專利名稱：重組蛇毒金屬蛋白酶Jerdonitin的高效穩(wěn)定表達(dá)和純化及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)、生物技術(shù)、醫(yī)藥領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
-
蛇毒中含有多種具有活性的蛋白質(zhì)，在抗血、止血、鎮(zhèn)痛和抗腫瘤等多方面具有良好的應(yīng)用前景。蛇毒去整合素含有Arg-Gly-Asp (RGD)序列，半胱氨酸含量豐富。因?yàn)榇蟛糠旨?xì)胞整合素(integrins)都能識(shí)別RGD序列，而大多數(shù)細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)蛋白成分都含有RGD序列，故去整合素可憑借其RGD識(shí)別序列而成為細(xì)胞外基質(zhì)與細(xì)胞整合素間結(jié)合的強(qiáng)有力的競(jìng)爭(zhēng)性拮抗劑，從而抑制整合素參與的多種生理活動(dòng)。因RGD模體能被血小板纖維蛋白原受體odlbp3識(shí)別，其還具有抑制ADP誘導(dǎo)的血小板聚集的作用。因此，去整合素可運(yùn)用于與細(xì)胞黏附相關(guān)的疾病研究領(lǐng)域，如血管新生、腫瘤轉(zhuǎn)移、血栓癥等。但是蛇毒成分復(fù)雜，從蛇毒中直接分離目的蛋白不但難度高、工藝繁瑣，而且蛇資源日益匱乏，蛇毒來(lái)源受限，若應(yīng)用分子生物學(xué)方法體外表達(dá)蛇毒蛋白，則可大大降低生產(chǎn)成本，提高蛋白質(zhì)產(chǎn)量。
從菜花烙鐵頭蛇毒中分離純化到野生型蛇毒金屬蛋白酶Jerdonitin屬于一種新型的II型蛇毒金屬蛋白酶。Jerdonitin的cDNA由金屬蛋白酶、間隔區(qū)和去整合素區(qū)組成，說(shuō)明它是二型蛇毒金屬蛋白酶。與其它二型相比，Jerdonitin多了兩個(gè)半胱氨酸(Cys219 and Cys238)分別位于間隔區(qū)和去整合素區(qū)。Cys219將和后面去整合素區(qū)自由的半胱氨酸殘基Cys238形成一對(duì)二硫鍵，這對(duì)二硫鍵可能阻止了去整合素區(qū)的釋放。因此，與其它二型蛇毒金屬蛋白酶不同的是，Jerdonitin的成熟蛋白經(jīng)過(guò)后翻譯加工過(guò)程仍由金屬蛋白酶、間隔區(qū)和去整合素區(qū)組成。野生型Jerdonitin已經(jīng)被檢測(cè)到顯著抑制血小板聚集的活性(IC50為 120 nM)，證明了蛇毒金屬蛋白酶Jerdonitin含有去整合素結(jié)構(gòu)域這一結(jié)構(gòu)特 占。
"、、o
本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘惶淄晟频纳叨窘饘俚鞍酌窲erdonitin在巴斯德畢氏酵母中 高效穩(wěn)定表達(dá)和純化的技術(shù)方法，并發(fā)現(xiàn)本重組蛇毒金屬蛋白酶Jerdonitin不 僅具有接近于野生型蛇毒金屬蛋白酶Jerdonitin的抑制血小板聚集的活性，而 且首次驗(yàn)證了其能夠抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。該重組蛇毒金屬蛋白酶Jerdonitin 的獲得方法具有直接表達(dá)、成本低，穩(wěn)定性高，表達(dá)量高、分離純化工藝簡(jiǎn)便、 活性高等特點(diǎn)。該重組蛇毒金屬蛋白酶Jerdonitin不僅可以滿足市場(chǎng)需要，又 能保護(hù)蛇資源。該重組蛇毒金屬蛋白酶Jerdonitin可考慮作為新型抗血栓和抗 腫瘤藥物，為臨床治療提供新的思維和手段。

發(fā)明內(nèi)容
本項(xiàng)發(fā)明的內(nèi)容之一是重組蛇毒金屬蛋白酶Jerdonitin的高效穩(wěn)定表達(dá)。以 全長(zhǎng)Jerdonitin基因?yàn)槟０?，設(shè)計(jì)正向引物和反向引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增目的基 因-，將此目的基因與克隆載體經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切；然后連接目的基因和克隆 載體，獲得含目的基因Jerdonitin的重組質(zhì)粒；重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌進(jìn)行 擴(kuò)增；大量抽提重組質(zhì)粒；重組質(zhì)粒經(jīng)過(guò)酶切線性化后，將此重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入 到酵母表達(dá)菌株中，建立能穩(wěn)定表達(dá)Jerdonitin的工程菌株；在甲醇誘導(dǎo)下 表達(dá)Jerdonitin目的蛋白。
