短小芽孢桿菌及其培養(yǎng)方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種短小芽孢桿菌(Bacilius.Pumilus)LX11菌株，及其培養(yǎng)方法和應(yīng)用，本發(fā)明提供的短小芽孢桿菌LX11菌株在防治花生根腐病、白絹病和莖腐病上顯著效果，不但對(duì)病原菌有明顯的拮抗作用，而且在盆栽和田間防治花生病害方面效果顯著。
【專利說(shuō)明】短小芽孢桿菌及其培養(yǎng)方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物菌種【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其是一種短小芽孢桿菌，及該短小芽孢桿菌的培 養(yǎng)方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]花生根腐病在世界范圍內(nèi)普遍發(fā)生，是危害最大，最難防治的一種土傳病害。近年來(lái)，該病害在世界各花生主產(chǎn)區(qū)呈擴(kuò)大蔓延趨勢(shì)，在我國(guó)北方花生產(chǎn)區(qū)也連年加重。2006年，該病害在河北省行唐縣、新樂(lè)市、大名縣和定州市，河南省濮陽(yáng)市，山東省青島市、日照市、臨沂市、泰安市大面積發(fā)生，重病田發(fā)病率超過(guò)50% ；2009年在北方花生產(chǎn)區(qū)大流行，造成花生大幅減產(chǎn)，山東省莒南縣、莒縣部分地塊甚至絕產(chǎn)。由于花生根腐病是由多種真菌引起，不同地區(qū)不同年際間優(yōu)勢(shì)種不同，山東省臨沂地區(qū)優(yōu)勢(shì)種為鐮刀菌、腐霉菌和色二孢菌；青島地區(qū)為絲核菌、鐮刀菌，部分年份核盤(pán)菌發(fā)生嚴(yán)重；河北省主要是鐮刀菌和腐霉菌，近幾年花生白絹病發(fā)生嚴(yán)重；河南省主要是色二孢菌和鐮刀菌；廣東省為色二孢菌和鐮刀菌，近幾年部分地區(qū)花生黑腐病危害加重；湖北省是是鐮刀菌、絲核菌和黑曲霉菌。由于引起花生根腐病病原菌種類繁多，部分地區(qū)甚至沒(méi)有搞清花生根腐病病原，因此防治非常困難。
[0003]花生白絹病是一種分布廣泛的土傳真菌病害(孟憲曾，1982;劉錫若等，1983)，其病原菌為齊整小核菌(SclerotiumrolfiiSacc.)屬半知菌小核菌屬，沒(méi)有有性抱子，從培養(yǎng)中可產(chǎn)生無(wú)性時(shí)期。該病菌以菌核形式在土壤、病株殘?bào)w或在多年生植物寄主的莖基部越冬，菌絲也可以在土表病株殘?bào)w上腐生，花生的種子及種殼也可帶菌傳病。該病在世界各大花生產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生，尤以溫暖地區(qū)更為嚴(yán)重。在南方的花生產(chǎn)區(qū)發(fā)生較多。近幾年來(lái)，由于耕作制度的改變，高產(chǎn)新品種的推廣應(yīng)用，帶來(lái)了田間小氣候的顯著變化，使花生白絹病由零星發(fā)生發(fā)展到分布逐年擴(kuò)大，引起的危害也有逐漸加重的趨勢(shì)(董煒博等，2001)，現(xiàn)在該病害已成為北方花生生產(chǎn)上重要病害；2004年山東省臨沂市大田調(diào)查，一些地塊平均病株率為67.3%，病情指數(shù)為56.8，而且其危害有逐漸加重的趨勢(shì)(卞建波，2007)。
[0004]花生莖腐病分布廣泛，國(guó)內(nèi)各花生產(chǎn)區(qū)也均有報(bào)道，其中以山東、河南、河北、陜西、安徽、湖北、江蘇、海南等花生產(chǎn)區(qū)發(fā)病較為嚴(yán)重。近幾年來(lái)該病害發(fā)生呈上升趨勢(shì)，尤其是重茬地塊，表現(xiàn)尤為突出。據(jù)2004年在河北省定州市調(diào)查，一般發(fā)病地塊病株率15~20%，重者達(dá)到50%以上，引起整株死亡，造成花生缺苗斷壟，甚至成片死亡，顆粒無(wú)收。近年來(lái)，該病害在部分花生產(chǎn)區(qū)發(fā)生逐年加重，成為花生上一重要病害。據(jù)調(diào)查統(tǒng)計(jì)，2001~2003年，安徽省阜陽(yáng)地區(qū)發(fā)病田塊占89.6%,病株率輕的在10%~20%，嚴(yán)重的可達(dá)60%以上，甚至成片死亡，顆粒無(wú)收。
