產(chǎn)l-蘇氨酸微生物和使用該微生物生產(chǎn)l-蘇氨酸的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及RNA聚合酶〇 32因子變體，并且涉及使用該微生物生產(chǎn)L-蘇氨酸的 方法。
【背景技術(shù)】
[0002] L-蘇氨酸，是一種必需氨基酸，被廣泛用作動(dòng)物飼料和食品的添加劑，并且被有效 用作醫(yī)藥和制藥用再水化溶液和合成材料。
[0003] L-蘇氨酸主要通過使用人工突變方法或基因重組方法開發(fā)的大腸桿菌 (Escherichia coli)或棒狀桿菌（Corynebacterium)發(fā)酵生產(chǎn)。源自野生型菌株（包括大 腸桿菌（Escherichia coil)、沙雷菌（Serratia)、普羅威登斯菌（Providencia)或棒狀桿 菌）的人工突變菌株被廣泛用于生產(chǎn)L-蘇氨酸。
[0004] 隨著基因重組技術(shù)的發(fā)展，通過隨機(jī)突變操縱具有L-蘇氨酸生產(chǎn)力的菌株的技 術(shù)已經(jīng)被報(bào)道為用于提高L-蘇氨酸生產(chǎn)力的位點(diǎn)特異性基因置換、基因擴(kuò)增與缺失等。已 開發(fā)了與蘇氨酸的生物合成有關(guān)的基因和用于增加這些基因表達(dá)的各種方法。但是仍然需 要能夠以高產(chǎn)量生產(chǎn)L-蘇氨酸的方法。
[0005] 全局轉(zhuǎn)錄機(jī)器的功能是控制所有細(xì)胞系統(tǒng)（原核的和真核的）的轉(zhuǎn)錄。全局轉(zhuǎn)錄 機(jī)器工程通過突變編碼全局性調(diào)控因子的核酸或控制其表達(dá)的啟動(dòng)子而提供包含特性改 進(jìn)的全局性調(diào)控因子的重組細(xì)胞，并且可通過該方法生產(chǎn)表型改進(jìn)的細(xì)胞。
[0006] σ因子為一類基于RNA聚合酶全酶的啟動(dòng)子偏好在調(diào)控全局轉(zhuǎn)錄中發(fā)揮重要作 用的全局性調(diào)控因子。σ因子是能使RNA聚合酶特異性結(jié)合到基因啟動(dòng)子的原核生物的轉(zhuǎn) 錄起始因子。每個(gè)σ因子響應(yīng)不同的環(huán)境條件而激活，并且每個(gè)RNA聚合酶分子都包含一 個(gè)〇因子亞基。眾所周知，大腸桿菌（E.coli)具有至少8個(gè)σ因子，并且σ因子的數(shù)量 變化取決于細(xì)菌種類。
[0007] 為了進(jìn)一步增強(qiáng)具有L-蘇氨酸生產(chǎn)力的大腸桿菌菌株的耐高溫壓力，本發(fā)明人 已經(jīng)進(jìn)行了研究以修飾編碼已知控制熱激應(yīng)答的σ 32的rpoH基因。因此，本發(fā)明人已經(jīng) 研發(fā)了調(diào)控轉(zhuǎn)錄機(jī)制的RNA聚合酶σ 32因子變體，使得蘇氨酸生產(chǎn)力即使在高溫下也沒有 極大降低，并且已經(jīng)將RNA聚合酶σ 32因子變體引入到產(chǎn)蘇氨酸菌株中，從而完成本申請(qǐng)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 摶術(shù)問題
[0009] 本申請(qǐng)的目的是提供RNA聚合酶σ 32因子變體。
[0010] 本申請(qǐng)的另一個(gè)目的是提供編碼RNA聚合酶〇32因子變體的核苷酸序列。
[0011] 本申請(qǐng)的又另一個(gè)目的是提供包含所述核苷酸序列的載體。
[0012] 本申請(qǐng)的又另一個(gè)目的是提供具有L-蘇氨酸生產(chǎn)力的埃希氏桿菌屬 (Escherichia)的重組微生物，其表達(dá)所述變體。
[0013] 本申請(qǐng)的又另一個(gè)目的是提供使用所述埃希氏桿菌屬的微生物生產(chǎn)L-蘇氨酸的 方法。
[0014] 摶術(shù)方案
[0015] 為了完成上述目的，本申請(qǐng)?zhí)峁┝司哂蠸EQ ID N0:17所示的氨基酸序列的RNA聚 合酶σ 32因子變體。
[0016] 本申請(qǐng)也提供了編碼RNA聚合酶σ 32因子變體的核苷酸序列。
[0017] 本申請(qǐng)也提供了具有L-蘇氨酸生產(chǎn)力的埃希氏桿菌屬的重組微生物，其表達(dá)所 述變體。
[0018] 本申請(qǐng)也提供了使用所述埃希氏桿菌屬的微生物生產(chǎn)L-蘇氨酸的方法。
[0019] 有益效果
[0020] 根據(jù)本申請(qǐng)，用包含編碼耐高溫應(yīng)激的RNA聚合酶σ 32因子變體的核苷酸序列的 載體轉(zhuǎn)化的菌株具有耐溫性并且也可以增加的產(chǎn)量生產(chǎn)L-蘇氨酸。因此，與常規(guī)菌株相 比，即使當(dāng)在高溫下培養(yǎng)時(shí)，它可以顯著高的生產(chǎn)力生產(chǎn)蘇氨酸。因此，它能被有效用于以 高產(chǎn)量生產(chǎn)蘇氨酸。
