海參組織蛋白酶的膠原酶解活性檢測方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種酶解活性檢測方法，尤其涉及海參組織蛋白酶的膠原酶解活性檢測方法。
【背景技術】
[0002]膠原蛋白是機體組織的結構蛋白，其諸多生理功能已被系統(tǒng)研宄和廣泛認可。目前國內(nèi)膠原蛋白產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，隨著膠原蛋白產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，膠原蛋白酶解工藝中的關鍵生產(chǎn)要素一蛋白酶的需求也不斷增長。目前較為常用的膠原蛋白酶從來源上可分為植物蛋白酶(如菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶等)、動物蛋白酶(如胰蛋白酶、胃蛋白酶等)、微生物蛋白酶等。目前上述各類酶普遍存在膠原蛋白酶解效率不高的缺點，因此，研發(fā)新型高效膠原蛋白酶具有重要的應用價值。而作為該研發(fā)工作中的一環(huán)，膠原蛋白酶的膠原酶解活性功能評價分析技術非常重要，目前迫切需要有一套簡單可行且面向應用的方法技術。本發(fā)明專門用于人工表達的海參組織蛋白酶膠原蛋白酶解活性評價，具有簡單便利、準確可靠的特征，具有很高的應用價值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術提供一種適用于海參蛋白酶、能半定量化評價海參組織蛋白酶的膠原酶解活性、原料獲取便利的海參組織蛋白酶的膠原酶解活性檢測方法。
[0004]本發(fā)明解決上述技術問題所采用的技術方案為:海參組織蛋白酶的膠原酶解活性檢測方法，包括，其中:采用海參組織蛋白酶對膠原蛋白凝膠表面酶解產(chǎn)生的凹陷直徑進行酶解效果評價。對酶活性采用酶解直徑或面積進行評價，能得到半定量的結果?？梢詽M足大部分的酶活性評價需求，且較為準確。
[0005]為優(yōu)化上述技術方案，采取的措施還包括:檢測方法具有如下步驟:
1)膠原蛋白凝膠制作:利用日常生活中常見的富含膠原蛋白食品原料作為制作材料，經(jīng)過熬制、去脂肪、過濾去雜、PH值調(diào)整、固形物測定、倒板凝結步驟處理，制成膠原蛋白凝膠；
2)蛋白酶溶液配制:將蛋白酶標準品以1mg/mL、lmg/mL、0.lmg/mL、0.0lmg/mL及0.001mg/mL的濃度進行溶解制備酶液，測試用的海參組織蛋白酶采用蛋白酶標準品配置的濃度之一進行配制；
3)酶解曲線制作:取少量配制完成的標準蛋白酶及海參組織蛋白酶溶液，滴于膠原蛋白凝膠表面；加蓋密閉后恒溫酶解；迅速將酶解后的平板放入低溫環(huán)境，待冷卻后，快速測量酶解形成圓形凹陷的表面直徑，統(tǒng)計分析直徑數(shù)據(jù)，制作酶解曲線；
