可固定碳氧化物且可進行發(fā)酵反應的微生物及其制備方法與應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明是關于一種可固定碳氧化物且可進行發(fā)酵反應的微生物及其制備方法與 應用，尤其關于該微生物在生產(chǎn)例如有機酸與醇的有機化合物的應用。該微生物的一具體 態(tài)樣為酪下酸梭菌（Clostridiumtyrobutyricum)菌株口RI02001，其寄存于德國國家菌 種保藏中屯、值SMZ)，寄存編號為DSM32077。
【背景技術】
[0002] 自20世紀初W來，工業(yè)上便廣泛使用細菌、酵母菌、霉菌等微生物W進行發(fā)酵反 應，將生質原料轉化為較具經(jīng)濟效益的有機化合物，例如有機酸W及醇類。其中，在生成有 機化合物的微生物發(fā)酵方法中，W丙酬-下醇-乙醇（acetone-butanol-ethanol，AB巧發(fā) 酵程序最廣為使用。于A邸發(fā)酵路徑中，通過微生物，可W將含有醋類的原料（玉米、馨類、 糖蜜等）轉化為丙酬酸（pyruvate)，再進一步將丙酬酸轉化為乙酷-輔酶A(acet^-CoA)， W生成例如下酸、下醇或乙醇等較具經(jīng)濟效益的有機化合物。
[0003] 然而，上述將丙酬酸轉化為乙酷-輔酶A的過程會伴隨著例如二氧化碳的碳氧化 物的釋放，造成從原料到產(chǎn)物之間不必要的碳源損失（carbonloss)。已知，若利用自然界 的野生型菌株進行ABE發(fā)酵程序，將原料轉化為產(chǎn)物的碳轉化率最高僅約67 %，導致有機 化合物的產(chǎn)率不佳，造成不必要的成本及資源浪費。因此，如何提高從原料到產(chǎn)物的碳轉 化率，乃本領域亟待解決的一大課題。一解決此一課題的手段為，進一步選育及改良用于 發(fā)酵反應的微生物菌種，W突破微生物遺傳特性的限制，進一步重建代謝途徑、抑制代謝叉 路、或增強主要產(chǎn)物合成方向的代謝通量，從而提高從原料到產(chǎn)物之間的碳轉化率。
[0004] 本發(fā)明即是針對前述需求所為的研發(fā)成果，本案發(fā)明人經(jīng)戮力研究而完成一種可 用W制備可固定碳氧化物且可進行發(fā)酵反應的微生物的方法，由此方法所提供的微生物， 除可進行發(fā)酵反應W生成有機化合物，更可固定發(fā)酵反應中所釋放的碳氧化物，將其重新 納入發(fā)酵反應的步驟中，從而更有效利用碳源、減少不必要的碳源損失，甚至可達到接近零 碳損失的需求。

【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明的一目的，在于提供一種制備可固定碳氧化物且可進行發(fā)酵反應的微生物 的方法，其包含：
[0006] (a)提供一第一親代菌株，其具有固定碳氧化物的能力；
[0007] 化）提供一第二親代菌株，其具有進行發(fā)酵反應的能力；
[0008] (C)將該第一親代菌株及第二親代菌株分別制備成第一原生質體（protoplast) 及第二原生質體；
[0009] (d)使該第一原生質體及第二原生質體進行融合，W提供一融合菌株；W及
[0010] (e)培養(yǎng)該融合菌株并進行篩選，W獲得一標的菌株（targetstrain)。
[0011] 本發(fā)明的另一目的，在于提供一種W上述方法所獲得的標的菌株。
[0012] 本發(fā)明的又一目的，在于提供一種使用上述標的菌株于生成有機化合物的方法， 其包含于一厭氧氛圍下，將該標的菌株與一含醋基質混合，W進行發(fā)酵反應。較佳地，該方 法更包含于發(fā)酵反應中使用一共基質（co-substrate)。
[0013] 本發(fā)明的再一目的，在于提供一種酪下酸梭菌（Clostridiumtyrobutyri州m)菌 株口RI02001，其寄存于德國國家菌種保藏中屯、值SMZ)，寄存編號為DSM32077。
[0014] 本發(fā)明的再一目的，在于提供一種制備上述的酪下酸梭菌菌株ITRI02001的方 法，其包含：
[0015] (a)提供一第一親代菌株，其為將達梭菌（Clostridiumljungd址lii)且具有固 定碳氧化物的能力；
[0016] 化）提供一第二親代菌株，其為酪下酸梭菌（Clostridiumtyrobutyri州m)且具 有進行發(fā)酵反應的能力；
[0017] (C)將該第一親代菌株及第二親代菌株分別制備成第一原生質體及第二原生質 體；
[0018] (d)使該第一原生質體與第二原生質體進行融合，W提供一融合菌株；W及
[0019] (e)培養(yǎng)該融合菌株并進行篩選，W獲得酪下酸梭菌菌株ITRI02001，其寄存于德 國國家菌種保藏中屯、值SMZ)，寄存編號為DSM32077。
