用于二萜生產(chǎn)的微生物的制作方法
【專利說明】用于二萜生產(chǎn)的微生物 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及利用重組微生物在細(xì)胞外生產(chǎn)二萜和/或糖基化的二萜的方法。本發(fā) 明還涉及一種發(fā)酵液，其中所述發(fā)酵液包括通過這種方法可獲得的二萜和/或糖基化的二 砲。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 世界各地對(duì)高效甜味劑的需求不斷增長(zhǎng)，而且混合不同的人工甜味劑正在逐漸變 成一種常規(guī)做法。然而，對(duì)甜味劑替代品的需求預(yù)計(jì)將會(huì)增加。多年生草本植物-甜葉菊 (Stevia rebaudiana Bert.)-的葉子中積聚了大量極甜的化合物，它們被稱為甜菊糖苷。 雖然這些化合物的生物學(xué)功能還不明確，但由于甜葉菊甜味劑是天然植物產(chǎn)品這一附加優(yōu) 勢(shì)，它們作為備選的高效甜味劑具有商業(yè)意義。
[0004] 這些甜的甜菊糖苷顯示出優(yōu)于許多高效甜味劑的功能特性和感官性狀。此外，研 究表明甜菊苷(stevioside)能降低II型糖尿病人的血糖水平和中度高血壓患者的血壓。
[0005] 甜菊糖苷積聚于甜菊葉中，它們可以占甜菊葉干重的10-20 %。甜菊苷和萊鮑迪甙 (rebaudioside)A都具有熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性，因此適合用于碳酸飲料和許多其它食物中。 甜菊苷比蔗糖甜110-270倍，萊鮑迪甙A比蔗糖甜150-320倍。此外，萊鮑迪甙D也是積聚于甜 菊葉的高效二萜糖苷甜味劑，它可能比蔗糖甜約200倍。
[0006] 目前，甜菊糖苷是從甜菊植物中提取的。在甜菊中，（-)-貝殼杉烯酸(kaurenoic acid，赤霉素(GA)生物合成的中間物)被轉(zhuǎn)換為四環(huán)的二萜-甜菊醇，然后甜菊醇繼續(xù)通過 多步驟的葡糖基化途徑形成各種甜菊糖苷。然而，產(chǎn)率是可變的并受農(nóng)業(yè)和環(huán)境條件的影 響。而且，種植甜菊需要大量陸地面積、收獲前的長(zhǎng)久時(shí)間、密集的勞動(dòng)力以及提取和純化 糖苷的額外費(fèi)用。
[0007] 為了滿足對(duì)高效、天然甜味劑日益增長(zhǎng)的商業(yè)需求，需要新的、更標(biāo)準(zhǔn)的、完全單 一成分的、沒有后味的糖苷來源。
[0008] 發(fā)明概述
[0009] 在甜菊中，通過脫氧木酮糖磷酸酯途徑（deoxyxylulose 5-phosphate pathway) 形成香葉基香葉基焦磷酸（GGPP)，甜菊醇就是從GGPP合成的。（-)-柯巴基二磷酸合酶 (copalyl diphosphate synthase，CPS)和（-)_貝殼杉稀合酶（kaurene synthase，KS)這兩 個(gè)二萜環(huán)化酶的活性導(dǎo)致(-)_貝殼杉烯的形成，然后在一個(gè)三步驟的反應(yīng)中，（-)_貝殼杉 稀被(-)-貝殼杉稀氧化酶(kaurene oxidase，K0)氧化形成(-)_貝殼杉稀酸。
[001 0]在甜菊葉中，（-)_貝殼杉烯酸接著被內(nèi)根-貝殼杉烯酸13-羥化酶(KAH)羥基化以 形成甜菊醇。然后，甜菊醇被一系列UDP-葡糖基轉(zhuǎn)移酶(UGTs)葡糖基化。
