海洋微生物發(fā)酵生產低溫葡甘聚糖酶的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及微生物學、生物化學、酶工程、發(fā)酵工程等領域，具體涉及一種低溫葡甘聚糖酶海洋微生物發(fā)酵生產的方法。
【背景技術】
[0002]葡甘聚糖酶(Glucomannanase)是一種能將葡甘聚糖降解為葡甘低聚糖的可誘導細胞外泌酶(董桂清，廣西輕工業(yè)，2007)。葡甘低聚糖屬于功能性低聚糖，具有極其顯著的降脂作用，可以作為高血脂、糖尿病輔助治療產品(Hsiao-Ling Chen, Journal oftheAmerican College ofNutrit1n, 2003);因其能夠減少腸內氨的生成和吸收，可以減輕肝臟對血氨的解毒負擔(陳黎，中國生化藥物雜志，2003);同時葡甘低聚糖能夠提高體內超氧化物歧化酶活性，增強機體抗氧化能力(楊艷燕，中草藥，2001)。但是目前有關葡甘低聚糖產品，只有少量出現在國外市場，國內基本無此類產品(周海燕，中國生物工程雜志，2005)。
[0003]國內對于葡甘聚糖酶的研宄尚處于起步階段，主要包括菌種選育、產酶條件優(yōu)化、酶分離純化、酶學性質、基因克隆等(周海燕，湖北農業(yè)科學，2005;董桂清，廣西輕工業(yè)，2007 ;許劍，基因組學與應用生物學，2012 ;)。海洋微生物發(fā)酵生產低溫葡甘聚糖酶的產業(yè)化、規(guī)?；a及應用還未見報道。海洋微生物發(fā)酵生產低溫葡甘聚糖酶與中、高溫葡甘聚糖酶相比具有很大的應用優(yōu)勢:低溫酶在低溫下具有高酶活力及高催化效率，可大大縮短處理時間并省卻昂貴的加熱或冷卻費用；在節(jié)能方面也有相當大的優(yōu)勢；經過溫和的熱處理即可使低溫酶的活力喪失，而低溫或適溫處理不會影響產品的品質(陳秀蘭等，中國農業(yè)科技導報，2007)。這些特性將有助于海洋微生物發(fā)酵生產低溫葡甘聚糖酶的推廣和使用。低溫葡甘聚糖酶的應用將對傳統(tǒng)的食品、醫(yī)藥等領域產生深遠的影響。因此，海洋微生物發(fā)酵葡甘聚糖酶工業(yè)化生產可創(chuàng)造良好的經濟效益和社會效益(周海燕，中國生物工程雜志，2005) ο

【發(fā)明內容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供海洋微生物發(fā)酵生產低溫葡甘聚糖酶的方法，該方法主要是海洋微生物經過低溫馴化后，在24?30°C液體培養(yǎng)基中發(fā)酵生產低溫葡甘聚糖酶，這種生產方法獲得的低溫葡甘聚糖酶粗酶液活性可以達到3587U/mL，如再經過分離和純化，可以得到不同濃度和純度的酶制劑。
[0005]本發(fā)明所述的海洋微生物發(fā)酵生產低溫葡甘聚糖酶的方法具體包括以下步驟:
[0006](I)將能產生葡甘聚糖酶的菌種活化，再經過逐級低溫馴化，馴化溫度由高到低，30°C — 28°C — 26°C — 24°C，使其在低溫環(huán)境中生長良好，當菌種能在低溫下穩(wěn)定生長即馴化結束；該菌種的低溫馴化培養(yǎng)基按重量百分比計包含:魔芋精粉0.4?1.0%，NaNO30.2 ?0.7 %，MgSO4.7H20 0.3 ?0.5 %，KCl 0.3 ?0.5 %，K2HPO40.1 ?0.3 %，FeSO4.7H20 0.001 ?0.004%，瓊脂 1.8 ?2.0%，自來水 lOOmL，pH 值為 6.0 ?6.5，于0.1MPa、115°C蒸汽滅菌 15min ；
[0007]所述的能產生葡甘聚糖酶的菌種來源于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，菌種編號:1.2244或1.504或1.775或5.809 ；
[0008](2)按常規(guī)方法將步驟⑴中低溫馴化后的葡甘聚糖酶產生菌在液體種子培養(yǎng)基上于24?30°C逐級擴大培養(yǎng)，制備成液體一級種子和二級種子；所述的液體種子培養(yǎng)基按重量百分比計包含:魔芋精粉0.4?1.0%，酵母膏0.4?0.9%，蛋白胨0.3?1.0%，NaNO30.2 ?0.7 %，MgSO4.7H20 0.3 ?0.5 %，KCl 0.3 ?0.5 %，K2HPO40.1 ?0.3 %，FeSO4.7H20 0.001 ?0.004%,自來水 10mL, pH 值為 6.0 ?6.5，于 0.1MPa、115°C蒸汽滅菌 15min ；
[0009](3)將液體二級種子按發(fā)酵液體積的3?9%接種量接入液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在24?30°C培養(yǎng)72?144h時，即海洋微生物發(fā)酵生產低溫葡甘聚糖酶結束；所述的液體發(fā)酵培養(yǎng)基按重量百分比計包含:魔芋精粉0.4?4.0%，NaNO30.2?0.7%，MgSO4.7H20
0.3 ?0.5%，KCl 0.3 ?0.5%，K2HPO40.1 ?0.3%，FeSO4.7H20 0.001 ?0.004%,自來水 10OmT,, pH 值為 6.0 ?6.5，于 0.1MPa、115°C蒸汽滅菌 15min ；
