層水相IOml接入新鮮已滅菌且還沒有加入降解菌的原油液體培養(yǎng)基中按馴化方法進行操作，15天后將發(fā)生乳化現(xiàn)象的原油液體培養(yǎng)基置于4°C條件下再次保存。
[0082]試驗例2-2原油降解菌Bacillus sp.DG24的富集培養(yǎng)方法
[0083]LB液體培養(yǎng)基:酵母浸粉5g，蛋白胨10g，NaC15g，蒸餾水定容至1000ml，pH7.0。
[0084]吸取在上述保存步驟中保存在4°C條件下的乳化原油液體培養(yǎng)基下層水相液體50 μ 1接入LB液體培養(yǎng)基中，于10°C、150r/min條件下置于搖床中培養(yǎng)2d。之后，在無菌操作臺中將含有DG24菌體的LB液體培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至已滅菌離心管中，離心收集菌體，并用滅菌無機鹽液體培養(yǎng)基清洗菌體5遍后，將菌體重懸于無機鹽液體培養(yǎng)基中，菌體密度控制在A600為1.6，置于4°C條件下待用。
[0085]實施例3Bacillus sp.DG24對原油降解的最適環(huán)境條件
[0086]通過設(shè)置不同鹽度、不同pH、不同的溫度,確定Bacillus sp.DG24降解原油的最適環(huán)境條件。
[0087]試驗例3-1鹽度對Bacillus sp.DG24降解原油的影響
[0088]LB液體培養(yǎng)基:酵母浸粉5g，蛋白胨10g，NaC15g，蒸餾水定容至1000ml，pH7.0-7.2。
[0089]原油儲備液(20000mg.L-1):在150ml磨口三角瓶中加入2g原油，之后定量加入IOOml色譜級二氯甲烷，并用封口膜密封瓶口，緩慢搖勻后置于4°C冰箱待用。
[0090]NaCl標(biāo)準(zhǔn)儲備液(30%NaCl):在盛有IOOml無菌水的250ml三角瓶中加入30gNaCl，用玻璃棒攪拌均勻后待用。
[0091]無機鹽液體培養(yǎng)基成分:0.4g Na2HPO4,0.15g KH2PO4,0.1gNH4Cl70.05gMgSO4.7Η20，0.0015g CaCl2,0.1g NaNO3,0.0Olg FeSO4.7Η20，微量元素 1ml (100ml 純水加Λ 0.5mg CuSO4.5H20, 1.0mg H3BO3, 1.0mg MnSO4.5H20, 7.0mg ZnSO4 配得)，超純水定容至1000ml，用2mol.T1HCl或2mol.L4NaOH調(diào)節(jié)無機鹽液體培養(yǎng)基的pH為7.0。
[0092]從乳化原油液體培養(yǎng)基中吸取IOml下層水相液體(含Bacillus sp.DG24菌體)接入滅菌的含250mlLB培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，于10°C，在150r/min條件下置于搖床中培養(yǎng)48h后，Bacillus sp.DG24的生長進入對數(shù)生長期。在無菌操作臺中將含有Bacillussp.DG24菌體的LB培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至滅菌離心管中離心分離收集菌體，用滅菌無機鹽培養(yǎng)基清洗菌體3遍后，將菌體重懸于滅菌無機鹽液體培養(yǎng)基中，菌體密度控制在A_為1.6，置于4 °C冰箱待用。
[0093]分別在一系列250mL三角瓶中加入0、2.5,5,12.5、25mLNaCl標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用無機鹽液體培養(yǎng)基定容至150ml，控制培養(yǎng)基鹽度分別為0%、0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、5%。121 °C高溫滅菌30min，冷卻后在含有150mL無機鹽液體培養(yǎng)基的三角瓶中加入用微孔濾膜過濾的原油標(biāo)準(zhǔn)儲備液，初始原油濃度控制在2000mg噸' 待二氯甲烷揮發(fā)后，按照5%(v/V)的接種量加入前述滅菌無機鹽液體培養(yǎng)基重懸的菌體DG24，初始菌體密度A600為0.13。將培養(yǎng)基于10°C，在150r/min條件下置于搖床中培養(yǎng)35d后，用二氯甲烷:丙酮為3:1的有機溶劑萃取原油，并用重量法分析石油烴降解率。