[0011] 本發(fā)明涉及能夠產(chǎn)生二萜(例如甜菊醇)或糖基化的二萜（即二萜糖苷，例如甜菊 單糖苷、甜菊雙糖苷、甜菊苷、萊鮑迪甙A、萊鮑迪甙B、萊鮑迪甙C、萊鮑迪甙D、萊鮑迪甙E、萊 鮑迪甙F、甜茶苷或杜克甙A)的微生物。
[0012] 在共同待決專利申請(qǐng)W02013/110673中，描述了能夠產(chǎn)生二萜或二萜糖苷的重組 微生物。本文描述了這樣的重組微生物，其包含額外的修飾，特別是一個(gè)或多個(gè)基因的下 調(diào)，這導(dǎo)致二萜或二萜糖苷的生產(chǎn)水平提高。
[0013] 因此，本發(fā)明提供包括一種或多種核苷酸序列的重組微生物，其中所述核苷酸序 列編碼：
[0014] 具有內(nèi)根-柯巴基焦磷酸合酶的多肽；
[0015] 具有內(nèi)根-貝殼杉烯合酶活性的多肽；
[0016] 具有內(nèi)根-貝殼杉烯氧化酶活性的多肽;和 [0017]具有貝殼杉稀酸13-羥化酶活性活性的多肽，
[0018] 通過所述核苷酸序列的表達(dá)使微生物具有至少生產(chǎn)甜菊醇的能力，且
[0019] 其中所述重組微生物的基因組已經(jīng)被修飾，使得其導(dǎo)致以下中的一種或多種的產(chǎn) 生缺陷(deficiency):
[0020] (i)能夠作用于香葉基香葉基焦磷酸(GGPP)從而導(dǎo)致香葉基香葉醇(G0H)的形成 的磷酸酶；
[0021 ] ( ii )能夠作用于法尼基焦磷酸（FPP)從而導(dǎo)致法尼醇（farnesol)和橙花叔醇 (nero 1 ido 1)的形成的磷酸酶；
[0022] (1^)外-1，3_0葡聚糖酶；
[0023] (iv)糖原合酶(或者影響糖原積累的多肽）；
[0024] (v)缺氧基因 （hypoxic genes)的轉(zhuǎn)錄抑制子（transcriptional repressor)
[0025] (vi)NADPH 氧化酶;或者
[0026] (vii)單駿酸轉(zhuǎn)運(yùn)體（monocarboxylate transporter)
[0027] (v i i i)由開放閱讀框YJL064w編碼的多肽;或者
[0028] (ix)由開放閱讀框YPL062W編碼的多肽。
[0029] 這些修飾中的一種或多種最終導(dǎo)致代謝工程菌株中的二萜和或二萜糖苷生產(chǎn)得 到改進(jìn)。
[0030] 本發(fā)明還涉及這樣的重組微生物，其中所述重組微生物的基因組已經(jīng)被修飾，使 得其導(dǎo)致以下中的一種或多種的產(chǎn)生缺陷：
[0031] (i)能夠作用于香葉基香葉基焦磷酸(GGPP)從而導(dǎo)致香葉基香葉醇(G0H)的形成 的磷酸酶，其包含與SEQ ID N0:225的序列同一性為至少約30%的氨基酸序列；
[0032] (ii)能夠作用于法尼基焦磷酸(FPP)從而導(dǎo)致法尼醇和橙花叔醇的形成的磷酸 酶，其包含與SEQ ID N0:227的序列同一性為至少約30%的氨基酸序列；
[0033] (iii)外-1，3-β葡聚糖酶，其包含與SEQ ID N0:229或231的序列同一性為至少約 30%的氨基酸序列；
[0034] (iv)糖原合酶(或者影響糖原積累的多肽），其包含與SEQ ID N0:233、235或250的 序列同一性為至少約30%的氨基酸序列；
[0035] (v)缺氧基因的轉(zhuǎn)錄抑制子，其包含與SEQ ID N0:237的序列同一性為至少約30% 的氨基酸序列；
[0036] (vi)NADPH氧化酶，其包含與SEQ ID N0:239的序列同一性為至少約30%的氨基酸 序列；
