一種長效的重組人粒細(xì)胞集落刺激因子的及其制備方法和用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬生物制藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及人粒細(xì)胞集落刺激因子的重組融合蛋白，具體涉及一種長效的重組人粒細(xì)胞集落刺激因子及其制備方法和用途。本發(fā)明在保持人粒細(xì)胞集落刺激因子的原有活性的前提下，延長該蛋白質(zhì)在體內(nèi)的半衰期，進(jìn)一步用于制備抗放化療或其他原因造成的中性粒細(xì)胞減少癥以及骨髓抑制的藥物。
【背景技術(shù)】
[0002]據(jù)報道，惡性腫瘤是當(dāng)前嚴(yán)重影響人類健康、威脅人類生命的主要疾病之一。據(jù)統(tǒng)計，2007年全球有760萬人死于癌癥，其中有大約24%發(fā)生在中國，并呈現(xiàn)出逐步年輕化的趨勢。目前癌癥的治療仍以手術(shù)、放療和化療為主要治療手段，其中，放療和化療會大量殺傷人體正常的白細(xì)胞，造成病人骨髓抑制、免疫力低下，容易引發(fā)各種感染等并發(fā)癥。
[0003]研究顯示,重組人粒細(xì)胞集落刺激因子(Recombinant human granulocyte colonystimulating factor, rhG-CSF)與人體自身分泌的粒細(xì)胞集落刺激因子相似或相同，主要作用于中性粒細(xì)胞系造血細(xì)胞的增殖、分化和活化；能刺激骨髓造血祖細(xì)胞中中性粒細(xì)胞集落的形成，延長成熟中性粒細(xì)胞的存活時間(Roberts Aff.G-CSF.A key regulator ofneutrophil product1n, but that，，s not all ! Growth Factors.2005 ；23 (I): 33 - 41 ；Demetri GD, Griffin JD.Granulocyte colony stimulating factor and its receptor.Blood.1991 ;78(II):2791-2808 ;DeJesus CE,Egen J,Metzger M, et al.Transientneutropenia after granulocyte-colony stimulating factor administrat1n isassociated with neutrophil accumulat1n in pulmonary vasculature.ExperimentalHematology.2011 ；39(2): 142-150.)，臨床上主要用于治療腫瘤化療后的中性粒細(xì)胞減少癥等疾病，其應(yīng)用量巨大。目前國內(nèi)主要銷售的該類藥物有:瑞白，惠爾血等，至2010年，該類藥物的銷售額已經(jīng)達(dá)到近10億元。但臨床實踐顯示，該類藥物在體內(nèi)半衰期較短，通常只有 4-6 小時(Yoshida Tl, Nakamura S，Ohtake S, Okafuji K, Kobayashi K, Kondo K, KannoM, Matano S，Matsuda T, Kanai M, et al.Effect of granulocyte colony-stimulatingfactor on neutropenia due to chemotherapy for non-Hodgkin’s lymphoma.Cancer.1990 ;66 (9): 1904-9.)，因此，患者需要每天注射以維持藥效，病人耐受較差。
[0004]有研究公開了對重組人粒細(xì)胞集落刺激因子的長效化改造中，制備了聚乙二醇修飾的重組人粒細(xì)胞集落刺激因子，其中，長效重組人粒細(xì)胞集落刺激因子產(chǎn)品Neulasta (pegfilgrastim)是PEG化的G-CSF,于2002年被美國FDA批準(zhǔn)上市；所述Neulasta在體內(nèi)半衰期和藥效方面顯示了其較同類產(chǎn)品有較明顯的提升，患者只需在每次化療前注射一次即可在化療中保持原本的粒細(xì)胞水平，極大地減少了患者的痛苦；目前，該藥物價格昂貴，每支售價5000美元，國內(nèi)尚無該進(jìn)口藥，在研的G-CSF-Fc等融合蛋白類藥物尚處于臨床或臨床前階段。
