Pcsk9抗體、其藥物組合物及其用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于免疫學(xué)和分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種PCSK9抗體、其藥物組合物及其 用途。具體地，本發(fā)明涉及PCSK9的單克隆抗體。
【背景技術(shù)】
[0002] 前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草桿菌蛋白酶Kexin-9型（Proproteinconvertasesubtilisin/ kexintype9，PCSK9)是一種具有前蛋白轉(zhuǎn)化酶活性的枯草溶菌素蛋白酶。PCSK9在肝臟、 小腸和腎臟中表達(dá)量較多，在皮膚、神經(jīng)系統(tǒng)中有少量表達(dá)。肝臟中的PCSK9可以分泌到 血循環(huán)中，并通過結(jié)合與內(nèi)吞作用降低細(xì)胞表面低密度脂蛋白受體（LDLreceptor，LDLR) 的數(shù)目。因?yàn)長DLR可以從血漿中高效消除LDL，LDLR受體數(shù)量減少可促使LDL積聚，所以 PCSK9所介導(dǎo)的LDLR降解，可以提高血漿低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C)的水平。PCSK9參 與富含甘油三脂的載脂蛋白B的脂代謝，PCSK9的分泌能提高腸道甘油三脂（TG)的水平，從 而參與誘發(fā)高膽固醇血癥（RashidS.，etal·，Proproteinconvertasesubtilisinkexin type9promotesintestinaloverproductionoftriglyceride-richapolipoprotein Blipoproteinsthroughbothlow-densitylipoproteinreceptor-dependent and-independentmechanisms.Circulation. 2014Jul29 ; 130 (5):431-4L)〇
[0003] 高膽固醇血癥病人中有29%的病人在使用他汀類藥物。不能耐受他汀類藥物和他 汀類藥物不能達(dá)到所需血脂膽固醇水平的患者占高膽固醇血癥病人的8. 2%。全球七大藥 物市場（不包括中國）共有高膽固醇血癥病人3億9千萬。2004年10月12日，衛(wèi)生部公 布的《中國居民營養(yǎng)與健康狀況調(diào)查》報告顯示，我國成人高血壓患病率為18. 8%，估計全 國患病總數(shù)為1. 6億人，比1991年增加了 7000多萬人。全國血脂異?；颊咭惨堰_(dá)到1. 6 億人。
[0004]目前，尚需要開發(fā)新的能夠特異作用于人類PCSK9的免疫治療抗體，其可結(jié)合至PCSK9并阻斷PCSK9與LDLR的結(jié)合。阻斷PCSK9與LDLR的結(jié)合可以提高細(xì)胞表面LDLR的 數(shù)量，提高LDL和所攜帶膽固醇的代謝，防治和減少高膽固醇血癥所引起的心血管疾病。尤 其需要開發(fā)高效能的PCSK9抗體，其還能夠同時提高甘油三脂（TG)代謝或降低TG水平，甚 至能夠在較長的時間內(nèi)維持功效。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明人經(jīng)過深入的研究和創(chuàng)造性的勞動，得到了一種PCSK9單克隆抗體。本發(fā) 明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的單克隆抗體能夠很好地特異性與PCSK9結(jié)合，并且能夠十分有 效地阻斷PCSK9與LDLR的結(jié)合，提高細(xì)胞表面LDLR的數(shù)量，提高LDL和所攜帶膽固醇的代 謝，提高甘油三脂（TG)代謝，具有用于制備防治高膽固醇血癥所引起的心血管疾病的藥物 的潛力。由此提供了下述發(fā)明：
[0006] 本發(fā)明的一個方面涉及一種單克隆抗體，其包括：
[0007] 重鏈可變區(qū)，其包含氨基酸序列為（或者包含）SEQIDN0:17 - 19的⑶R;和/或
[0008] 輕鏈可變區(qū)，其包含氨基酸序列為（或者包含）SEQIDNO: 20 - 22的⑶R。
