一種甲基轉(zhuǎn)移酶活性實時測定方法及試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種甲基轉(zhuǎn)移酶活性實時測定方法及試劑盒。包括在一個反應(yīng)體系內(nèi)兩個同時進(jìn)行的反應(yīng)：(1)在保證以S?腺苷蛋氨酸為甲基供體的甲基轉(zhuǎn)移酶有生物學(xué)活性的緩沖體系中，加入含有甲基轉(zhuǎn)移酶(MT)的樣品、甲基供體和相應(yīng)的底物或者直接在含有甲基轉(zhuǎn)移酶的液態(tài)樣品中加入S?腺苷蛋氨酸甲基供體和相應(yīng)的底物進(jìn)行反應(yīng)以便產(chǎn)生S?腺苷同型半胱氨酸(SAH)產(chǎn)物，底物為甲基的受體物質(zhì)；(2)利用免疫學(xué)方法檢測SAH的含量，來確定反應(yīng)體系中甲基轉(zhuǎn)移酶的活性。本發(fā)明把MT催化的生化反應(yīng)與測定產(chǎn)物SAH的免疫反應(yīng)同時進(jìn)行，把這兩個過程有機(jī)地結(jié)合起來，對于準(zhǔn)確地測定分子性狀極其不穩(wěn)定的SAH尤其具有重大的意義。
【專利說明】
一種甲基轉(zhuǎn)移酶活性實時測定方法及試劑盒
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及甲基轉(zhuǎn)移酶檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一類以s-腺苷蛋氨酸為甲基供體 的甲基轉(zhuǎn)移酶生物學(xué)活性實時測定方法及檢測試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 甲基轉(zhuǎn)移酶(Methyl transferase，MT)是一類催化甲基化反應(yīng)的酶，一般以S-腺苷 蛋氨酸(S-Adenosyl Methionine,SAM)作為甲基供體。甲基化反應(yīng)廣泛存在于生物體內(nèi)，他 們的作用底物范圍幾乎囊括了細(xì)胞內(nèi)所有生物活性分子，包括核酸、蛋白質(zhì)、多糖、脂類以 及諸多小分子，因此許多重要的生理環(huán)節(jié)如基因表達(dá)的抑制或關(guān)閉、DNA損傷的修復(fù)，以及 微生物、動植物體內(nèi)生理過程中間產(chǎn)物的合成與降解反應(yīng)等都涉及到MT的調(diào)控作用。
[0003] 按照目前的研究甲基轉(zhuǎn)移酶可分為兩類:遺傳物質(zhì)甲基轉(zhuǎn)移酶和非遺傳物質(zhì)甲基 轉(zhuǎn)移酶。遺傳物質(zhì)甲基轉(zhuǎn)移酶催化遺傳物質(zhì)胞嘧啶生理性的甲基化和由誘變物質(zhì)導(dǎo)致的作 為遺傳物質(zhì)附加體的甲基化。催化胞嘧啶甲基化的MT已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有6種，其中DNA甲基轉(zhuǎn)移酶 (DNA Me thy 1 transferase，Dnmt)Dnmtl，Dnmt 2，Dnmt 3 為哺乳動物的DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶。MT1、 MT3則是存在于植物體內(nèi)的同源化甲基轉(zhuǎn)移酶，此外染色質(zhì)甲基轉(zhuǎn)移酶(Chromomethylase, CMT)是植物所特有的一種MT。催化非遺傳物質(zhì)的甲基轉(zhuǎn)移酶種類非常多，從參與染色體的 形成到激素的合成都與其有一定的關(guān)聯(lián)，其作用的底物非常廣泛，包括激素類、蛋白質(zhì)殘 基、黃酮、葉綠素、無機(jī)砷、磷酸甘油酯類等，表1中列舉了目前研究較多的催化非遺傳物質(zhì) 的甲基轉(zhuǎn)移酶。
