:MethodsandProtocols(轉(zhuǎn)基因植物：方法和 方案）（LeandroPena編，胡馬納出版社（HumanaPress)第一版，2004);和Agrobacterium Protocols(農(nóng)桿菌屬實(shí)驗(yàn)指南）（Wan編，胡馬納出版社，第二版，2006)。適用時(shí)，除非另 有說(shuō)明，涉及使用市售可得的試劑盒和試劑的過(guò)程通常按生產(chǎn)商給出的方案和/或參數(shù)進(jìn) 行。
[0033]本文引用的每個(gè)文獻(xiàn)、參考文獻(xiàn)、專利申請(qǐng)或?qū)＠ㄟ^(guò)引用全文納入本文，并且各 應(yīng)作為本說(shuō)明書(shū)的一部分解讀或視為其中一部分。本說(shuō)明書(shū)引用的所述文獻(xiàn)、參考文獻(xiàn)、專 利申請(qǐng)或?qū)＠诒疚臎](méi)有重復(fù)只是為了簡(jiǎn)明。
[0034]術(shù)語(yǔ)"核酸"指脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其單鏈或雙鏈形式的聚合物（"多 核苷酸"）。除非明確限定，術(shù)語(yǔ)"多核苷酸"涵蓋的核酸含有結(jié)合特性與參照核酸類似且 以與天然存在核苷酸相似方式代謝的已知天然核苷酸類似物。除非另有說(shuō)明，具體核酸序 列也包括其保守修飾變體（如，簡(jiǎn)并密碼子取代）和互補(bǔ)序列，以及明確指出的序列。具體 說(shuō)，可通過(guò)產(chǎn)生一個(gè)或多個(gè)選定（或所有）密碼子的第三個(gè)位置被混合堿基和/或脫氧肌 苷殘基取代的序列來(lái)獲得簡(jiǎn)并密碼子取代（Batzer等，1991，NucleicAcidRes. 19:5081 ; Ohtsuka等，1985,J.Biol.Chem. 260:2605-2608 ;和Cassol等，1992;Rossolini等，1994， Mol.Cell.Probes8:91-98)。術(shù)語(yǔ)核酸與基因、cDNA、基因編碼的mRNA互換使用。
[0035]術(shù)語(yǔ)"啟動(dòng)子"指指導(dǎo)與核酸轉(zhuǎn)錄的一個(gè)或多個(gè)核酸控制序列操作性連接。本文 使用的"植物啟動(dòng)子"是植物中有功能的啟動(dòng)子。啟動(dòng)子包含轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)附近的必需核 酸序列，例如，聚合酶II型啟動(dòng)子示例中的TATA元件。本文使用的啟動(dòng)子可以包含全部核 苷酸序列，或可以只包含指導(dǎo)與核酸轉(zhuǎn)錄的核心結(jié)構(gòu)域或序列操作性連接。啟動(dòng)子也可選 包含能定位在距離轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的遠(yuǎn)至幾千堿基對(duì)的遠(yuǎn)端增強(qiáng)子或抑制子元件。"組成型" 啟動(dòng)子是在大部分環(huán)境和發(fā)育條件下有活性的啟動(dòng)子。"誘導(dǎo)型"啟動(dòng)子是在環(huán)境或發(fā)育調(diào) 節(jié)下有活性的啟動(dòng)子術(shù)語(yǔ)"操作性連接"指核酸表達(dá)控制序列（如啟動(dòng)子，或轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合 位點(diǎn)陣列）和第二核酸序列之間的功能連接，其中所述表達(dá)控制序列指導(dǎo)所述核酸響應(yīng)所 述第二序列的轉(zhuǎn)錄。