[0009] 抗體治療藥物，特別是單克隆抗體（MAB)已在多種疾病的治療中取得了良好的療 效。獲取這些治療性抗體的傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)方法是采用抗原免疫動物，在免疫動物體內(nèi)獲取靶向 抗原的抗體，或通過親和力成熟的方法來改進(jìn)那些與抗原的親和力較低的抗體。然而，這些 方法需要大量時間和精力，大多數(shù)時候也并不能針對抗原上的特定表位。
[0010] 輕鏈和重鏈的可變區(qū)決定抗原的結(jié)合；每條鏈的可變區(qū)均含有三個高變區(qū)，稱互 補(bǔ)決定區(qū)（CDR)(重鏈（H)的CDR包含HCDR1、HCDR2、HCDR3,輕鏈（L)的CDR包含LCDR1、 LCDR2、LCDR3;其由Kabat等人命名，見SequencesofProteinsofImmunological Interest,FifthEdition(1991)，第 1-3 卷，NIHPublication91-3242,BethesdaMd)〇
[0011] 本發(fā)明人創(chuàng)造性地構(gòu)建了 6個CDR區(qū)的氨基酸序列，并做特定修改以提高抗體可 變區(qū)對抗原的結(jié)合活性。為配合在CDR區(qū)的改動，框架區(qū)也同時被修改，但是需要確保這些 框架區(qū)的修改仍與人源的種系序列相兼容?？蚣艿男薷囊矊⑼瑫r進(jìn)行分析，以確保這些改 變對CDR區(qū)與抗原的結(jié)合沒有影響。
[0012] 本發(fā)明重鏈可變區(qū)的3個⑶R如下：
[0013]HCDR1：GFTFSSYS(SEQIDNO：17)
[0014]HCDR2：ISSSSSYI(SEQIDNO： 18)
[0015]HCDR3：EYDFWSAYYDAFDV(SEQIDNO： 19)
[0016] 輕鏈可變區(qū)的3個⑶R如下：
[0017]LCDR1:SRNIGGGND(SEQIDNO:20)
[0018]LCDR2:GVI(SEQIDNO:21)
[0019] LCDR3:QSFDGSLSGSV(SEQIDNO:22)。
[0020] 在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，涉及一種單克隆抗體，其包括：
[0021] 重鏈可變區(qū)，其氨基酸序列為（或者包含）SEQIDN0:14 ;和/或
[0022] 輕鏈可變區(qū)，其氨基酸序列為（或者包含）SEQIDN0:16。通過本領(lǐng)域技術(shù)人員所 熟知的技術(shù)手段，例如通過美國國立生物技術(shù)信息中心網(wǎng)站（NCBI)，分析該單克隆抗體重 鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的互補(bǔ)決定區(qū)（⑶R)，其亦分別如上面的SEQIDN0:17 - 19和SEQ IDN0:20 - 22所示。在本發(fā)明中，將該單克隆抗體命名為ΜΑΒΙ。
[0023] 根據(jù)本發(fā)明任一項(xiàng)所述的單克隆抗體，其中，其重鏈恒定區(qū)為小鼠抗體的重鏈恒 定區(qū)或人抗體的重鏈恒定區(qū)，其輕鏈恒定區(qū)為小鼠抗體的輕鏈恒定區(qū)或人抗體的輕鏈恒定 區(qū)。
[0024] 本發(fā)明的另一方面涉及一種分離的核酸序列，具體地，所述核酸序列為SEQID NO: 13和SEQIDNO: 15所示的核苷酸序列；其編碼SEQIDNO: 14和SEQIDNO: 20所示的 氨基酸序列。
[0025] 本發(fā)明的再一方面涉及一種核酸構(gòu)建體，其含有本發(fā)明任一項(xiàng)所述的核苷酸序 列；具體地，所述核酸構(gòu)建體為重組表達(dá)載體；更具體地，為重組原核表達(dá)載體或重組真核 表達(dá)載體。
[0026] 本發(fā)明的再一方面涉及一種重組宿主細(xì)胞，其含有本發(fā)明任一項(xiàng)所述的核酸構(gòu)建 體；具體地，所述重組宿主細(xì)胞為重組原核細(xì)胞或者重組真核細(xì)胞。
[0027] 本發(fā)明的再一方面涉及一種單克隆抗體偶聯(lián)物，包括單克隆抗體和偶聯(lián)部分，其 中，所述單克隆抗體為本發(fā)明中任一項(xiàng)所述的單克隆抗體，所述偶聯(lián)部分為選自放射性核 素、藥物、毒素、細(xì)胞因子、酶、熒光素、和生物素中的一種或多種；具體地，所述偶聯(lián)部分為 蓖麻毒素；更具體地，所述偶聯(lián)部分為蓖麻毒素A鏈。