本項(xiàng)發(fā)明的內(nèi)容之二是重組蛇毒金屬蛋白酶Jerdonitin的純化技術(shù)方法。 根據(jù)表達(dá)的蛋白的性質(zhì)，選擇用DEAE陰離子瓊脂糖柱階段性洗脫初步捕獲蛋 白，再用中壓液相色譜凝膠層析柱superdex75 HR10/30和陰離子交換柱Mono QHR5/5純化，純化蛋白在SDS-PAGE電泳中呈現(xiàn)為一條帶。本項(xiàng)發(fā)明的內(nèi)容之三是重組蛇毒金屬蛋白酶Jerdonitin在制備抗血栓藥 物的應(yīng)用。該重組蛇毒金屬蛋白酶Jerdonitin具有抑制血小板聚集的活性。該 活性接近于野生型蛇毒金屬蛋白酶Jerdonitin的抑制血小板聚集的活性。因此 該重組蛇毒金屬蛋白酶Jerdonitin可考慮作為新型抗血栓藥物。
本項(xiàng)發(fā)明的內(nèi)容之四是重組蛇毒金屬蛋白酶Jerdonitin在制備抗腫瘤藥 物的應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)首次驗(yàn)證了該重組蛇毒金屬蛋白酶Jerdonitin能夠顯著性地抑 制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。因此該重組蛇毒金屬蛋白酶Jerdonitin可考慮作為新型抗 腫瘤藥物，為臨床治療提供了新的思維和手段。


圖l 時(shí)間梯度甲醇誘導(dǎo)表達(dá)重組蛇毒金屬蛋白酶Jerdonitin的 SDS-PAGE電泳圖和純化后SDS-PAGE電泳圖，其中M為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；
0、 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7為每天取20 ul表達(dá)培養(yǎng)液離心后的上清液；P為純化 后的重組蛇毒金屬蛋白酶Jerdonitin。
圖2重組蛇毒金屬蛋白酶Jerdonitin對(duì)血小板聚集的劑量抑制性作用。 圖3重組蛇毒金屬蛋白酶Jerdonitin對(duì)腫瘤細(xì)胞(Be17402人源肝癌細(xì)胞、 BGC823人源胃癌細(xì)胞、K562人源白血病細(xì)胞)增殖的抑制作用。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例一 重組蛇毒金屬蛋白酶Jerdonitin的表達(dá)
1、 從菜花烙鐵頭蛇的毒腺中，利用RT-PCR體外擴(kuò)增出Jerdonitin的全長(zhǎng) cDNA基因。以Jerdonitin全長(zhǎng)基因?yàn)槟０?，申?qǐng)人設(shè)計(jì)并由引物合成公司合 成如下PCR引物
正向引物，5 ，-CGGAATTCGAGCTCTATAATCTTGGAATCTG-3 ， 反向引物，5 ，-GCTCTAGATAGGCATGGAAGGGATTTC畫3 ，2、 PCR擴(kuò)增，PCR條件為94°C， 2分鐘；94°C， 45秒，60°C， 2分鐘，25個(gè) 循環(huán)后，72°C， IO分鐘。PCR產(chǎn)物經(jīng)0.8。/。瓊脂糖電泳，回收約1500bp片段。 瓊脂糖回收的具體步驟如下50^1 PCR反應(yīng)物與6^1加樣緩沖液、6^1染色液混 合，室溫放置l分鐘，用電壓72V，電泳約45分鐘，將與理論長(zhǎng)度相同的條帶， 切割，放入無(wú)菌管中，加75(HUQG緩沖液，50'C熔膠，溶液倒入Qiaquickspin柱， 16000g離心30秒，棄上清，再離心一次，加30pl無(wú)菌水于柱中心，靜置l分 鐘，16000g離心l分鐘，收集清液，-20。C保存。
3、 PCR回收產(chǎn)物，用限制性內(nèi)切酶EcoRIandXbaI酶切，乙醇沉淀回收；同 樣酶切畢赤酵母表達(dá)載體pPICZaC，用T4 DNA連接酶16"C過(guò)夜連接目的基因 和載體；65"C滅活5分鐘；取1.5^1連接物與預(yù)冷的感受態(tài)細(xì)胞TOP10F混合， 加入1毫升LB溶液，37。C溫育1小時(shí)，取200jxl涂LB平板(25 ug/ml Zeocin)， 37'C培養(yǎng)14小時(shí)；挑選菌落，以250rpm轉(zhuǎn)速于37'C搖床中培養(yǎng)12小時(shí)；小 量抽提重組質(zhì)粒；酶切鑒定；酶切鑒定正確的克隆由DNA測(cè)序公司測(cè)序。