[0005]目前，主要采用化學(xué)藥劑拌種和灌根的方法防治花生根腐病、白絹病和莖腐病等土傳病害，拌種對(duì)花生苗期土傳病害有一定防效，但對(duì)后期發(fā)生土傳病害基本無(wú)效。灌根對(duì)后期發(fā)生土傳病害防治效果也甚微，且污染嚴(yán)重，使相當(dāng)一部分花生及其產(chǎn)品農(nóng)藥殘留嚴(yán)重超標(biāo)。
[0006]生物防治在一定程度上克服了化學(xué)防治的弊端，研究發(fā)現(xiàn)該方法對(duì)部分土傳病害經(jīng)濟(jì)而有效，因而成為防治土傳病害研究的熱點(diǎn)，越來(lái)越受到人們的重視。國(guó)外研究生防菌劑較早，1973年，美國(guó)、澳大利亞、新西蘭、希臘等國(guó)的研究人員利用放射土壤桿菌針對(duì)植物根癌病進(jìn)行研究，效果顯著，并實(shí)現(xiàn)了商品化。最近幾年，美國(guó)、阿根廷、印度、泰國(guó)等國(guó)科學(xué)家篩選大量生防菌株，并在生產(chǎn)上用于防治花生根腐??；D0rner等從90年代開(kāi)始篩選不產(chǎn)毒黃曲霉和寄生曲霉菌株競(jìng)爭(zhēng)抑制產(chǎn)毒黃曲霉菌株，達(dá)到抑制產(chǎn)毒菌株進(jìn)一步侵染作物的效果，在花生中，接種不產(chǎn)毒的寄生曲霉菌株可使食品級(jí)花生的黃曲霉毒素減少83%~98%,同時(shí)可使花生儲(chǔ)存過(guò)程中顯著降低黃曲霉毒素污染幾率。我國(guó)研究花生生防菌劑較晚，但發(fā)展較快。封海勝等(1996)報(bào)道了微生物菌劑對(duì)花生的增產(chǎn)作用，并對(duì)減輕或解除花生連作障礙有一定作用；涂顯平(2000)研究在花生連作的旱地中施用酵素菌，使青枯病、根腐病等幾種主要病害的綜合發(fā)病率由10.94%下降到2.25% ;徐秀娟(2003)、黃亞麗(2006)和劉登望(2006)等報(bào)道應(yīng)用木霉菌拌種防治由絲核菌、鐮孢菌引起花生根腐病均效果明顯，且能顯著提高花生出苗率和成苗率。
[0007]山東省花生研究所多年來(lái)一直進(jìn)行花生生物防治研究，篩選出對(duì)花生病害防治效果較好菌株20多株，其中以篩選的側(cè)孢芽孢桿菌LX12 (菌種保藏編號(hào)為CGMCC N0.7420)對(duì)花生根腐病防效最好，該菌株活力強(qiáng)，繁殖快，耐高溫，耐酸堿，在PH5.0-9.0的條件下仍能存活，且對(duì)花生根結(jié)線蟲(chóng)病有一定防效。我們對(duì)該菌株進(jìn)行發(fā)酵條件和培養(yǎng)基優(yōu)化，篩選優(yōu)良載體，經(jīng)載體吸附后制成菌劑。2011和2012年在山東省青島市、臨沂市和泰安市進(jìn)行田間應(yīng)用，制成的菌劑對(duì)根腐病有較好的防治效果，防效接近60%，得到農(nóng)技部門(mén)、科研人員和農(nóng)民的一致認(rèn)可。
[0008]但是現(xiàn)有的生防菌劑在應(yīng)用過(guò)程中存在防效不穩(wěn)定、起效速度慢、作用時(shí)間長(zhǎng)、難以抵抗環(huán)境因素影響等多種問(wèn)題`，使得微生物菌劑的發(fā)展受到阻礙，選擇新劑型、新助劑，延長(zhǎng)活性成分的保質(zhì)期，是目前亟待解決的問(wèn)題。針對(duì)這些不足，國(guó)內(nèi)已進(jìn)行非水性劑的開(kāi)發(fā)、紫外光保護(hù)劑的應(yīng)用、增效劑的開(kāi)發(fā)以及各種劑型的研制等工作。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提出一種短小芽孢桿菌，作用于花生根際生態(tài)環(huán)境，具有很好的防治花生土傳病害能力。
[0010]為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案:一種短小芽孢桿菌(Bacilius.Pumilus) LXll菌株，2013年4月7日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，保藏號(hào)為CGMCC N0.7419。