[0021] 發(fā)明詳沐
[0022] 下文將詳細(xì)描述本申請(qǐng)。
[0023] 本申請(qǐng)?zhí)峁┝司哂蠸EQ ID Ν0:17所示的氨基酸序列的RNA聚合酶σ 32因子變體。
[0024] 本文所用的術(shù)語"σ 32(〇32)因子"指的是稱為主要σ因子的全局性調(diào)控σ因 子，其在對(duì)數(shù)期控制熱激應(yīng)答并且由rpoH基因編碼。
[0025] 此外，與本申請(qǐng)變體的氨基酸序列具有至少80%，特別是至少90%，更特別是至 少95 %，并且尤其特別是至少99 %同源性的變體也包括在本申請(qǐng)的范圍內(nèi)。通過利用，例 如 Karlin 和 Altschul 的 BLAST 算法（參見 Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873 (1993))或 FASTA(參見Methods Enzymol.，183, 63(1990))可以測(cè)定氨基酸序列的同源性。已經(jīng)在該 BLAST算法(參見www. ncbi.nlm. nih. gov)的基礎(chǔ)上開發(fā)了稱為BLASTN和BLASTX的程序。 本申請(qǐng)的變體的范圍包括與所述變體的氨基酸序列相比具有缺失、插入和氨基酸取代等的 突變體，并且也包括具有密碼子取代的突變體。
[0026] 在本申請(qǐng)的實(shí)施方案中，變體選自通過將隨機(jī)突變引入野生型大腸桿菌菌株 W3110中而獲得的突變r(jià)poH DNA庫，并且選擇的變體命名為rp〇H2G6。分析提取的變體的 核苷酸序列，并且結(jié)果是，可以看出與野生型RNA聚合酶σ 32因子的氨基酸序列（SEQ ID NO: 16)相比，在變體的氨基酸序列中發(fā)生了突變（實(shí)施例3)。
[0027] 本申請(qǐng)還提供了編碼所述變體的核苷酸序列。
[0028] 在本申請(qǐng)的實(shí)施方案中，RNA聚合酶σ 32因子變體可特別具有SEQ ID N0:15所 示的核苷酸序列。
[0029] 在本申請(qǐng)的實(shí)施方案中，編碼所述變體的核苷酸序列的遺傳密碼可以是簡(jiǎn)并的。 在本文中，遺傳密碼簡(jiǎn)并性是在遺傳密碼中最后一個(gè)堿基是無意義的現(xiàn)象。如果開始兩個(gè) 堿基是相同的，即使當(dāng)在該位置的密碼子是不同的，它們編碼相同。
[0030] 因此，本申請(qǐng)的變體的核苷酸序列可與SEQ ID N0:15所示的核苷酸序列具有至少 80 %，特別是至少90 %，更特別是至少95 %，最特別是99 %的同源性。
[0031] 本申請(qǐng)也提供了包含所述核苷酸序列的載體。
[0032] 本申請(qǐng)所用的載體并無特別限制，并且可以是本領(lǐng)域已知的任何載體，只要它可 以在宿主中復(fù)制即可。通常使用的載體的實(shí)例包括天然或重組質(zhì)粒、粘粒、病毒和噬菌體。 例如，本申請(qǐng)所用的噬菌體載體或粘粒載體可以是pWE15、M13、XMBL3、XMBL4、λΙΧΙΙ、 AASHII、λΑΡΙΙ、AtlO、人1：11、〇1&1'〇1144、〇1&1'〇112]^等，并且本申請(qǐng)所用的質(zhì)粒載體可以 是pBR類型、pUC類型、pBluescriptll類型、pGEM類型、pTZ類型、pCL類型、pET類型等。 本申請(qǐng)所用的載體并無特別限制，并且可以是本領(lǐng)域已知的任何表達(dá)載體。具體而言，可以 使用 PACYC177 載體、pACYC184 載體、pCL 載體、pECCG117 載體、pUC19 載體、pBR322 載體、 PMW118載體或pCCIBAC載體。最特別是，可以使用pACYC177載體、pCL載體或pCCIBAC載 體。
[0033] 本申請(qǐng)?zhí)峁┝司哂蠰-蘇氨酸生產(chǎn)力的埃希氏桿菌屬的重組微生物，其表達(dá)所述 變體。
[0034] 在本申請(qǐng)中，所述變體的表達(dá)可通過用可操作地包含編碼所述變體的基因的重組 載體轉(zhuǎn)化或通過將編碼所述變體的多核苷酸插入到微生物的染色體中而獲得，但是不特別 限于此。
[0035] 本文所用的術(shù)語"轉(zhuǎn)化"意思是將包含編碼靶蛋白的多核苷酸的載體引入到宿主 細(xì)胞，從而能夠在宿主細(xì)胞中表達(dá)所述多核苷酸編碼的蛋白。可以使引入的多核苷酸插入 或位于宿主細(xì)胞的染色體中或染色體外，只要它能在宿主細(xì)胞中表達(dá)即可。此外，多核苷酸 包括編碼靶蛋白的DAN和RNA。只要多核苷酸可以被引入宿主細(xì)胞并且可以在其中表達(dá)，它 就可以以任何形式被引入。例如，可以以包括自我表達(dá)所需的所有元素的多核苷酸構(gòu)建體 的表達(dá)盒的形式將多核苷酸引入到宿主細(xì)