[0037] (vii)單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)體，其包含與SEQ ID N0:241的序列同一性為至少約30%的氨基 酸序列；
[0038] (viii)具有由開放閱讀框YJL064w編碼的活性的多肽，其包含與SEQ ID N0:243的 序列同一性為至少約30 %的氨基酸序列;或者
[0039] (ix)具有由開放閱讀框YJL062W編碼的活性的多肽，其包含與SEQ ID N0:245的序 列同一性為至少約30 %的氨基酸序列。
[0040] 本發(fā)明還涉及這樣的本發(fā)明的重組微生物，其中所述重組微生物的基因組已經(jīng)在 以下一個(gè)或多個(gè)的至少一個(gè)位置處被修飾：
[0041] (i)核酸，其編碼能夠作用于香葉基香葉基焦磷酸(GGPP)從而導(dǎo)致香葉基香葉醇 (G0H)形成的磷酸酶，其包含與SEQ ID N0:224的序列同一性為至少約60%的核酸序列； [0042] (ii)核酸，其編碼能夠作用于法尼基焦磷酸(FPP)從而導(dǎo)致法尼醇和橙花叔醇形 成的磷酸酶，其包含與SEQ ID N0:226的序列同一性為至少約60%的核酸序列；
[0043] (iii)核酸，其編碼外-l，3-β葡聚糖酶，其包含與SEQIDN0:228或230的序列同一 性為至少約60 %的核酸序列；
[0044] (iv)核酸，其編碼糖原合酶（或者影響糖原積累的多肽），其包含與SEQ ID N0: 232、234或249的序列同一性為至少約60 %的核酸序列；
[0045] (v)核酸，其編碼缺氧基因的轉(zhuǎn)錄抑制子，其包含與SEQ ID N0:236的序列同一性 為至少約60 %的核酸序列；
[0046] (vi)核酸，其編碼NADPH氧化酶，其包含與SEQ ID N0:238的序列同一性為至少約 60%的核酸序列；
[0047] (vii)核酸，其編碼單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)體，其包含與SEQ ID N0:240的序列同一性為至少 約60 %的核酸序列；
[0048] (vi i i)核酸，其編碼具有由開放閱讀框YJL064W編碼的活性的多肽，其包含與SEQ ID N0:242的序列同一性為至少約60%的氨基酸序列;或者
[0049] (ix)核酸，其編碼具有由開放閱讀框YJL062W編碼的活性的多肽，其包含與SEQ ID NO :244的序列同一性為至少約60 %的氨基酸序列。
[0050] 微生物可具有所述修飾中的一種或兩種或更多種。
[0051] 本發(fā)明還提供包括一種或多種核苷酸序列的重組微生物，其中所述核苷酸編碼一 種或多種具有UDP-葡糖基轉(zhuǎn)移酶(UGT)活性的多肽，
[0052] 通過所述核苷酸的表達(dá)使重組微生物具有能生產(chǎn)甜菊單糖苷、甜菊雙糖苷、甜菊 苷、萊鮑迪戒A、萊鮑迪戒B、萊鮑迪戒C、萊鮑迪戒D、萊鮑迪戒E、萊鮑迪戒F、甜茶苷或杜克戒 A中的至少一種的能力。
[0053]本發(fā)明還提供：
[0054] -制備二萜或糖基化的二萜的方法，其中所述方法包括在合適的發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā) 酵本發(fā)明所述的重組微生物；以及任選地，回收二萜或糖基化的二萜；
[0055] -制備二萜或糖基化的二萜的方法，其中所述方法包括在約29°C或更低的溫度下， 在合適的發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵能夠產(chǎn)生二萜或糖基化的二萜的重組微生物；以及任選地，回 收二萜或糖基化的二萜；