[0094]石油烴降解率的測定方法采用重量法，具體而言，石油烴的測量方法為:用二氯甲烷:丙酮為3:1的有機溶劑萃取溶液中的石油烴，多次萃取且每次加入50ml萃取劑，萃取液置于已知重量的恒重?zé)蹈珊笾亓糠y定總石油烴(TPH)含量(G總)，石油烴降解率
即(G空白_G總)/G空。
[0095]如表I所示，本試驗例表明，培養(yǎng)基鹽度分別為0%、0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、5%時，Bacillus sp.DG24對石油烴的生物降解率分別為20.58±2.72%、33.63±3.28%、45.55±2.58%,42.75±4.25%,21.24±3.82%、12.57±2.64%,6.36±4.11%和 0%。BacillusSP.DG24在低鹽度條件下可發(fā)揮對原油的生物利用作用，而在高鹽度環(huán)境中，其對石油烴類物質(zhì)的生物利用作用受到限制，最適鹽度條件為0.5-1.5%。
[0096]表I不同鹽度下Bacillus sp.DG24對石油烴的降解率
[0097]
【權(quán)利要求】
1.一株耐低溫石油降解菌,Bacillus sp.DG24菌,屬于芽孢桿菌屬,保藏編號為CGMCCN0.5051。
2.Bacillus sp.DG24菌的培養(yǎng)方法，包括以下步驟:(1)馴化步驟將石油污染土樣利用生理鹽水溶解，搖床振蕩后靜置分層，將菌懸液接入原油無機鹽液體培養(yǎng)基中，在10°C搖床培養(yǎng)10-15天，后取下層含有菌體的發(fā)酵液轉(zhuǎn)接至原油無機鹽液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)10-15天，如此反復(fù)進行3-5次；(2)分離及純化步驟吸取定量步驟(I)繼續(xù)培養(yǎng)所得原油無機鹽液體培養(yǎng)基中的發(fā)酵液，進行梯度稀釋，涂布至原油無機鹽固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)8-15天后，觀察培養(yǎng)基菌落數(shù)量，選擇數(shù)量適中的培養(yǎng)基，進行劃線培養(yǎng)；(3)反復(fù)馴化、劃線培養(yǎng)反復(fù)馴化、劃線培養(yǎng)，直至得到多株純菌。
3.如權(quán)利要求2所述的菌的培養(yǎng)方法，步驟(I)所用原油無機鹽液體培養(yǎng)基，每IOOOml培養(yǎng)基液體中含:0.4g Na2HPO4,0.15g KH2PO4,0.1gNH4Cl, 0.05g MgSO4.7Η20，0.0015gCaCl2,0.1g NaNO3,0.0Olg FeSO4.7Η20，ImL微量元素，其中微量元素由每IOOmL純水中加入0.5mg CuSO4.5H20, 1.0mg H3BO3, 1.0mg MnSO4.5H20, 7.0mg ZnSO4 配制得到，其中，1000ml培養(yǎng)基液體還包括0.5?2g滅菌原油，優(yōu)選lg。
4.如權(quán)利要求2或3所述的菌的培養(yǎng)方法，步驟(2)所用原油無機鹽固體培養(yǎng)基由下述方法得到:在每 IOOOml 由 0.4g Na2HPO4,0.15g KH2PO4,0.1gNH4Cl, 0.05g MgSO4.7H20，0.0015g CaCl2,0.1g NaNO3,0.0Olg FeSO4.7Η20，ImL微量元素組成的培養(yǎng)基液體中，其中微量兀素由每 IOOmL 純水中加入 0.5mg CuSO4.5H20, 1.0mg H3BO3, 1.0mg MnSO4.5H20, 7.0mgZnSO4配制得到，另外加入15?20g瓊脂，再在培養(yǎng)基表面均勻涂20?30 μ I滅菌原油。