[0020] 本發(fā)明的又再一目的，在于提供一種使用上述的酪下酸梭菌菌株ITRI02001于 生成有機化合物的方法，其包含于一厭氧氛圍下，將該酪下酸梭菌菌株ITRI02001與一含 醋基質混合，W進行發(fā)酵反應。較佳地，該方法更包含于發(fā)酵反應中使用一共基質。
[0021] 本發(fā)明的詳細技術內容及部分具體實施態(tài)樣，將描述于W下內容中，W供本發(fā)明 所屬領域具通常知識者據(jù)W明了本發(fā)明之特征。
【附圖說明】
[002引圖1所示為將酪下酸梭菌菌株BCRC14535W及一根據(jù)本發(fā)明的微生物，分別培養(yǎng) 于CGM培養(yǎng)基、mPETC培養(yǎng)基、及mRCM培養(yǎng)基Ξ種不同培養(yǎng)基的產(chǎn)氣情形；
[0023] 圖2A顯示，于一厭氧氛圍下，將酪下酸梭菌菌株BCRC14535與本發(fā)明的酪下酸梭 菌菌株ITRI02001，培養(yǎng)于mRCM培養(yǎng)基（含10公克/升之葡萄糖）中，并于不同時間點所 測得的ODe。。數(shù)值的曲線圖；
[0024] 圖2B顯示，于一厭氧氛圍下，將酪下酸梭菌菌株BCRC14535與本發(fā)明的酪下酸梭 菌菌株ITRI02001，培養(yǎng)于mRCM培養(yǎng)基（含10公克/升之葡萄糖）中W進行發(fā)酵反應，并 測量不同時間點所生成的下酸產(chǎn)量的曲線圖；W及
[00巧]圖3顯示本發(fā)明的酪下酸梭菌菌株ITRI02001于不同的酸性環(huán)境（P冊.0、p冊.5、P冊.0)下培養(yǎng)的乙酸代謝率的直條圖。
【具體實施方式】
[0026] W下將描述根據(jù)本發(fā)明的部分具體實施態(tài)樣；但是，在不背離本發(fā)明精神下，本發(fā) 明尚可W多種不同形式的態(tài)樣來實踐，不應將本發(fā)明保護范圍解釋為限于說明書所陳述 者。此外，除非文中有另外說明，于本說明書中（尤其是在后述專利申請范圍中）所使用 的"一"、"該"及類似用語應理解為包含單數(shù)及復數(shù)形式。另，本文所使用的"約"、"大約" 或"近乎"等詞，實質上代表與所述的數(shù)值相差在20%W內者，較佳在10%W內者，且更佳 在5%W內者。此外，于本發(fā)明中，所謂的"微生物"是指肉眼無法看見的生物體（例如：細 菌、真菌），其可包括于自然界中自然存在的野生型（wil化ype)，W及因任何因素（天然或 人為）所產(chǎn)生的突變型（mutant)。所謂"碳氧化物"是指一氧化碳、二氧化碳、或其組合。 另，除非明確限定，否則于本說明書中所述的醋類與有機化合物，包含其所有異構物型式， 包括，但不限于鏡像異構物（enantiomer)、非鏡像異構物（diastereomer)及構形異構物 (conformationalisomer)。
[0027] 于本說明書中，所謂"碳轉化率"是指在發(fā)酵反應中，所生成的有機化合物的總碳 數(shù)與所消耗碳源的總碳數(shù)的比值，W如下式1進行計算。
[0028]式1
[0029] 本發(fā)明是提供一種制備可固定碳氧化物且可進行發(fā)酵反應的微生物的方法，其包 含：
[0030] (a)提供一第一親代菌株，其具有固定碳氧化物的能力；
[0031] 化）提供一第二親代菌株，其具有進行發(fā)酵反應的能力；
[0032] (C)將該第一親代菌株及第二親代菌株分別制備成第一原生質體及第二原生質 體；
[0033] (d)使該第一原生質體及第二原生質體進行融合，W提供一融合菌株；W及
[0034] (e)培養(yǎng)該融合菌株并進行篩選，W獲得一標的菌株。
[0035]根據(jù)本發(fā)明方法，作為步驟（a)的第一親代菌株可W是任何具有固定碳氧化物能 力的微生物。所謂"固定碳氧化物"是指借助生物化學反應將碳氧化物轉化為有機化合物 的過程，舉例言之，已知自然界中有許多微生物可利用Wood-Uungd址l(WL)路徑來固定其 生存環(huán)境中的碳氧化物，并將碳氧化物轉化成乙酷-輔酶A。
[003引可利用WoodLjungdahl肥)路徑W固定碳氧化物的菌株包捉但不限于，將達梭菌 的ostridi皿lju唯礎。i)、自產(chǎn)乙酉對《菌的ostridi皿autoethanogenuni)、食氧化碳梭菌的ostridi皿 carboxidivorans)、困難梭菌（Clos仕idi皿difficile)、醋酸梭菌（Clos仕idi皿aceticuni)、熱乙酸莫 爾氏菌dfcarellatheramcetica，原為熱乙酸梭菌（Clostridi皿theramceticmi))、嗜熱自營甲燒桿 菌（|16化孤013301611皿化61111081111)仕0口]11〇1]1)、自營脫硫桿菌（〇0細版133〇1611皿81111)仕〇口]11〇1]1)、斯蒂 克蘭德氏梭菌的ostridi皿sticklandii)、嗜熱自營梭菌的ostridi皿therarautotropMcuiii)、蟻酸酉昔 酉刻刻菌的ostridi皿formicoaceticuni)、大梭菌的ostridi皿皿gnmi)、甲醇酉昔酸桿菌（Acetobacterium carbinolic如、凱伍醋酸桿菌(Acetobacteri皿kivui)、伍氏醋酸桿菌（Acetobacteriumwoodii)、瘤胃 聚乙酸菌（Acetitomcul皿ruminis)、潮濕厭氧醋菌（Acetoanaerobiumnoterae)、W及拜氏醋酸桿菌 (Acetobacteriumbakii) 〇