[0010](4)將步驟(3)的發(fā)酵液在4，000?8，OOOrpm離心收集上清液，收集到的液體即為粗酶液；
[0011](5)根據不同需要和使用對象不同，將(4)得到的粗酶液進一步濃縮、分離純化，制備成不同活性、純度和劑型的酶制劑。
[0012]進一步的，步驟(I)產生葡甘聚糖酶菌種的活化培養(yǎng)基按重量百分比計包含:魔芋精粉0.4?1.0%，酵母膏0.4?0.9%，蛋白胨0.3?1.0%，NaCl 0.3?0.7%，瓊脂
1.8 ?2.0%，自來水 10OmT,,于 0.1MPa、115°C蒸汽滅菌 15min。
[0013]本發(fā)明使用的菌種初期活化和生長條件按中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)提供的說明進行。菌株先活化、逐級低溫馴化后，按本發(fā)明產酶條件發(fā)酵生產低溫葡甘聚糖酶，低溫馴化后的菌株在4°C環(huán)境中可保存2個月，用25?504%甘油制成的菌懸液在_80°C條件下可以長期保藏。
[0014]與現有技術相比，本發(fā)明的有益效果是:
[0015](I)本發(fā)明利用海洋微生物發(fā)酵生產低溫葡甘聚糖酶，經過溫和的熱處理即可使低溫酶的活力喪失，而低溫或適溫處理不會影響產品的品質，特別是在低溫下具有高酶活力及高催化效率，改善并提高產品質量；
[0016](2)本發(fā)明簡化了生產工藝，縮短加工時間，在節(jié)能方面有很大優(yōu)勢；
[0017](3)本發(fā)明方法制得的生產的低溫葡甘聚糖酶在應用上操作簡單、方便、快捷，可以將葡甘聚糖降解為不同聚合度的功能性葡甘低聚糖，該低聚糖具有降血糖、降血脂、抗氧化等生理功能，在食品、醫(yī)藥等方面具有較大應用價值，低溫葡甘聚糖酶還可以提高原料利用率及生產效率，降低成本，其應用前景廣闊。
【具體實施方式】
[0018]下面通過【具體實施方式】對本發(fā)明做進一步說明，但并不限制本發(fā)明。如無特殊說明，本發(fā)明所用原料均市售可得，優(yōu)選的，魔芋精粉購自武漢市清江魔芋制品有限公司。
[0019]實施例1
[0020]I)培養(yǎng)基制備
[0021]①菌種活化培養(yǎng)基(wt %):魔芋精粉0.4%，酵母膏0.4%，蛋白胨0.3%，NaCl0.5%，瓊脂 1.8%, pH 自然，自來水 100mL，于 0.1MPa、115°C蒸汽滅菌 15min ；
[0022]②菌種低溫馴化培養(yǎng)基(wt% ):魔芋精粉0.4%,NaNO30.2%,MgSO4.7Η20 0.3%,KCl 0.3 %, K2HPO40.1%, FeSO4.7Η20 0.001 %，瓊脂 1.8 %，自來水 10mL, pH 6.5，于0.1MPa、115°C蒸汽滅菌 15min ；
[0023]③液體種子培養(yǎng)基(wt % ):魔芋精粉0.4%，酵母膏0.4%，蛋白胨0.3%，NaNO30.2 %，MgSO4.7H20 0.3 %，KCl 0.3%, K2HPO40.1 %，FeSO4.7H20 0.001%, g 來水10OmT,, pH 6.5，于 0.1MPa、115°C蒸汽滅菌 15min ；
[0024]④液體發(fā)酵培養(yǎng)基(wt%):魔芋精粉 0.4%,NaNO30.2%,MgSO4.7Η20 0.3%, KCl0.3%, K2HPO40.1 %, FeSO4.7Η20 0.001%,自來水 lOOmL，ρΗ6.5，于 0.1MPa、115°C 蒸汽滅菌15min ；
[0025]2)將產生葡甘聚糖酶的菌種，按中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)提供的菌株說明進行初始活化；
[0026]3)活化好的菌種于低溫馴化培養(yǎng)基中逐級低溫馴化，馴化溫度由高到低，30°C — 28°C — 26°C — 24°C，馴化8天左右，使其在低溫環(huán)境中生長良好，當菌種能在低溫環(huán)境中穩(wěn)定生長即馴化結束；
[0027]4)按常規(guī)方法將低溫馴化后的葡甘聚糖酶產生菌在液體種子培養(yǎng)基中于24?26°C培養(yǎng)48?72h后，按5vt%的接種量進行逐級擴大培養(yǎng)，制備成液體一級種子和二級種子;
[0028]5)將4)制備的二級種子按發(fā)酵液體積3?5%的接種量接入5L的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在24?26°C培養(yǎng)120?144h時，即海洋微生物發(fā)酵生產低溫葡甘聚糖酶結束；
[0029]6)將5)的發(fā)酵液在4，000?8，OOOrpm離心收集上清液，收集到的液體即為粗酶液；粗酶液活性可以達到3500U/mL ；
[0030]7)根據不同需要和使用對象不同，將6)得到的粗酶液進一步濃縮、分離純化，制備成不同活性、純度和劑型的低溫葡甘聚糖酶制劑