[0028] 本發(fā)明的再一方面涉及本發(fā)明中任一項(xiàng)所述的單克隆抗體或者本發(fā)明任一項(xiàng)所 述的單克隆抗體偶聯(lián)物在制備預(yù)防和/或治療和/或輔助治療高血壓、高膽固醇、高膽固醇 血癥及其所引起的心血管疾病的藥物中的用途。
[0029] 本發(fā)明的再一方面涉及本發(fā)明中任一項(xiàng)所述的單克隆抗體或者本發(fā)明任一項(xiàng)所 述的單克隆抗體偶聯(lián)物在制備如下的藥物或者試劑中的用途：
[0030] 特異性與PCSK9結(jié)合的藥物或者試劑，
[0031] 阻斷PCSK9與LDLR結(jié)合的藥物或者試劑，
[0032] 提高細(xì)胞表面LDLR數(shù)量或者血漿中LDLR水平的藥物或試劑，
[0033] 降低血漿中LDL或LDL-C水平的藥物或試劑，
[0034] 降低血漿中TG水平的藥物或試劑，
[0035] 抑制血漿中LDL積聚的藥物或試劑，
[0036] 抑制PCSK9所介導(dǎo)的LDLR降解的藥物或試劑，或者
[0037] 提高LDL所攜帶膽固醇的代謝水平和/或提高TG代謝水平的藥物或者試劑。
[0038] 本發(fā)明人還通過實(shí)驗(yàn)（體內(nèi)實(shí)驗(yàn)）發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的PCSK9抗體能夠有效地降低血 漿中LDL和/或LDL-C水平，并且能在更長時間（可達(dá)17天）降低血漿中LDL和/或LDL-C 水平。特別是出乎意料地發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的PCSK9抗體還能降低體內(nèi)血清的TG水平，并且效 果能夠維持長達(dá)13天。目前現(xiàn)有技術(shù)中，尚未有任何PCSK9抗體能夠?qū)崿F(xiàn)這一技術(shù)效果。
[0039] 本發(fā)明的再一方面涉及一種在體內(nèi)或體外的方法，包括使用有效量的本發(fā)明中任 一項(xiàng)所述的單克隆抗體或者本發(fā)明任一項(xiàng)所述的單克隆抗體偶聯(lián)物的步驟，所述方法選自 如下：
[0040] 治療和/或預(yù)防和/或輔助治療高血壓、高膽固醇、高膽固醇血癥及其所引起的心 血管疾病的方法，
[0041] 特異性與PCSK9結(jié)合的方法，
[0042] 阻斷PCSK9與LDLR結(jié)合方法，
[0043] 提高細(xì)胞表面LDLR數(shù)量或者血漿中LDLR水平的方法，
[0044] 降低血漿中LDL或LDL-C水平的方法，
[0045] 降低血漿中TG水平的方法，
[0046] 抑制血漿中LDL積聚的方法，
[0047] 抑制PCSK9所介導(dǎo)的LDLR降解的方法，或者
[0048] 提高LDL所攜帶膽固醇的代謝水平和/或提高TG的代謝水平的方法。
[0049] 本發(fā)明中部分術(shù)語的解釋：
[0050] 多核苷酸
[0051] 本發(fā)明還涉及含有編碼本發(fā)明所述單抗的重鏈可變區(qū)和/或輕鏈可變區(qū)的核酸 序列的分離多核苷酸。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，該核酸序列包含編碼SEQIDN0:18或20 所示的氨基酸序列。在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，該多核苷酸包含SEQIDNO:17或19的核 苷酸序列。本發(fā)明的核酸序列包括基因組序列，以及相應(yīng)的cDNA和RNA序列。此處所用術(shù) 語"核酸序列"應(yīng)理解為包括合成DNA在內(nèi)的所有這類變種。
[0052] 核酸構(gòu)建體
[0053] 本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明所述核酸序列及與之可操作連接的一個或多個調(diào)控序 列的核酸構(gòu)建體，所述調(diào)控序列在其相容條件下能指導(dǎo)編碼序列在合適的宿主細(xì)胞中進(jìn)行 表達(dá)。表達(dá)應(yīng)理解為包括多肽（單抗）生產(chǎn)中所涉及的任何步驟，包括，但不限于轉(zhuǎn)錄、