[0056] --種發(fā)酵液，其中所述發(fā)酵液包括通過本發(fā)明所述的方法可以得到的二萜或糖 基化的二萜；
[0057] -通過本發(fā)明所述的方法得到的或從根據(jù)本發(fā)明所述的發(fā)酵液中可以得到的得到 的二萜或糖基化的二萜；
[0058] -根據(jù)本發(fā)明所述的二萜或糖基化的二萜，其是萊鮑迪甙A或萊鮑迪甙D;和
[0059] -含有根據(jù)本發(fā)明所述的二萜或糖基化的二萜的食品、飼料或飲料。
[0060] 本發(fā)明還提供將初次糖基化的二萜轉(zhuǎn)換為二次糖基化的二萜的方法，所述方法包 括：
[0061] 將所述初次糖基化的二萜與根據(jù)本發(fā)明所述的微生物、來源于這種微生物的無細(xì) 胞提取物或者來源于上述微生物或無細(xì)胞提取物之一的酶制劑接觸，
[0062] 從而將初次糖基化的二萜轉(zhuǎn)換為二次糖基化的二萜。
【附圖說明】
[0063] 圖1展示了質(zhì)粒pUG7_EcoRV的示意圖。
[0064] 圖2展示了設(shè)計(jì)ERG20、tHMGl和BTS1過表達(dá)盒(A)，并將其整合至酵母基因組(B)的 方法的不意圖。（C)顯不了利用Cre重組酶移除KANMX標(biāo)記后的最終狀態(tài)。
[0065]圖3展示了ERG9敲低構(gòu)建體的示意圖。所述構(gòu)建體由500bp ERG9的3'部分、98bp TRP1的啟動(dòng)子、TRP1的開放閱讀框和終止子以及之后的400bp ERG9的下游序列組成。由于 在ERG9的開放閱讀框的終點(diǎn)引入了Xbal位點(diǎn)，因此最后的氨基酸變成了絲氨酸，終止密碼 子變成了精氨酸。新的終止密碼子位于TRP1的啟動(dòng)子中，這導(dǎo)致延長(zhǎng)了 18個(gè)氨基酸。
[0066]圖4展示了將UGT2整合至基因組的示意圖。A.轉(zhuǎn)化中使用的不同片段;B.整合后的 狀態(tài);C. Cre重組酶表達(dá)后的狀態(tài)。
[0067]圖5展示了將GGPP到RebA的途徑整合至基因組的示意圖。A.轉(zhuǎn)化中使用的不同片 段;B.整合后的狀態(tài)。
[0068] 圖6展示了如何構(gòu)建特定基因缺失的示意圖。A.親本菌株中的基因組;B.整合后的 狀態(tài);C.向外重組后的狀態(tài)。
[0069] 圖7展示了生物合成甜菊糖苷的潛在途徑的示意圖。
[0070] 圖8展示了質(zhì)粒pMB6969的示意圖。
[0071] 圖9展示了質(zhì)粒pMB6856的示意圖。
[0072] 圖10展示了質(zhì)粒pMB6857的示意圖。
[0073] 圖11展示了質(zhì)粒pMB6948的示意圖。
[0074] 圖12展示了質(zhì)粒pMB6958的示意圖。
[0075] 圖13展示了質(zhì)粒pMB7015的示意圖。
[0076] 圖14展示了質(zhì)粒pMB6986的示意圖。
[0077] 圖15展示了質(zhì)粒pMB7059的示意圖。
[0078] 圖16展示了質(zhì)粒pMB4691的示意圖。
[0079] 圖17展示了破壞GSY1基因的示意圖。
[0080] 序列表說明
[0081] 表1展示了序列說明。本文描述的序列可以引用序列表或數(shù)據(jù)庫(kù)訪問號(hào)（同樣展示 于表1)來定義。
[0082] 發(fā)明詳述
[0083] 在本說明書和附屬的權(quán)利要求書的各個(gè)部分，詞語"包括"、"包含"和"具有"及其 變形應(yīng)被理解為"包含在內(nèi)"。也就是說，在語境允許的情況下，這些詞語意圖傳達(dá)的意思 是:可以包括其它沒有明確列舉的元素或整體。