[0004] 表 1
[0006] MT在體內(nèi)催化SAM和底物，將甲基轉(zhuǎn)移至底物并生成SAH(S-腺苷同型半胱氨酸)和 甲基化物。以同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(Homocysteine Methyl transferase，HMT)為例，酶 促反應(yīng)如下：
[0008] SAM是生物體內(nèi)最常見的中間代謝產(chǎn)物。在蛋氨酸循環(huán)中，首先必須活化Met，形成 SAM，SAM把甲基提供給生命過程中重要物質(zhì)如DNA，RNA，脂蛋白，激素，神經(jīng)遞質(zhì)等后變成S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)，SAH脫去腺苷后生成同型半胱氨酸(Hey)，最后通過四氫葉酸提供 的甲基，又變成Met。在肝臟中，蛋氨酸循環(huán)有個額外的功能，主要是在高蛋氨酸或高蛋白飲 食后，用以迅速清除血液中過高的蛋氨酸，最后通過同型半胱氨酸、半胱氨酸、胱硫醚、谷胱 甘肽被轉(zhuǎn)運到其它器官。
[0009] SAM是自然界中僅有的幾個功能極其多樣而重要的含硫的生物活性物質(zhì)，是蛋氨 酸循環(huán)中的關(guān)鍵物質(zhì)，是人類至關(guān)重要的甲基化修飾過程中甲基的唯一供體。在轉(zhuǎn)甲基、轉(zhuǎn) 硫、轉(zhuǎn)氨丙基反應(yīng)中有重要的地位。對于甲基化相關(guān)的細(xì)胞功能、多胺合成、調(diào)節(jié)蛋氨酸與 同型半胱氨酸的比例等有直接的影響。在各種生命重要的代謝反應(yīng)和細(xì)胞的增殖分化等有 重要意義。研究表明，肝臟中維持一定濃度的SAM對于肝功能的發(fā)揮起著至關(guān)重要的作用。 大約85%的甲基化反應(yīng)和約50%的蛋氨酸代謝是在肝臟中進(jìn)行的，不僅提示肝臟在調(diào)節(jié)血 液蛋氨酸水平有重要的作用，而且提示SAM在調(diào)控肝細(xì)胞再生，分化以及對各種因素(酒精， 化學(xué)物質(zhì)，輻射，病原微生物，病毒，寄生蟲等)造成的肝細(xì)胞損傷的敏感性的重大意義。在 甘氨酸N-甲基轉(zhuǎn)移酶(G匪T)缺失的小鼠中，SAM水平上升，這兩種情況下，小鼠出現(xiàn)肝癌的 幾率明顯增加。
[0010] 編碼依賴于SAM的甲基轉(zhuǎn)移酶的基因占人類基因組的基因總數(shù)的1 %。很多研究表 明MT與其甲基底物在人體生命活動的不同階段，如胚胎發(fā)生、發(fā)育、成長、分化、健康、疾病 中起著至關(guān)重要的作用，就是因為SAM在蛋氨酸循環(huán)和一碳代謝中有非常重要的特殊作用， 與人體新陳代謝狀況直接相關(guān)。體內(nèi)的SAM含量會因為年齡、性別、種族、體重、飲食、用藥情 況、健康和疾病狀況而有所波動。鑒于這一特性，我們應(yīng)該從SAM的合成和分解代謝兩個方 面來考察原因。因此，了解MT在不同情況下生物活性的高低對于我們研究許多至關(guān)重要的 代謝與健康問題有很大的實際意義。
[0011] 目前有三種辦法測定MT的活性:方法一：同位素示蹤微量分析法。用同位素標(biāo)記的 SAM作為甲基供體，以目標(biāo)酶的另一底物作為甲基受體，在固定條件下，測定單位時間內(nèi)轉(zhuǎn) 移到另一底物上的同位素液閃每分計數(shù)值表示MT的相對活性;方法二：高壓液相(HPLC)或 質(zhì)譜(LC-MS/MS)方法測定MT催化合成SAH或甲基化產(chǎn)物的量;方法三：多酶循環(huán)法。ffl 1酶與 SAM及其對應(yīng)的甲基受體物質(zhì)反應(yīng)生成的SAH經(jīng)SAH水解酶等進(jìn)一步催化最終合成光化學(xué)方 法可檢測的NAD+。