[0036]術(shù)語(yǔ)"多肽"、"肽"和"蛋白質(zhì)"在本文中互換使用，指氨基酸殘基的聚合物。該術(shù) 語(yǔ)可應(yīng)用于其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基是相應(yīng)天然產(chǎn)生氨基酸的人工化學(xué)模擬物的氨基 酸聚合物，以及天然產(chǎn)生的氨基酸聚合物和非天然產(chǎn)生的氨基酸聚合物。
[0037]術(shù)語(yǔ)"氨基酸"指天然產(chǎn)生的和合成的氨基酸，以及作用方式類似于天然產(chǎn)生氨基 酸的氨基酸類似物和氨基酸模擬物。天然產(chǎn)生的氨基酸是由遺傳密碼編碼的氨基酸，以及 隨后修飾的氨基酸，如羥基脯氨酸、y-羧基谷氨酸和〇-磷酸絲氨酸。氨基酸類似物指與天 然產(chǎn)生的氨基酸具有相同基本化學(xué)結(jié)構(gòu)的化合物，即結(jié)合于氫、羧基、氨基和R基的a碳， 如高絲氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亞砜、甲硫氨酸甲基锍。這種類似物具有修飾的R基（如 正亮氨酸）或修飾的肽主鏈，但與天然產(chǎn)生的氨基酸的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)保持相同。氨基酸模 擬物指結(jié)構(gòu)不同于氨基酸的普通化學(xué)結(jié)構(gòu)，但作用方式類似于天然產(chǎn)生氨基酸的化合物。
[0038]在本文中，氨基酸可用IUPAC-IUB生物化學(xué)命名委員會(huì)推薦的通用三字母符號(hào)或 單字母符號(hào)表示。同樣，核苷酸可用其普遍接受的單字母代碼表示。
[0039]術(shù)語(yǔ)"植物"包含全植物、植物器官（如葉、莖、花、根、生殖器官、胚胎和其部分 等）、幼苗、種子和植物細(xì)胞和其后代。本發(fā)明所述方法可用的植物種類通常寬泛到可適于 轉(zhuǎn)化技術(shù)的高等植物，包括被子植物（單子葉和雙子葉植物）和裸子植物。其包括各倍體 水平的植物，包括多倍體、二倍體、單倍體和半合子。
[0040] 術(shù)語(yǔ)"GPT多核苷酸"和"GPT核酸"在本文中可互換使用，指編碼涉及催化合成 2_氧代縮環(huán)戊酸單酰胺的多肽的基因多核苷酸序列的全長(zhǎng)或部分長(zhǎng)度，并且包含含有翻譯 (編碼）和非翻譯序列的多核苷酸，和其互補(bǔ)物。術(shù)語(yǔ)"GPT編碼序列"指轉(zhuǎn)錄和編碼GPT 蛋白的基因部分。術(shù)語(yǔ)"靶向序列"和"轉(zhuǎn)運(yùn)肽"可互換使用，指指導(dǎo)蛋白進(jìn)入細(xì)胞的亞細(xì) 胞成分，例如植物細(xì)胞中葉綠體的蛋白的氨基末端部分。GPT多核苷酸還通過(guò)其在確定條件 下與本文特定公開(kāi)的所述GPT多核苷酸或來(lái)自其的PCR產(chǎn)物雜交的能力來(lái)定義。
[0041] GPT轉(zhuǎn)基因是包含GPT多核苷酸的核酸分子，所述多核苷酸對(duì)含有所述核酸分子 的轉(zhuǎn)基因植物、或植物胚胎、器官或種子為外源性，或所述多核苷酸對(duì)有GPT多核苷酸的轉(zhuǎn) 基因植物的植物祖先、或植物胚胎、器官或其種子為外源性。
