專利名稱：一種利用微生物酶系對啤酒酵母細胞進行破壁裂解的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是利用一株細菌產(chǎn)生的胞外復合酶系對經(jīng)過預(yù)處理的啤酒酵母細胞進行
破壁的一種方法，屬于生物技術(shù)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
我國啤酒行業(yè)每年產(chǎn)生的廢棄酵母泥多達幾十萬噸。目前對這些酵母的有效利用有限，可深度開發(fā)的空間很大。對這些酵母進行有效的利用將會挖掘其蘊藏的巨大經(jīng)濟價值，并且能夠緩解其對環(huán)境造成的壓力。 酵母菌是一種單細胞真核微生物，其細胞壁厚度約為O. 1 0.3ym，結(jié)構(gòu)堅韌，主
要成分有葡聚糖、甘露聚糖、蛋白質(zhì)、幾丁質(zhì)、脂類等，其中葡聚糖和甘露聚糖的含量分別占到細胞壁干重的30%左右；酵母細胞質(zhì)含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、核糖核酸、B族維生素以及豐富的氨基酸等。酵母細胞壁中的P-(l，3)-葡聚糖能增強哺乳動物的免疫活力、抗癌、抗細菌、抗病毒、抗真菌、抗寄生蟲、降低膽固醇和血脂、促進傷口愈合等能力，是一種良好的生物效應(yīng)調(diào)節(jié)劑。因此，對酵母細胞破壁裂解后，既可以釋放出胞內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)，又可以得到細胞壁多糖。 由于酵母細胞壁結(jié)構(gòu)復雜堅韌，破壁較為困難。常用的破壁方法有高壓勻質(zhì)法、超聲波法、凍融法、有機溶劑法、酸堿法，酶法或其中幾種方法聯(lián)用等。其中高壓勻質(zhì)法處理酵母細胞量大速度快，但是需要重復破碎，而且處理過程中溫度的升高容易造成敏感活性物質(zhì)的失活。超聲波法也存在散熱困難，產(chǎn)生局部高溫的問題，只適合實驗室規(guī)模的應(yīng)用。酸堿法破壁需要用到大量的強酸強堿，容易對環(huán)境造成污染。酶法裂解破壁與其它物理化學方法相比有很多突出的優(yōu)點，如能耗低、對營養(yǎng)成分破壞程度低，綠色環(huán)保等。但是現(xiàn)行的酶法破壁方法也存在很多缺陷，如酶用量大、酶成本高、酶解反應(yīng)溫度較高以及需要有毒的巰基化合物預(yù)處理酵母細胞等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明利用細菌Flavobacterium johnsoniae產(chǎn)生的胞外酶系，結(jié)合簡單的預(yù)處理過程，建立了一種有效破碎啤酒酵母細胞壁的方法。
發(fā)明概述 本發(fā)明針對現(xiàn)行酶法破壁技術(shù)中存在的酶用量大、酶成本高等問題，采用添加廉價高效微生物粗酶制劑的方法，在適宜條件下對經(jīng)乙醇簡單預(yù)處理的啤酒酵母細胞進行酶解處理，達到了破碎酵母細胞壁的目的。破壁率最高可達90 % 。
發(fā)明詳述 —種利用微生物酶系對啤酒酵母細胞進行破壁裂解的方法，包括粗酶制劑制備，酵母細胞的預(yù)處理和酶解，其特征在于，粗酶制劑制備步驟如下 (1)取菌種保藏號為ATCC 17061的菌種Flavobacterium johnsoniae，無菌條件下吸取100 ii 1接種于30ml CYE活化培養(yǎng)基中，26_32°C ， 150-300rpm搖床培養(yǎng)10-20h，得
3活化菌種；CYE活化培養(yǎng)基pH為7-8，配方如下，均為重量份 酪蛋白胨(Casein P印tone)8-12g 酵母提取物(Yeast Extract)4_7g
氨基丁三醇(Tris) l-2g 硫酸鎂(MgS04))0. 5-1. 5g 蒸餾水1000g。 上述的酵母提取物(Yeast Extract)、酪蛋白胨(Casein P印tone)均為市場購得。
(2)將步驟(1)制得的活化菌種按每100ml產(chǎn)酶培養(yǎng)基接種450-550 ill活化菌種的接種量接種，在26-32°C， 150-300rpm搖床培養(yǎng)18_36h后，在溫度4°C的條件下，6000-15000g離心10-20min，收集上清液； (3)將步驟(2)收集的上清液進行冷凍干燥，得到粗酶制劑。經(jīng)檢測，所制備的粗