[0012] 其中，同位素示蹤法雖然具有靈敏度高、定位定量準(zhǔn)確等優(yōu)點，但也存在一些缺 陷，該方法需要繁瑣的底物與產(chǎn)物后續(xù)色譜分離，費時費力，而且重復(fù)性差，大部分情況下 只能做到半定量分析，從事放射性同位素的工作人員必須經(jīng)過專門訓(xùn)練，同時還需要具備 一定的安全防護(hù)措施。作為示蹤元素的放射性同位素與相應(yīng)的普通元素之間存在化學(xué)性質(zhì) 的微小差異從而引起個別性質(zhì)上的明顯區(qū)別，尤其是對于輕元素而言，這種所謂的同位素 效應(yīng)比較嚴(yán)重。此外，該方法還有可能造成放射性污染。
[0013] 高壓液相(HPLC)方法測定SAH或甲基化產(chǎn)物的方法也存在一定的局限性。其實無 論是HPLC或LC-MS/MS哪種方法測定SAH或甲基化產(chǎn)物含量，對于評估MT活性都是很不準(zhǔn)確 的。HPLC和LC-MS/MS的樣品，需要特殊處理，經(jīng)過較長時間、較多步驟后SAH或甲基化產(chǎn)物必 然有丟失，此外合成反應(yīng)的產(chǎn)物有可能不穩(wěn)定，甚至在短時間內(nèi)降解，若不及時檢測將造成 檢測值偏差。所有這些因素都會造成所測的值很不準(zhǔn)確，更不用說試圖達(dá)到反映酶動力學(xué) 反應(yīng)的目的。
[0014] 至于多酶循環(huán)法，常涉及到兩種甚至兩種以上的酶反應(yīng)，過程復(fù)雜，影響因素甚 多，且檢測方法需要使用生化儀這類大型的昂貴儀器。因此，研發(fā)出一種能準(zhǔn)確、快速、直接 測定以SAM為甲基供體的甲基轉(zhuǎn)移酶生物學(xué)活性的檢測方法是非常必要的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0015] 本發(fā)明的目的在于提供一種能準(zhǔn)確、快速、實時、直接測定以S-腺苷蛋氨酸為甲基 供體的甲基轉(zhuǎn)移酶生物學(xué)活性的方法以及與該方法配套的試劑盒。本發(fā)明基于同時法直接 測定其合成的S-腺苷同型半胱氨酸產(chǎn)物含量。只要待檢測的MT能以S-腺苷蛋氨酸為甲基供 體，MT將SAM的甲基轉(zhuǎn)移至與其相應(yīng)的另一底物，SAM轉(zhuǎn)化為SAH，無論體內(nèi)還是體外方法測 定M頂每活性，本發(fā)明都可以最直接地第一時間快速地測定SAH的含量，以推算MT活性的高 低。
[0016] 本發(fā)明的創(chuàng)新之處在于讓MT催化的生化反應(yīng)與測定SAH的免疫反應(yīng)同時進(jìn)行，把 這兩個過程有機(jī)地結(jié)合起來，抗S-腺苷同型半胱氨酸特異性抗體快速、簡便地測定以S-腺 苷蛋氨酸為甲基供體的一類甲基轉(zhuǎn)移酶生物學(xué)活性，并通過大量試驗探索出一套讓這兩個 反應(yīng)同時進(jìn)行并獲得最佳檢測效果的最佳反應(yīng)體系和條件。對于準(zhǔn)確地測定分子性狀極其 不穩(wěn)定的SAH尤其具有重大的意義。
[0017] 本發(fā)明甲基轉(zhuǎn)移酶活性實時測定方法，包括在一個反應(yīng)體系內(nèi)兩個同時進(jìn)行的反 應(yīng)：（1)在保證以S-腺苷蛋氨酸為甲基供體的甲基轉(zhuǎn)移酶有生物學(xué)活性的緩沖體系中，加入 含有甲基轉(zhuǎn)移酶的樣品、甲基供體和底物或者直接在含有甲基轉(zhuǎn)移酶的液態(tài)樣品中加入s-腺苷蛋氨酸甲基供體和底物，進(jìn)行反應(yīng)以便產(chǎn)生S-腺苷同型半胱氨酸產(chǎn)物，底物為甲基的 受體物質(zhì)；（2)利用免疫學(xué)方法檢測S-腺苷同型半胱氨酸的含量，來確定反應(yīng)體系中甲基轉(zhuǎn) 移酶的活性。