[0042] "GPT轉(zhuǎn)基因"可以包含編碼全長(zhǎng)GPT蛋白或截?cái)郍PT蛋白（包括但不限于缺少葉 綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的GPT蛋白）的多核苷酸。更特別地，外源GPT轉(zhuǎn)基因與GPT基因插入的野生 型植物、或植物胚胎、器官或種子中存在的任何GPT多核苷酸序列異質(zhì)。此種程度上，所需 的異質(zhì)性范圍僅需為單個(gè)核酸差異。然而，優(yōu)選所述異質(zhì)性順序?yàn)檫x自下述相同性的序列 之間相同性：〇? 〇l%、〇. 05%、0. 1%、0. 5%、1%、5%、10%、15%和 20%。
[0043] 術(shù)語(yǔ)"GS多核苷酸"和"GS核酸"在本文中可互換使用，指編碼谷氨酰胺合成酶蛋 白的基因多核苷酸序列的全長(zhǎng)或部分長(zhǎng)度，并且包含含有翻譯（編碼）和非翻譯序列的多 核苷酸，和其互補(bǔ)物。術(shù)語(yǔ)"GS編碼序列"指轉(zhuǎn)錄和編碼GS蛋白的基因部分。術(shù)語(yǔ)"GS1多 核苷酸"和"GS1核酸"在本文中可互換使用，指編碼谷氨酰胺合成酶同種型1蛋白的基因 多核苷酸序列的全長(zhǎng)或部分長(zhǎng)度，并且包含含有翻譯（編碼）和非翻譯序列的多核苷酸，和 其互補(bǔ)物。術(shù)語(yǔ)"GS1編碼序列"指轉(zhuǎn)錄和編碼GS1蛋白的基因部分。
[0044] "GS轉(zhuǎn)基因"是包含GS多核苷酸的核酸分子，所述多核苷酸對(duì)含有所述核酸分子 的轉(zhuǎn)基因植物、或植物胚胎、器官或種子為外源性，或所述多核苷酸對(duì)有GS多核苷酸的轉(zhuǎn) 基因植物的植物祖先、或植物胚胎、器官或其種子為外源性。"GS轉(zhuǎn)基因"可以包含編碼全 長(zhǎng)GS蛋白或截?cái)郍S蛋白（包括但不限于缺少轉(zhuǎn)運(yùn)肽的GS蛋白）的多核苷酸。"GS1轉(zhuǎn)基 因"是包含GS1多核苷酸的核酸分子，所述多核苷酸對(duì)含有所述核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物、或 植物胚胎、器官或種子為外源性，或所述多核苷酸對(duì)有GS1多核苷酸的轉(zhuǎn)基因植物的植物 祖先、或植物胚胎、器官或其種子為外源性。"GS1轉(zhuǎn)基因"可以包含編碼全長(zhǎng)GS蛋白或截 斷GS1蛋白（包括但不限于缺少轉(zhuǎn)運(yùn)肽的GS1蛋白）的多核苷酸。更特別地，外源GS或 GS1轉(zhuǎn)基因與GS或GS1基因插入的野生型植物、或植物胚胎、器官或種子中存在的任何GS 或GS1多核苷酸序列異質(zhì)。此程度上，所需的異質(zhì)性范圍僅需為單個(gè)核酸差異。然而，優(yōu)選 所述異質(zhì)性順序?yàn)檫x自下述相同性的序列之間相同性：〇. 〇l%、〇. 05%、0. 1%、0. 5%、1%、 5%、10%、15%和 20%。
[0045] 術(shù)語(yǔ)"《酰胺酶⑷酰胺酶）多核苷酸"和"《酰胺酶核酸"在本文中可互換使 用，指編碼涉及酶分解2-氧代縮環(huán)戊酸單酰胺的多肽的基因多核苷酸序列，并且包含含有 翻譯（編碼）和非翻譯序列的多核苷酸，和其互補(bǔ)物。術(shù)語(yǔ)酰胺酶編碼序列"指轉(zhuǎn)錄和 編碼《酰胺酶蛋白的基因部分。《酰胺酶多核苷酸還通過(guò)其在確定條件下與本文特定公 開(kāi)的所述《酰胺酶多核苷酸或來(lái)自其的PCR產(chǎn)物雜交的能力來(lái)定義。