5.如權(quán)利要求4所述的菌的培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟(3)之后，還包括保存步驟，具體為:將含Bacillus sp.DG24菌體的乳化原油無機鹽液體培養(yǎng)基，置于4°C條件下保存，每隔40-50天吸取該乳化原油液體培養(yǎng)基下層水相10-20ml接入新鮮已滅菌且還沒有加入降解菌的原油無機鹽液體培養(yǎng)基中按馴化方法進行操作，10-15天后將發(fā)生乳化現(xiàn)象的原油液體培養(yǎng)基置于4°C條件下再次保存；所述乳化原油液體培養(yǎng)基通過下述方法得到:用滅菌接種環(huán)挑取反復(fù)純化馴化后在原油無機鹽固體培養(yǎng)基中劃線培養(yǎng)的Bacillus sp.DG24菌落接入原油無機鹽液體培養(yǎng)基中，放于培養(yǎng)箱中10°C培養(yǎng)。
6.如權(quán)利要求5所述的菌的培養(yǎng)方法，其特征在于，保存步驟之后，還包括富集培養(yǎng)步驟，具體為:吸取保存步驟所得的保存在4°C的乳化原油液體培養(yǎng)基下層水相液體50-100 μ I接入LB液體培養(yǎng)基中，于10°C條件下置于搖床中培養(yǎng)，在無菌操作臺中將含有Bacillus sp.DG24菌體的LB液體培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至已滅菌離心管中，離心收集菌體，并用滅菌無機鹽液體培養(yǎng)基清洗菌體，將菌體重懸于無機鹽液體培養(yǎng)基中置于4°C條件下待用。
7.Bacillus sp.DG24菌在降解原油中的應(yīng)用，在10_30°C溫度下進行；在10°C條件下，降解環(huán)境的PH優(yōu)選為6.0-8.0,以NaCl計的鹽度優(yōu)選為0.5-1.5%，原油和磷元素質(zhì)量比W(原油):W(P)優(yōu)選為10:1?40:1，原油和氮元素質(zhì)量比W(原油):W(N)優(yōu)選為5:1?20:1，原油的濃度優(yōu)選為100?2000mg.L—1，更優(yōu)選100?800mg.L'
8.如權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，降解所述原油中的石油烴，優(yōu)選降解飽和烷烴，更優(yōu)選中長鏈飽和烷烴，優(yōu)選碳原子數(shù)在十二到二十八范圍內(nèi)的飽和烷烴，更優(yōu)選中鏈飽和烷烴，進一步優(yōu)選正十二烷烴、正十四烷、正十六烷、正十八烷或正十九烷，最優(yōu)選正十二烷和正十四烷。
9.如權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，原油的濃度為100?2000mg.1時，石油烴的降解速率為 1.76 ?20.78mg.L-1.cf1。
10.Bacillus sp.DG24菌在土壤或水體石油污染的生物修復(fù)中的應(yīng)用，其中，在10-30°C溫度下進行修復(fù)。
11.如權(quán)利要求10所述的應(yīng)用，在10°C條件下，土壤中的石油污染的生物修復(fù)中的條件為:原油的濃度為3000?30000mg.kg'
12.如權(quán)利要求11所述的應(yīng)用，原油的濃度為3000?30000mg.kg—1時，石油烴降解率為 15.18% ?50.52%,降解速率達到 0018 ?0.055g.kg-1.cf1。
【文檔編號】C02F3/34GK103436464SQ201310286666
【公開日】2013年12月11日 申請日期:2013年7月9日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月9日
【發(fā)明者】王紅旗, 花菲, 趙一村 申請人:北京師范大學(xué)