酶制劑具有明顯的昆布多糖酶、幾丁質(zhì)酶和蛋白酶等活性。 所述的步驟(2)中的產(chǎn)酶培養(yǎng)基pH為7-8，配方如下，均為重量份硝酸鉀(KN03) 0. 8-1. 2g 磷酸氫二鉀(K2HP04) 0. 8-1. 2g 硫酸鎂(MgS04)0. 15-0. 3g 氯化鈣(CaCl2)0. 05-0. 15g 氯化鐵(FeCl3) 0. 01-0. 03g 干酵母5g 蒸餾水lOOOg 所述的啤酒酵母預(yù)處理步驟如下 ①將啤酒酵母泥過濾、除雜、水洗，得含水量70_90wt%的酵母泥；該步驟可除去大部分啤酒酵母泥中的雜質(zhì)。 ②將步驟①制得的酵母泥，按每3-5g酵母泥加入100-800 ill乙醇和0. 1-0. 5gNaCl，混勻，然后放入40-6(TC水浴鍋中水浴加熱3_7h，得到預(yù)處理酵母泥；
所述的酶解操作如下 將啤酒酵母預(yù)處理步驟獲得的預(yù)處理酵母泥按照每lg干重的預(yù)處理酵母泥，用10-20mlpH 7. 5的Tris-HCl緩沖液懸浮，然后加入經(jīng)粗酶制劑制備步驟中制得的粗酶制劑0. 1-0. 5g，在30-6(TC下，震蕩水浴反應(yīng)3-7h，即得到破壁裂解的啤酒酵母細胞。通過顯微鏡對產(chǎn)物觀察檢測酵母細胞壁的破碎情況，破壁率可達70-90% 。 所述步驟(2)產(chǎn)酶培養(yǎng)基中的干酵母可按現(xiàn)有技術(shù)自制，本發(fā)明提供通過如下制備方法 將步驟①制得的酵母泥先在-8(TC冷凍，然后用真空冷凍干燥機凍干即可。
本發(fā)明的有益效果如下 本發(fā)明提供的利用微生物發(fā)酵粗酶制劑破碎乙醇預(yù)處理酵母細胞壁的方法，所用粗酶成本低且破壁能力較強，操作比較簡單，整個破壁過程所需時間較短，并且在生產(chǎn)過程中不需要添加有毒的化學試劑，因此，該方法生產(chǎn)的產(chǎn)品可應(yīng)用于食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域。


圖1是酶解前完整的酵母細胞顯微鏡照片；
圖2是酶解后破壁的酵母細胞顯微鏡照片；
具體實施例方式
下面結(jié)合實施例，對本發(fā)明做進一步闡述，但本發(fā)明所保護范圍不限與此。
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實施例中涉及的菌株Flavobacterium johnsoniae是美國典型物保藏中心ATCC17061strain UWIOI，從該中心購買。酵母提取物(Yeast Extract)購自0xoid公司，酪蛋白胨(CaseinP印tone)購自Solarbio公司。
實施例中涉及的其他試劑均為市售普通產(chǎn)品。
實施例1干酵母的制備 將購自趵突泉啤酒廠的廢棄酵母泥經(jīng)8層紗布過濾除雜和水洗，得到酵母泥。將酵母泥先在-8(TC冷凍，然后用真空冷凍干燥機凍干，使用前用研缽將其研磨成粉末狀即可。 實施例2 —種利用微生物酶系對啤酒酵母細胞進行破壁裂解的方法，包括粗酶制劑制備，酵母細胞的預(yù)處理和酶解，步驟如下 無菌條件下吸取100 ii 1甘油管保藏的Flavobacterium johnsoniae菌液接種于30ml CYE培養(yǎng)基中(CYE培養(yǎng)基配方為酪蛋白胨10g、酪蛋白胨10g、酵母提取物5g、氨基丁三醇1. 2g、 MgS04 lg、水1000g，pH 7. 5)30。C，200rpm搖床培養(yǎng)14h，得活化菌種。然后將活化菌種接種于產(chǎn)酶培養(yǎng)基中(硝酸鉀lg、磷酸氫二鉀lg、硫酸鎂0. 2g、氯化鈣0. lg、氯化鐵0. 02g、干酵母5g、蒸餾水1000g， pH 7. 5)，每100ml培養(yǎng)基中接種500 y 1活化菌種，30°C ， 100rpm搖床培養(yǎng)24h，然后離心(15000g， 10min， 4°C )，收集上清液，細菌所產(chǎn)生的胞外酶溶于該上清液中。將該上清液冷凍干燥，得到粉末狀的粗酶制劑。