[0005]CTP (Carboxyl-Terminal Peptide of Human Chor1nicGonadotropin β -Subunit)是由人域毛膜促性腺激素(hCG) β亞基端118位到145位的氨基酸所組成的短肽。研究發(fā)現(xiàn)，hCG的體內(nèi)半衰期相比其他生長激素類的要長，而HCG的β亞基C端的CTP在其中起了相當(dāng)重要的作用(Bouloux PM, Handelsman DJj Jockenh velF，et al.First human exposure to FSH-CTP in hypogonadotrophic hypogonadal males.Human reproduct1n.2001；16(8):1592-1597 ；Duijkers IJ，Klipping C，BoerrigterPJj et al.Single dose pharmacokinetics and effects on follicular growth andserum hormones of a long-acting recombinant FSH preparat1n (FSH-CTP) in healthypituitary-suppressed females.Human reproduct1n.2002 ； 17(8):1987-1993 ；MatzukMM，Hsueh AJ，Lapolt P，et al.The b1logical role of the carboxyl-terminalextens1n of human chor1nic gonadotropin [corrected]beta-subunit.Endocrinology.1990 ；126(1): 376-383.)，表明CTP融合蛋白可能比野生型蛋白質(zhì)具有更長的半衰期。還有研究對CTP-FSH(卵泡刺激素)CTP-TSH0 (促甲狀腺激素)研究發(fā)現(xiàn)(Fares FAj Suganuma N，Nishimori K，et al.Design of a long-acting follitropinagonist by fusing the Cterminal sequence of the chor1nic gonadotropinβ -subunit to the follitropin β -subunit.Proc Natl Acad Sci USA 1992 ；89 (10):4304 - 4308 ；LaPolt PSj Nishimori Kj Fares FAj Perlas E，Boime I，Hsueh AJff.Enhanced stimulat1n of follicle maturat1n and ovulatory potential by longacting follicle-stimulating hormone agonists with extended carboxyl-terminalpeptides.Endocrinology.1992 ; 131 (6):2514 - 2520)，CTP-hCG a (Furuhashi M，ShikoneT，F(xiàn)ares FA，Sugahara T，Hsueh AJ，Boime 1.Fusing the carboxy-terminal peptide ofthe chor1nic gonadotropin (CG) β-subunit to the common β-subunit:retent1n ofOlinked glycosylat1n and enhanced in vivo b1activity of chimeric human CG.MolEndocrinol.1995 ；9 (I):54 - 63)，(Joshi L，Murata Y，Wondisford FE，SzkudlinskiMWj Desai R，Weintraub BD.Recombinant thyrotropin containing a β -subunit chimerawith the human chor1nic gonadotropin-β carboxy terminus is b1logicallyactive, with a prolonged plasma half_life:role of carbohydrate in b1activityand metabolic clearance.Endocrinology.1995 ；136 (9):3839 - 3848)，重組CTP 融合蛋白的生物活性及其它性質(zhì)和野生型蛋白質(zhì)相比幾乎沒有差異，但是半衰期則相對要長得多；證明了重組CTP融合蛋白不但具有良好的生物學(xué)活性，而且還具有較長的體內(nèi)半衰期。
[0006]目前延長蛋白半衰期的方法主要是利用PEG進(jìn)行化學(xué)修飾，其優(yōu)點是反應(yīng)簡單，能顯著地增加被修飾蛋白質(zhì)的體內(nèi)半衰期；其缺點是修飾后蛋白分子量急劇增加，不利于體內(nèi)代謝；化學(xué)修飾物多為異源物質(zhì)，經(jīng)常使用可能會引起人體的免疫應(yīng)答；而且化學(xué)修飾后會使原有蛋白質(zhì)的生物活性明顯降低，一般僅為修飾前的10% ;另外化學(xué)修飾的最終產(chǎn)物需要多進(jìn)行一次純化，得率相對較低，而且修飾劑本身價格不菲，生產(chǎn)成本相對較高。
[0007]基于上述現(xiàn)狀，本申請的發(fā)明人擬提供一種長效的重組人粒細(xì)胞集落刺激因子的及其制備方法和用途，使制得的人粒細(xì)胞集落刺激因子的重組融合蛋白保持人粒細(xì)胞集落刺激因子