[0011]一種如上所述短小芽孢桿菌LXll菌株的培養(yǎng)方法，包括以下步驟:
[0012]⑴取花生根際土壤放入蒸餾水中，搖動(dòng)片刻，吸取上層液加入到無(wú)菌水中，制成懸液；
[0013]⑵取步驟⑴土壤懸濁液滴加到含2~5%利福平的LB固體培養(yǎng)基平板上，用涂布棒均勻涂布，并將培養(yǎng)基倒置于28°C恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)I~2天。
[0014]優(yōu)選的，所述LB固體培養(yǎng)基的配方為:胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化鈉10g/L和瓊脂粉15g/L。[0015]優(yōu)選的，步驟⑵培養(yǎng)后的菌置于LB固體培養(yǎng)基平板上，畫(huà)線倒置于28°C恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)I~2天。
[0016]如上所述短小芽孢桿菌LXll菌株在防治花生病害方面的應(yīng)用。
[0017]優(yōu)選的，包括抑制花生根腐病菌、花生白絹病菌及花生莖腐病菌的作用。
[0018]優(yōu)選的，包括以下步驟:
[0019]①.LXll菌株的培養(yǎng):取花生根際土壤放入蒸餾水中，搖動(dòng)片刻，吸取上層液加入到無(wú)菌水中，制成懸液；取土壤懸濁液滴加到含2~5%利福平的LB固體培養(yǎng)基平板上，用涂布棒均勻涂布，并將培養(yǎng)基倒置于28°C恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)I~2天；
[0020]②.真菌的培養(yǎng):在無(wú)菌操作臺(tái)中將花生根腐病菌、花生白絹病菌及花生莖腐病菌用鑷子取約0.5cmX0.5cm的正方形小塊接種至PDA培養(yǎng)基中，于28°C溫室中倒置培養(yǎng)3天;
[0021]③.接種:待步驟②真菌長(zhǎng)至約占培養(yǎng)皿1/3大小時(shí)在距離真菌I~2c處接種細(xì)菌，繼續(xù)放置28攝氏度溫室培養(yǎng)2~3天。
[0022]優(yōu)選的，所述PDA培養(yǎng)基組成為:馬鈴薯300克、葡萄糖20克、瓊脂15~20克和自來(lái)水1000毫升，pH值自然。
[0023]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的短小芽孢桿菌LXll菌株在防治花生根腐病、白絹病和莖腐病上顯著效果，不但對(duì)病原菌有明顯的拮抗作用，而且在盆栽和田間防治花生病害方面療效顯著。
【具體實(shí)施方式】
[0024] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述，本部分的描述僅是示范性和解釋性，不應(yīng)對(duì)本發(fā)明的保護(hù)范圍有任何的限制作用。
[0025]實(shí)施例1短小芽孢桿菌LXl I菌株培養(yǎng)和分離
[0026]LB固體培養(yǎng)基的配方為:胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化鈉10g/L和瓊脂粉15g/L，121°C滅菌15min后備用。
[0027]培養(yǎng)方法:稱取5g花生根際土壤放入45ml蒸餾水的三角瓶中，搖動(dòng)片刻，吸取上層液0.1ml加入到含有4.5ml無(wú)菌水試管中，制成1: 100濃度的懸液，然后分別吸取10_2和10_3 土壤懸濁液各0.2ml滴加到含利福平的LB固體培養(yǎng)基平板上，用涂布棒均勻涂布，并將培養(yǎng)基倒置于28°C恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)I~2天。
[0028]分離菌株:挑取平板上的一批單菌落于LB固體培養(yǎng)基平板上畫(huà)線倒置于28°C恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)I~2天。
[0029]實(shí)施例2LX11菌株的鑒定