4、 重組質(zhì)粒經(jīng)SacI酶切線性化后，電轉(zhuǎn)化入酵母菌株，涂100pg/ml Zeocin YPDS平板，進(jìn)行穩(wěn)定轉(zhuǎn)染菌株的篩選，并進(jìn)行PCR鑒定。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染、正確重 組子用甲醇誘導(dǎo)發(fā)酵表達(dá)，發(fā)酵7天的培養(yǎng)液，離心取上清，15% SDS-PAGE 電泳檢驗(yàn)分子量。電泳檢測(cè)到一條分子量大約為33 KD的條帶,符合成熟態(tài) Jerdonitin由882個(gè)核苷酸翻譯294個(gè)氨基酸的分子量的大小。甲醇誘導(dǎo)3天后 即達(dá)到最高表達(dá)平衡點(diǎn)(圖1)。
實(shí)施例二重組蛇毒金屬蛋白酶Jerdonitin的純化
1、 高表達(dá)量重組蛇毒金屬蛋白酶Jerdonitin的菌株擴(kuò)大培養(yǎng)，甲醇誘導(dǎo)3天， 上清稀釋4倍體積過(guò)50 mM pH 8.0 Tris-HCl (pH 8.0)緩沖溶液平衡的陰離子快速 交換柱DEAE， 50mMpH8.0Tris-HCl(pH8.0)緩沖溶液(含0.08M氯化鈉)洗脫，收集峰處蛋白；
2、 DEAE柱純化的蛋白用高壓液相色譜凝膠層析柱superdex75 HR10/30進(jìn) 一步分離，使用50mMpH8.0Tris-HCl(pH8.0)緩沖溶液(含0.15M氯化鈉) 洗脫；
3、 凝膠層析柱純化過(guò)的蛋白溶液透析后用陰離子交換柱Mono Q HR 5/5 梯度洗脫純化，收集峰蛋白，15%SDS-PAGE電泳檢驗(yàn)，純度達(dá)99%以上(圖 1)。
實(shí)施例三重組蛇毒金屬蛋白酶Jerdonitin對(duì)血小板聚集的劑量抑制性作用
1、 采集人空腹全血加入裝有3.28%枸椽酸鈉的塑料離心管中，血液與枸椽鈉的 比例為9:1;
2、 1000rpm室溫離心5min,取米黃色上清即為人富血小板血漿(PRP);
3、 將余液繼續(xù)以4000 g室溫離心10 min，取上清即為人貧血小板血(platelet-poor plasma, PPP);
4、 取2只比色杯，分別加入PPP和PRP各300^1，置于聚集儀中37。C熱5min, 用PPP校零，測(cè)定PRP中的血小板數(shù)。然后用PPP稀釋PRP調(diào)整血小板數(shù)
至3 x103 4d;
5、 將PPP、用PPP調(diào)整后的加入30ul的PBS或不同濃度重組蛇毒金屬蛋白酶 Jerdonitin的PRP置于LBY-NJ2型血小板聚集儀中37。C溫育3min;
6、 以PPP調(diào)零；
7、 將PRP樣品加入終濃度為3umol/L的ADP啟動(dòng)血小板的凝聚反應(yīng).(圖2)
8、 重組蛇毒金屬蛋白酶Jerdonitin抑制ADP誘導(dǎo)的血小板聚集呈劑量依賴性， 半抑制劑量IC5G約為248 nM.實(shí)施例四MTT法鑒定重組蛇毒金屬蛋白酶Jerdonitin抑制腫瘤細(xì)胞(Bel7402 人源肝癌細(xì)胞、BGC823人源胃癌細(xì)胞、K562人源白血病細(xì)胞)生長(zhǎng)
1、 腫瘤細(xì)胞(Bel7402人源肝癌細(xì)胞、BGC823人源胃癌細(xì)胞、K562人源白血 病細(xì)胞)以4xl0、ell/well濃度接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，于37'C、 5%(302培 養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h;
2、 加入梯度濃度的重組蛇毒金屬蛋白酶Jerdonitin (對(duì)照加入同量的PBS)繼續(xù) 培養(yǎng)72h;
3、 加入15 ul 5 mg/ml的MTT繼續(xù)培養(yǎng)4h;
4、 吸去培養(yǎng)液，加入與培養(yǎng)液等量的DMSO;
5、 振蕩10min，使結(jié)晶充分溶解；
6、 用酶標(biāo)儀上測(cè)定578 nm各孔的光吸收值A(chǔ);