將購自趵突泉啤酒廠的廢棄酵母泥經(jīng)8層紗布過濾除雜和水洗，得到酵母泥，顯微鏡觀察，如圖l所示。用恒溫干燥箱105t:條件下測得所制備酵母泥的含水量為78%。每4. 55g酵母泥(酵母細胞干重lg)加入400ii1乙醇，O. 2gNaCl，混勻后，放入55t:水浴鍋中水浴加熱5小時。然后用10ml pH 7. 5的Tris-HCl緩沖液懸浮，加酶制劑0. lg，45。C震蕩水浴反應(yīng)6h，即得到破壁裂解的啤酒酵母細胞。通過顯微鏡對產(chǎn)物觀察檢測酵母細胞壁的破碎情況，如圖2所示。經(jīng)計算，酵母細胞破壁率為90%。
實施例3 如實施例2所述的對啤酒酵母細胞進行破壁裂解的方法，不同之處在于，每4. 55g酵母泥(酵母細胞干重lg)加入400 iU乙醇，Tris-HCl緩沖液懸浮后，加酶制劑0. 15g，55t:震蕩水浴反應(yīng)5h。經(jīng)計算，酵母細胞破壁率為70%。
權(quán)利要求
一種利用微生物酶系對啤酒酵母細胞進行破壁裂解的方法，包括粗酶制劑制備，酵母細胞的預(yù)處理和酶解，其特征在于，粗酶制劑制備步驟如下(1)取菌種保藏號為ATCC 17061的菌種Flavobacterium johnsoniae，無菌條件下吸取100μl接種于30ml CYE活化培養(yǎng)基中，26-32℃，150-300rpm搖床培養(yǎng)10-20h，得活化菌種；所述CYE活化培養(yǎng)基pH為7-8，配方如下，均為重量份酪蛋白胨 8-12g酵母提取物4-7g氨基丁三醇1-2g 硫酸鎂0.5-1.5g蒸餾水1000g(2)將步驟(1)制得的活化菌種按每100ml產(chǎn)酶培養(yǎng)基450-550ul活化菌種接種，在26-32℃，150-300rpm搖床培養(yǎng)18-36h后，在溫度4℃的條件下，6000-15000g離心10-20min，收集上清液；(3)將步驟(2)收集的上清液進行冷凍干燥，得到粗酶制劑。
2. 如權(quán)利要求l所述的破壁裂解的方法，其特征在于，所述的步驟(2)中的產(chǎn)酶培養(yǎng)基 pH為7-8，配方如下，均為重量份硝酸鉀 0.8-1.2g 磷酸氫二鉀 0.8-1.2g硫酸鎂 0. 15-0. 3g氯化鈣 0.05-0. 15g氯化鐵 0.01-0.03g 干酵母 5g 蒸餾水 lOOOg。
3. 如權(quán)利要求1所述的破壁裂解的方法，其特征在于，所述的啤酒酵母預(yù)處理步驟如下將啤酒酵母泥過濾、除雜、水洗，得含水量70-90wt^的酵母泥；將制得的酵母泥，按每 3-5g酵母泥加入100-800 ill醇和0. 1-0. 5g NaCl，混勻，然后放入40-6(TC水浴鍋中水浴 加熱3-7h，得到預(yù)處理酵母泥。
4. 如權(quán)利要求1或3所述的破壁裂解的方法，其特征在于，所述的酶解操作如下 將啤酒酵母預(yù)處理得到的預(yù)處理酵母泥按照每lg干重的預(yù)處理酵母泥，用10-20mlpH7. 5的Tris-HCl緩沖液懸浮，然后加入粗酶制劑0. 1_0. 5g，在30-6(TC下，震蕩水浴反應(yīng) 3-7h，即得到破壁裂解的啤酒酵母細胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用微生物酶系對啤酒酵母細胞進行破壁的方法，該方法包括粗酶制劑制備，酵母細胞的預(yù)處理和酶解，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明提供的啤酒酵母破壁方法，操作簡單，整個破壁過程所需時間較短，可重復操作，而且生產(chǎn)過程中未添加有毒化學試劑，因此，用該方法生產(chǎn)的產(chǎn)品可應(yīng)用于飼料、食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域。
文檔編號C12N1/06GK101717733SQ200910229778
公開日2010年6月2日 申請日期2009年11月6日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月6日
發(fā)明者劉巍峰, 盧雪梅, 史偉, 朱永濤, 陳冠軍 申請人:山東大學