[0084] 本文中不使用數(shù)量詞修飾時(shí)指的是一個(gè)或多于一個(gè)(即一個(gè)或至少一個(gè))對(duì)象。例 如，"元素"可能意味著一個(gè)元素或多于一個(gè)元素。
[0085] 本發(fā)明涉及能夠產(chǎn)生二萜或糖基化的二萜(通常分別是甜菊醇或甜菊糖苷）的重 組微生物。為了本發(fā)明的目的，二萜通常意味著由4個(gè)異戊二烯單元組成的有機(jī)物。這種化 合物可來源于香葉基香葉基焦磷酸。糖基化的二萜或二萜糖苷是一種結(jié)合有糖的二萜，其 中糖通常與非碳水化合物部分相結(jié)合。通常，在二砲糖苷中，糖基通過其異頭碳(anomric carbon)經(jīng)由糖苷鍵與另外一個(gè)基團(tuán)結(jié)合。優(yōu)選的二萜和二萜糖苷分別是甜菊醇和甜菊糖 苷。因此，特別地，本發(fā)明涉及能夠產(chǎn)生甜菊醇和甜菊糖苷的重組微生物。
[0086] 根據(jù)本發(fā)明，提供了重組微生物。所述重組微生物包括一種或多種核苷酸序列，所 述核苷酸序列編碼：
[0087] 具有內(nèi)根-柯巴基焦磷酸合酶活性的多肽；
[0088] 具有內(nèi)根-貝殼杉烯合酶活性的多肽；
[0089] 具有內(nèi)根-貝殼杉烯氧化酶活性的多肽;和
[0090] 具有貝殼杉烯酸13-輕化酶活性的多肽，
[0091] 通過所述核苷酸的表達(dá)使重組微生物具有至少能夠生產(chǎn)甜菊醇的能力。
[0092] 關(guān)鍵性地，所述重組微生物的基因組被修飾，使得其導(dǎo)致以下中的一種或多種的 產(chǎn)生缺陷：
[0093] (i)能夠作用于香葉基香葉基焦磷酸(GGPP)從而導(dǎo)致香葉基香葉醇(G0H)的形成 的磷酸酶；
[0094] (ii)能夠作用于法尼基焦磷酸(FPP)從而導(dǎo)致法尼醇和橙花叔醇的形成的磷酸 酶；
[0095] (1^)外-1，3_0葡聚糖酶；
[0096] (iv)糖原合酶(或者影響糖原積累的多肽）；
[0097] (v)缺氧基因的轉(zhuǎn)錄抑制子(R0X1)
[0098] (vi)NADPH 氧化酶;或者
[0099] (vii)單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)體(JEN1)
[0100 ] (v i i i)具有由開放閱讀框YJL064W編碼的活性的多肽;或者 [0101] (ix)具有由開放閱讀框YPL062W編碼的活性的多肽。
[0102] -種或多種以上的產(chǎn)生缺陷導(dǎo)致比不具有所述產(chǎn)生缺陷的重組微生物更高的二 萜或二萜糖苷生產(chǎn)。
[0103] 能夠作用于香葉基香葉基焦磷酸(GGPP)從而導(dǎo)致香葉基香葉醇(G0H)形成的磷酸 酶可以是具有所述活性的任何多肽，例如二?；视徒沽姿崃姿崦?，例如由DPP 1 (YDR284C) 編碼的那種。
[0104] 能夠作用于法尼基焦磷酸(FPP)從而導(dǎo)致法尼醇和橙花叔醇形成的磷酸酶可以是 具有所述活性的任何多肽，例如脂質(zhì)磷酸磷酸酶，例如由LPP1基因（YDR503C)編碼的那種。
[0105] 外-1，3-β葡聚糖酶可以是具有所述活性的任何多肽，例如由EXG1(YLR300W)或 EXG2(YDR261C)基因編碼的那種。
[0106] 糖原合酶（或者影響糖原積累的多肽）可以是具有所述活性的任何多肽，例如由 GSY1(YFR015C 或 YALI0F18502)或 GSY2(YLR258W)基因編碼的那種。