[0037] 可于本發(fā)明方法的步驟（a)中使用前述可利用Woo化jungd址1 (WL)路徑W固定碳 氧化物的菌株W作為第一親代菌株。于本發(fā)明一具體實施態(tài)樣中，于步驟（a)中使用將達 梭菌（Clostridiumljungd址lii)作為第一親代菌株。
[0038] 根據(jù)本發(fā)明方法，作為步驟化）的第二親代菌株可W是任何具有進行發(fā)酵反應 能力的微生物。所謂"發(fā)酵反應"是指微生物代謝一或多種物質w產(chǎn)生有機化合物的過 程。舉例言之，適用為本發(fā)明方法步驟化）的第二親代菌株的例子包括，但不限于，梭菌屬 (Clostridiumsp.)菌株、安愛羅斯代普布替雷熙克菌（Anaerostipesbutyraticus)、糞厭 氧棒狀菌（Anaerostipescaccae)、安愛羅斯代普菌屬（Anaerostipessp·)、穗狀下酸弧菌 化utyriviLbriocrossotus)、溶纖維下酸弧菌化utyriviLbriofibrisolvens)、亨氏下酸弧 菌化utyriviLbriohungatei)、瘤胃溶纖維下酸弧菌化utyriviLbrioproteoclasticus)、 梭菌屬（Clostridialessp.)、糞球菌ART55/1(CoprococcusART55/1)、夷巧糞球菌 (Coprococcuscatus)、陪伴糞球菌（Coprococcuscomes)、一至文糞球菌（Coprococcus eutac化s)、兩形真桿菌巧ubacteriumbiforme)、溶纖維真桿菌巧ubacterium cellulosolvens)、細長真桿菌(Eubacteriumdolichum)、龐大真桿菌(Eubacterium hadrum)、霍氏真桿菌巧ubacteriumhallii)、L2-7 真桿菌巧ubacteriumL2-7)、粘 液真桿菌巧ubacteriumlimosum)、氧化還原真桿菌巧ubacteriumoxidoreducens)、 細枝真桿菌巧ubacteriumramulus)、直腸真桿菌巧ubacteriumrectale)、口臭真 桿菌巧ubacteriumsaburreum)、A2-194 真桿菌巧ubacteriumA2-194)、凸腹真桿 菌(Eubacteriumventriosum)、毛螺科菌(Lachnospiraceaebacterium)、毛螺科菌 屬（Xachnospiraceaesp·)、莫亞控產(chǎn)日引噪菌（Moiyellaindoligenes)、少食八迭球菌 (Parasporobacteriumpaucivorans)、瘤胃{段了酉堇弧菌(Pseudobutyrivibrioruminis)、 偽下酸撒控尼羅控菌巧seudobutyriviLbriox^danivorans)、盲腸羅斯氏菌（Roseburia cecicola)、糞便羅斯拜瑞氏菌（Roseburiafaecis)、羅斯拜瑞氏菌（Roseburia hominis)、羅斯氏腸菌（Roseburiaintestinalis)、羅斯氏尹琳妮佛倫菌（Roseburia inulinivorans)、抱子細菌樹紫苑菌（Sporobacteriumolearium)、安黑羅克斯阿克踏利斯 菌（AnerococcusOctavius)、不解糖嗜膝菌巧eptoniphilusasaccharolyticus)、蛋白膝 菌巧eptoniphilus)、杜爾丹尼菌（duerdenii)、蛋白膝哈雷菌巧eptoniphilusharei)、 蛋白膝淚菌巧eptoniphiluslacrimalis)、日引噪嗜膝菌巧eptoniphilusindolicus)、弗 消化鏈球菌艾弗嗜膝菌巧eptoniphilusivorii)、嗜膝菌屬巧eptoniphilussp·)、賽 德口特己克特海卓斯班卓依克菌（Sedimentibacterhydroxybenzoicus)、優(yōu)桿歐都例牡 藤菌（Anaerovoraxodorimutans)、產(chǎn)線銀溝菌（Filifa