7、 計(jì)算細(xì)胞存活率-試驗(yàn)孔A均值/對(duì)照孔A均值xlOOy。，抑制率=(對(duì)照孔A 均值一試驗(yàn)孔A均值)對(duì)照孔A均值xl00n/。；(圖3)
8、 重組蛇毒金屬蛋白酶Jerdonitin對(duì)K562細(xì)胞、Bel7402細(xì)胞和BGC細(xì)胞 的半數(shù)抑制濃度(IC50)分別為0.816 umol/L 、 0.990 umol/L和0.602 umol/L。
權(quán)利要求
1、重組蛇毒金屬蛋白酶Jerdonitin的高效穩(wěn)定表達(dá)和純化的方法，包括如下步驟1)、重組蛇毒金屬蛋白酶Jerdonitin的高效穩(wěn)定表達(dá)以全長(zhǎng)Jerdonitin基因?yàn)槟０?，設(shè)計(jì)正向引物和反向引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增目的基因；將此目的基因與克隆載體經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切；然后連接目的基因和克隆載體，獲得含目的基因Jerdonitin的重組質(zhì)粒；重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌進(jìn)行擴(kuò)增；大量抽提重組質(zhì)粒；重組質(zhì)粒經(jīng)過(guò)酶切線性化后，將此重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入到酵母表達(dá)菌株中，建立能穩(wěn)定表達(dá)Jerdonitin的工程菌株；在甲醇誘導(dǎo)下表達(dá)Jerdonitin；2)、重組蛇毒金屬蛋白酶Jerdonitin的純化方法根據(jù)表達(dá)的蛋白的性質(zhì)，選擇用陰離子瓊脂糖柱階段性洗脫初步捕獲蛋白，再用凝膠層析柱和陰離子交換柱純化，可獲得純度較高的蛋白。
2、 按權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于所述PCR擴(kuò)增Jerdonitin基因所 用的引物為正向引物，5 '-CGGAATTCGAGCTCTATAATCTTGGAATCTG-3, 反向引物，5 ，誦GCTCTAGATAGGCATGGAAGGGATTTC-3 ， 所述的克隆載體為pPICZaC;所述用于酶切目的基因與克隆載體的限制性內(nèi)切 酶為EcoRI和Xbal;所述的重組質(zhì)粒線性化是用SacI酶切含有Jerdonitin 重組質(zhì)粒；所述的酵母表達(dá)菌株為X-33。
3、按權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于所述的陰離子瓊脂糖柱為DEAE陰 離子瓊脂糖柱；所述的凝膠層析柱為凝膠層析柱superdex75 HR10/30 ;所述 的陰離子交換柱為陰離子交換柱Mono Q HR 5/5 。
4、 重組蛇毒金屬蛋白酶Jerdonitin在制備抗血栓藥物的應(yīng)用。
5、 重組蛇毒金屬蛋白酶Jerdonitin在制備抗腫瘤藥物的應(yīng)用。全文摘要
本發(fā)明提供了重組蛇毒金屬蛋白酶Jerdonitin的高效穩(wěn)定表達(dá)和純化的技術(shù)方法。重組蛇毒金屬蛋白酶Jerdonitin在酵母細(xì)胞中的大量表達(dá)及目的蛋白的純化，純化蛋白在SDS-PAGE電泳中呈現(xiàn)為一條帶。該重組蛇毒金屬蛋白酶Jerdonitin的獲得方法具有直接表達(dá)、成本低，穩(wěn)定性高，表達(dá)量高、分離純化工藝簡(jiǎn)便、活性高等特點(diǎn)。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)本重組蛇毒金屬蛋白酶Jerdonitin不僅具有接近于野生型蛇毒金屬蛋白酶Jerdonitin的抑制血小板聚集的活性，而且首次驗(yàn)證了其能夠抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的活性，從而能夠作為一種新型抗血栓和抗腫瘤新藥。
文檔編號(hào)A61P7/02GK101497887SQ20081007059
公開(kāi)日2009年8月5日 申請(qǐng)日期2008年2月2日 優(yōu)先權(quán)日2008年2月2日
發(fā)明者朱麗麗, 王婉瑜, 黃明東 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院福建物質(zhì)結(jié)構(gòu)研究所