[0107] 缺氧基因的轉(zhuǎn)錄抑制子可以是具有所述活性的任何多肽，例如由R0X1基因 (YPR065W)編碼的那種。
[0108] NADPH氧化酶可以是具有所述活性的任何多肽，例如由YN01(YGL160W)基因編碼的 那種。
[0109] 單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)體可以是具有所述活性的任何多肽，例如由JEN1基因編碼的那種。
[0110] 具有由開放閱讀框YJL064W編碼的活性的多肽可以是具有所述活性的任何多肽。 具有由開放閱讀框YPL062W編碼的活性的多肽可以是具有所述活性的任何多肽。
[0112] 本文中提及的開放閱讀框和基因可在酵母屬基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（Saccharomyces Genome Database) (http://www·yeastgenome · com)中被石角定。
[0113] 本發(fā)明還涉及這樣的重組微生物，其中所述重組微生物的基因組已經(jīng)被修飾，使 得其導(dǎo)致以下中的一種或多種的產(chǎn)生缺陷：
[0114] (i)能夠作用于香葉基香葉基焦磷酸(GGPP)從而導(dǎo)致香葉基香葉醇(G0H)的形成 的磷酸酶，其包含與SEQ ID N0:225的序列同一性為至少約30%的氨基酸序列；
[0115] (ii)能夠作用于法尼基焦磷酸(FPP)從而導(dǎo)致法尼醇和橙花叔醇的形成的磷酸 酶，其包含與SEQ ID N0:227的序列同一性為至少約30%的氨基酸序列；
[0116] (iii)外-1，3-β葡聚糖酶，其包含與SEQ ID N0:229或231的序列同一性為至少約 30%的氨基酸序列；
[0117] (iv)糖原合酶(或者影響糖原積累的多肽），其包含與SEQ ID N0:233、235或250的 序列同一性為至少約30%的氨基酸序列；
[0118] (v)缺氧基因的轉(zhuǎn)錄抑制子，其包含與SEQ ID N0:237的序列同一性為至少約30% 的氨基酸序列；
[0119] (vi)NADPH氧化酶，其包含與SEQ ID N0:239的序列同一性為至少約30%的氨基酸 序列；
[0120] (vii)單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)體，其包含與SEQ ID N0:241的序列同一性為至少約30%的氨基 酸序列；
[0121] (viii)具有由開放閱讀框YJL064W編碼的活性的多肽，其包含與SEQ ID N0:243的 序列同一性為至少約30 %的氨基酸序列;或者
[0122] (ix)具有由開放閱讀框YJL062W編碼的活性的多肽，其包含與SEQ ID N0:245的序 列同一性為至少約30 %的氨基酸序列。
[0123] 本發(fā)明還涉及這樣的重組微生物，其中所述重組微生物的基因組已經(jīng)被修飾，使 得其導(dǎo)致以下中的一種或多種的產(chǎn)生缺陷：
[0124] (i)核酸，其編碼能夠作用于香葉基香葉基焦磷酸(GGPP)從而導(dǎo)致香葉基香葉醇 (G0H)形成的磷酸酶，其包含與SEQ ID N0:224的序列同一性為至少約60%的核酸序列；
[0125] (ii)核酸，其編碼能夠作用于法尼基焦磷酸(FPP)從而導(dǎo)致法尼醇和橙花叔醇形 成的磷酸酶，其包含與SEQ ID N0:226的序列同一性為至少約60%的核酸序列；
[0126] (iii)核酸，其編碼外-l，3-β葡聚糖酶，其包含與SEQIDN0:228或230的序列同一 性為至少約60 %的核酸序列；