[0030]⑴、菌株DNA提取:
[0031]參考照TIANGEN TIANampBACTERia DNA Kit試劑盒提取實(shí)施例中LXll菌株的總DNA，其步驟如下:
[0032]1.取細(xì)菌培養(yǎng)液lmL，1000Orpm離心lmin，盡量吸凈上清；
[0033]2.向菌體沉淀中加入200 μ L緩沖液GA，震蕩至菌體徹底懸??；
[0034]3.加入 4 μ LRNAase (100mg/mL)溶液，震蕩 15s,室溫放置 5min ；
[0035]4.向管中加入20 μ L蛋白酶K溶液，混勻；[0036]5.加入220yL緩沖液GB，震蕩15s，70°C放置lOmin，簡(jiǎn)短離心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠；
[0037]6.加入220 μ L無(wú)水乙醇，充分震蕩混勻15s，此時(shí)可能出現(xiàn)絮狀沉淀，簡(jiǎn)短離心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠；
[0038]7.將上一步所得的溶液和絮狀沉淀都加入一個(gè)吸附柱GB3中(吸附柱放入收集管中)，12000rpm離心30s，倒掉廢液將吸附柱CB3中放入收集管中；
[0039]8.向吸附柱CB3中放入500yL緩沖液⑶(使用前檢查是否加收入無(wú)水乙醇)，12000rpm離心30s，倒掉廢液將吸附柱CB3中放入收集管中；
[0040]9.向吸附柱CB3中放入700yL漂洗液PW (使用前檢查是否加收入無(wú)水乙醇)，12000rpm離心30s，倒掉廢液將吸附柱CB3中放入收集管中；
[0041]10.向吸附柱CB3中放入500 μ L漂洗液PW，12000rpm離心30s，倒掉廢液將吸附柱CB3中放入收集管中；
[0042]11.將吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm離心2min，倒掉廢液，將吸附柱CB3置于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液；
[0043]12.將吸附柱CB3轉(zhuǎn)入干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加50-200 μ L洗脫緩沖液TE，室溫放置2-5min，12000rpm離心2min，將溶液收集到離心管中，_20°C保存。
[0044](2)、PCR與序列測(cè)定:`[0045]將上述提取的DNA 參照 TaKaRa 公司的 16s rDNA Bacterial Identification PCRKit試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中正向引物為:5 ’ -AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3 ’，反向引物為:3’ -CGCTTACCTTGTTACGACTT-5’。PCR 擴(kuò)增條件如下:94°C預(yù)變性 5min ;94°C變性Imin ;53°C退火Imin ;72°C延伸90s ;72°C后延伸5min，共30個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物采用1%瓊脂糖凝膠電泳分離，EB染色后置于3UVTMTransilluminator (UVP，USA)下進(jìn)行觀察。
[0046]根據(jù)預(yù)先設(shè)計(jì)的引物與預(yù)期擴(kuò)增片段大小，結(jié)合Marker，目的片段在紫外燈下切割下來(lái)，用回收試劑盒Silica Bead DNA GelExtraction Kit進(jìn)行DNA的回收。16s rDNA序列測(cè)定由寶生物工程(大連)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。通過(guò)BLAST程序?qū)y(cè)定的序列與GenBank (NCBI,網(wǎng)站 http://blast, ncb1.nlm.nih.gov/Blast.cgi)中的序列比較，然后從GenBank中獲得和試驗(yàn)菌株序列相近種、屬的16s rDNA序列進(jìn)行確定。