[0046] "《酰胺酶轉(zhuǎn)基因"是包含《酰胺酶多核苷酸的核酸分子，所述多核苷酸對(duì)含有 所述核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物、或植物胚胎、器官或種子為外源性，或所述多核苷酸對(duì)有《 酰胺酶多核苷酸的轉(zhuǎn)基因植物的植物祖先、或植物胚胎、器官或其種子為外源性。酰胺 酶"可以包含編碼全長(zhǎng)《酰胺酶蛋白或截?cái)唷鄂０访傅鞍祝òǖ幌抻谌鄙偃~綠體轉(zhuǎn) 運(yùn)肽的《酰胺酶蛋白）的多核苷酸。更特別地，外源《酰胺酶轉(zhuǎn)基因與《酰胺酶基因插 入的野生型植物、或植物胚胎、器官或種子中存在的任何《酰胺酶多核苷酸序列異質(zhì)。此 程度上，所需的異質(zhì)性范圍僅需為單個(gè)核酸差異。然而，優(yōu)選所述異質(zhì)性順序?yàn)檫x自下述相 同性的序列之間相同性：〇? 〇l%、〇. 05%、0. 1%、0. 5%、1%、5%、10%、15%和 20%。
[0047] 術(shù)語(yǔ)"保守修飾變體"可應(yīng)用于氨基酸和核酸序列。對(duì)于特定的核酸序列，保守修 飾變體指編碼相同或基本相同的氨基酸序列的核酸，或者當(dāng)核酸不編碼氨基酸序列時(shí)，指 基本相同的序列。由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，大量功能相同的核酸編碼任何給定的蛋白質(zhì)。例 如，密碼子GCA、GCC、GCG和G⑶都編碼氨基酸丙氨酸。因此，在密碼子指定丙氨酸的每個(gè)位 置上，可將所述密碼子改變成所述的任何相應(yīng)密碼子而不改變編碼的多肽。這類核酸變異 是"沉默變異"，這是保守修飾變異的一種。本文編碼多肽的每種核酸序列也描述該核酸的 每種可能的沉默變異。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識(shí)，可修飾核酸中的各個(gè)密碼子（除了AUG和 TGG，AUG通常是甲硫氨酸的唯一密碼子，TGG通常是色氨酸的唯一密碼子），以產(chǎn)生功能相 同的分子。因此，在所述的各序列中隱含了編碼多肽的各核酸沉默變異。
[0048] 至于氨基酸序列，本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，在編碼序列中改變、加入或刪除一個(gè) 氨基酸或較少百分?jǐn)?shù)氨基酸的某一核酸、肽、多肽或蛋白質(zhì)序列單獨(dú)取代、缺失或添加是 "保守修飾變體"，其中所述改變導(dǎo)致氨基酸被化學(xué)上相似的氨基酸所取代。提供功能上相 似氨基酸的保守取代表是本領(lǐng)域熟知的。這類保守修飾的變體是本發(fā)明的多態(tài)性變體、種 間同源物和等位基因的補(bǔ)充且并不排除它們。
[0049] 以下八組各自含有可互相保守取代的氨基酸：1)丙氨酸（A)、甘氨酸（G) ;2)天 冬氨酸（D)、谷氨酸（E) ;3)天冬酰胺（N)、谷氨酰胺（Q) ;4)精氨酸（R)、賴氨酸（K) ;5)異 亮氨酸（I)、亮氨酸（L)、甲硫氨酸（M)、纈氨酸（V) ;6)苯丙氨酸（F)、酪氨酸（Y)、色氨酸 (W) ;7)絲氨酸⑶、蘇氨酸（T);和8)半胱氨酸（C)甲硫氨酸（M)(參見(jiàn)例如Creighton， Proteins(《蛋白質(zhì)》）（1984))。
[0050] 大分子結(jié)構(gòu)例如多肽結(jié)構(gòu)能以多個(gè)構(gòu)成水平的形式描述。此構(gòu)成的一般討論參見(jiàn) 例如Alberts等，MolecularBiologyoftheCell(細(xì)胞分子生物學(xué)）（第