[0127] (iv)核酸，其編碼糖原合酶（或者影響糖原積累的多肽），其包含與SEQ ID NO: 232、234或249的序列同一性為至少約60 %的核酸序列；
[0128] (v)核酸，其編碼缺氧基因的轉(zhuǎn)錄抑制子，其包含與SEQ ID N0:236的序列同一性 為至少約60 %的核酸序列；
[0129] (vi)核酸，其編碼NADPH氧化酶，其包含與SEQ ID N0:238的序列同一性為至少約 60%的核酸序列；
[0130] (vii)核酸，其編碼單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)體，其包含與SEQ ID N0:240的序列同一性為至少 約60 %的核酸序列；
[0131] (vi i i)核酸，其編碼具有由開放閱讀框YJL064W編碼的活性的多肽，其包含與SEQ ID N0:242的序列同一性為至少約60%的氨基酸序列;或者
[0132] (ix)核酸，其編碼具有由開放閱讀框YJL062W編碼的活性的多肽，其包含與SEQ ID NO :244的序列同一性為至少約60 %的氨基酸序列。
[0133] 重組微生物可包含上述修飾中的一種、兩種、三種、四種、五種、六種、七種、八種或 全部。重組微生物可包含上述修飾中的兩種或更多種的任意組合。
[0134] 重組微生物在至少一種本文所提及多肽的產(chǎn)生中缺陷被定義為表型特征，其中當(dāng) 在基本相同的條件下分析時(shí)，較之其基因組未被根據(jù)本發(fā)明修飾的重組微生物，細(xì)胞由于 基因組的修飾:a)產(chǎn)生較少所述多肽，和/或b)具有降低的由編碼所述多肽的基因轉(zhuǎn)錄的 mRNA的表達(dá)水平，和/或c)產(chǎn)生具有降低的蛋白活性或降低的蛋白比活性的多肽，和/或d) 產(chǎn)生較少由所述多肽產(chǎn)生的產(chǎn)物，以及這些可能性中的一種或多種的組合。
[0135]在該語境中，基因就此被定義為包含開放閱讀框(0RF)和其轉(zhuǎn)錄控制元件（啟動(dòng)子 和終止子)的多核苷酸，所述0RF是基因上的將被轉(zhuǎn)錄并且翻譯成蛋白序列的區(qū)域。
[0136] 因此，如果與基因組未被修飾的親本宿主細(xì)胞相比，微生物宿主細(xì)胞的缺陷可通 過測(cè)定由基因組被修飾的重組微生物產(chǎn)生的相關(guān)多肽的量和/或(比）活性來測(cè)量，和/或它 可以通過測(cè)定由編碼所述多肽的基因轉(zhuǎn)錄的mRNA的量來測(cè)量，和/或它可以通過測(cè)定如上 文定義的基因組被修飾的重組微生物中的所述多肽產(chǎn)生的產(chǎn)物的量來測(cè)量，和/或它可以 通過基因或基因組測(cè)序來測(cè)量。可使用對(duì)技術(shù)人員而言可得到的任何檢驗(yàn)，例如轉(zhuǎn)錄譜、 Northern印跡法、RT-PCR、Q-PCR和Western印跡法來測(cè)量多肽的產(chǎn)生缺陷。
[0137] 重組微生物的基因組修飾在本文中被定義為導(dǎo)致細(xì)胞基因組中的多核苷酸序列 改變的任何事件。修飾被解釋為一種/個(gè)或多種/個(gè)修飾?？赏ㄟ^典型的菌株改進(jìn)，隨機(jī)誘變 隨后選擇來引入修飾?？赏ㄟ^引入(插入）、替換或去除(缺失）核苷酸序列中的一個(gè)或多個(gè) 核苷酸來完成修飾。該修飾可例如在編碼序列或?qū)Χ嗪塑账岬霓D(zhuǎn)錄或翻譯而言必需的調(diào)節(jié) 元件中。例如，可插入或去除核苷酸，以引入終止密碼子、去除起始密碼子或使編碼序列的 開放閱