[0047]完整序列為:
[0048]GGGAGGCGGCGTGCTATACATGCAGTCGAGCGGACAGAAGGGAGCTTGCTCCCGGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGAGCTAATACCGGATAGTTCCTTGAACCGCATGGTTCAAGGATGAAAGACGGTTTCGGCTGTCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGGGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCGAGAGTAACTGCTCGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGC
【權(quán)利要求】
1.一種短小芽孢桿菌(Bacilius.Pumilus)LXll菌株,2013年4月7日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，保藏號(hào)為 CGMCC N0.7419。
2.一種如權(quán)利要求1所述短小芽孢桿菌LXll菌株的培養(yǎng)方法，包括以下步驟: ⑴取花生根際土壤放入蒸餾水中，搖動(dòng)片刻，吸取上層液加入到無(wú)菌水中，制成懸液； ⑵取步驟⑴土壤懸濁液滴加到含2~5%利福平的LB固體培養(yǎng)基平板上，用涂布棒均勻涂布，并將培養(yǎng)基倒置于28°C恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)I~2天。
3.如權(quán)利要求2所述培養(yǎng)方法，其特征在于:所述LB固體培養(yǎng)基的配方為:胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化鈉10g/L和瓊脂粉15g/L。
4.如權(quán)利要求2所述培養(yǎng)方法，其特征在于:步驟⑵培養(yǎng)后的菌置于LB固體培養(yǎng)基平板上，畫(huà)線倒置于28°C恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)I~2天。
5.如權(quán)利要求1所述短小芽孢桿菌LXll菌株在防治花生病害方面的應(yīng)用。
6.如權(quán)利要求5所述應(yīng)用，其特征在于:包括抑制花生根腐病菌、花生白絹病菌及花生莖腐病菌的作用。
7.如權(quán)利要求6所述應(yīng) 用，包括以下步驟: ①.LXll菌株的培養(yǎng):取花生根際土壤放入蒸餾水中，搖動(dòng)片刻，吸取上層液加入到無(wú)菌水中，制成懸液；取土壤懸濁液滴加到含2~5%利福平的LB固體培養(yǎng)基平板上，用涂布棒均勻涂布，并將培養(yǎng)基倒置于28°C恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)I~2天； ②.真菌的培養(yǎng):在無(wú)菌操作臺(tái)中將花生根腐病菌、花生白絹病菌及花生莖腐病菌用鑷子取約0.5cmX0.5cm的正方形小塊接種至PDA培養(yǎng)基中，于28°C溫室中倒置培養(yǎng)3天； ③.接種:待步驟②真菌長(zhǎng)至約占培養(yǎng)皿1/3大小時(shí)在距離真菌I~2cm處接種細(xì)菌，繼續(xù)放置28攝氏度溫室培養(yǎng)2~3天。
8.如權(quán)利要求7所述應(yīng)用，其特征在于:所述PDA培養(yǎng)基組成為:馬鈴薯300克、葡萄糖20克、瓊脂15~20克和自來(lái)水1000毫升，pH值自然。
【文檔編號(hào)】C12R1/07GK103725637SQ201410020058
【公開(kāi)日】2014年4月16日 申請(qǐng)日期:2014年1月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月16日
【發(fā)明者】遲玉成, 許曼琳, 黃志明, 孫春龍, 王麗寧, 王學(xué)武, 袁宗英, 劉愛(ài)娜, 吳菊香, 許婷婷, 謝宏峰, 陳殿緒, 焦坤, 袁美 申請(qǐng)人:山東省花生研究所, 青島力力惠生物科技有限公司, 青島市植物保護(hù)站