4)海參組織蛋白酶活性分析:以海參組織蛋白酶酶解形成的凹陷直徑數(shù)據(jù)比對標準蛋白酶酶解數(shù)據(jù)制作的酶解曲線，查找海參組織蛋白酶對應的標準蛋白酶濃度特征，換算查得海參組織蛋白酶活性相對值。步驟I)中，富含膠原蛋白食品原料選自魚皮或雞爪或豬皮；所述熬制過程溫度為85-125°C，熬制時間為5-30min，可通過離心及冷凍去除脂肪。步驟I)中，可利用HCl和NaOH等酸堿進行溶液pH值調(diào)整，根據(jù)不同膠原蛋白原料特性，調(diào)整固形物濃度為10-50%，利用常用的盤碟、培養(yǎng)皿等作為倒板器皿。步驟2)中，所使用的蛋白酶一般選擇膠原蛋白酶解活性較強的復合酶作為標準品，所配制的酶液需調(diào)整PH至酶活性最佳條件，海參組織蛋白酶樣品配置的PH—般為3.5-8.5，配制終濃度為lmg/mL。步驟3)中，蛋白酶溶液一般取5-500微升，使用培養(yǎng)皿蓋、保鮮膜等封閉蛋白酶液及膠原凝膠，小心轉移至水浴鍋、恒溫培養(yǎng)箱等設備中，保持20-60°C條件酶解10-60min。所述步驟中，酶解結束后應將平板迅速放入零下低溫環(huán)境，以抑制酶解；之后測量酶解形成圓形凹陷的表面直徑，統(tǒng)計分析直徑數(shù)據(jù)，制作酶解曲線。
[0006]由于本發(fā)明采用了采用海參組織蛋白酶對膠原蛋白凝膠表面酶解產(chǎn)生的凹陷直徑進行酶解效果評價。對酶活性采用酶解直徑或面積進行評價，能得到半定量的結果?？梢詽M足大部分的酶活性評價需求，且較為準確。因而本發(fā)明具有適用于海參蛋白酶、能半定量化評價海參組織蛋白酶的膠原酶解活性、原料獲取便利的優(yōu)點。
【附圖說明】
[0007]圖1為本發(fā)明實施例滴加酶液時的狀態(tài)示意圖；
圖2為本發(fā)明實施例酶解13min后形成的圓形酶解凹陷。
【具體實施方式】
[0008]以下結合附實施例對本發(fā)明作進一步詳細描述。
[0009]實施例:參照圖1至圖2，海參組織蛋白酶的膠原酶解活性檢測方法，包括，其中:采用海參組織蛋白酶對膠原蛋白凝膠表面酶解產(chǎn)生的凹陷直徑進行酶解效果評價。對酶活性采用酶解直徑或面積進行評價，能得到半定量的結果?？梢詽M足大部分的酶活性評價需求，且較為準確。檢測方法具有如下步驟:
1)膠原蛋白凝膠制作:利用日常生活中常見的富含膠原蛋白食品原料作為制作材料，經(jīng)過熬制、去脂肪、過濾去雜、PH值調(diào)整、固形物測定、倒板凝結步驟處理，制成膠原蛋白凝膠；
2)蛋白酶溶液配制:將蛋白酶標準品以1mg/mL、lmg/mL、0.lmg/mL、0.0 lmg/mL及0.001mg/mL的濃度進行溶解制備酶液，測試用的海參組織蛋白酶采用蛋白酶標準品配置的濃度之一進行配制；
3)酶解曲線制作:取少量配制完成的標準蛋白酶及海參組織蛋白酶溶液，滴于膠原蛋白凝膠表面；加蓋密閉后恒溫酶解；迅速將酶解后的平板放入低溫環(huán)境，待冷卻后，快速測量酶解形成圓形凹陷的表面直徑，統(tǒng)計分析直徑數(shù)據(jù)，制作酶解曲線；
4)海參組織蛋白酶活性分析:以海參組織蛋白酶酶解形成的凹陷直徑數(shù)據(jù)比對標準蛋白酶酶解數(shù)據(jù)制作的酶解曲線，查找海參組織蛋白酶對應的標準蛋白酶濃度特征，換算查得海參組織蛋白酶活性相對值。步驟I)中，富含膠原蛋白食品原料選自魚皮或雞爪或豬皮；所述熬制過程溫度為85-125?，熬制時間為5-30min，可通過離心及冷凍去除脂肪。步驟I)中，可利用HCl和NaOH等酸堿進行溶液pH值調(diào)整，根據(jù)不同膠原蛋白原料特性，調(diào)整固形物濃度為10-50%，利用常用的盤碟、培養(yǎng)皿等作為倒板器皿。步驟2)中，所使用的蛋白酶一般選擇膠原蛋白酶解活性較強的復合酶作為標準品，所配制的酶液需調(diào)整pH至酶活性最佳條