[0018] 所述的甲基轉(zhuǎn)移酶活性實時測定方法，利用包被抗原法和包被抗體法兩種方式的 競爭法測量S-腺苷同型半胱氨酸的含量；
[0019] 1)包被抗原法:預(yù)先將偶聯(lián)的SAH抗原包被在固相ELISA板中，同時加入待檢抗原 和示蹤物標(biāo)記的抗SAH抗體，待檢抗原即反應(yīng)產(chǎn)生的SAH產(chǎn)物，待檢抗原與包被抗原共同競 爭示蹤物標(biāo)記的抗SAH抗體，反應(yīng)后洗板，與包被抗原結(jié)合的示蹤物標(biāo)記的抗SAH抗體保留， 與待檢抗原結(jié)合的示蹤物標(biāo)記的抗體則被洗掉，最后加入底物顯色，最終顯色結(jié)果與待檢 抗原量成反比，在測定過程中，用配制的一系列梯度已知量的SAH作為標(biāo)準(zhǔn)品，制作標(biāo)準(zhǔn)曲 線；
[0020] 2)包被抗體法:先將羊或兔抗鼠IgG包被的微孔板中加入抗SAH抗體孵育，或者直 接包被抗SAH抗體，洗板;加入示蹤物標(biāo)記的SAH抗原，再加入待檢抗原，待檢抗原即反應(yīng)產(chǎn) 生的SAH產(chǎn)物，待檢抗原與示蹤物標(biāo)記的SAH競爭包被在酶聯(lián)板上的抗SAH特異性抗體，孵育 洗板;加入底物顯色，在測定過程中，用配制的一系列梯度已知量的SAH作為標(biāo)準(zhǔn)品，制作標(biāo) 準(zhǔn)曲線。
[0021] 所述的甲基轉(zhuǎn)移酶活性實時測定方法，采用SAH抗原的類似物替代SAH抗原進(jìn)行偶 聯(lián)或者示蹤物標(biāo)記。
[0022] 所述的甲基轉(zhuǎn)移酶活性實時測定方法，示蹤物包括酶，熒光素，膠體金，化學(xué)發(fā)光 物質(zhì)，生物素，地高辛，放射性標(biāo)記物質(zhì)和各種類型的乳膠微球。
[0023] 所述的甲基轉(zhuǎn)移酶活性實時測定方法，S-腺苷同型半胱氨酸酸抗原是多聚賴氨 酸，牛血清白蛋白或者其它載體蛋白偶聯(lián)。
[0024] 所述的甲基轉(zhuǎn)移酶活性實時測定方法，采用包被抗原法的具體步驟如下：
[0025] (1)不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品的配制:取S-腺苷同型半胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)品，用緩沖液配制成不同 濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品；
[0026] (2)在包被有蛋白-SAH偶聯(lián)物或多聚體-SAH偶聯(lián)物的微孔板中，加入辣根過氧化 物酶或堿性磷酸酶標(biāo)記的抗S-腺苷同型半胱氨酸單克隆抗體，含有S-腺苷蛋氨酸、待測甲 基轉(zhuǎn)移酶的樣品及與待測甲基轉(zhuǎn)移酶相應(yīng)的甲基受體物質(zhì)的緩沖液體系；如果是液態(tài)樣 品，則直接加入S-腺苷蛋氨酸、待測甲基轉(zhuǎn)移酶的樣品及與待測甲基轉(zhuǎn)移酶相應(yīng)的甲基受 體物質(zhì);標(biāo)準(zhǔn)曲線孔中加入配制好的不同濃度梯度的SAH標(biāo)準(zhǔn)品;混勻后反應(yīng)，洗板；
[0027] (3)加入辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶的底物，顯色，加入終止液終止反應(yīng)，在酶 標(biāo)儀上選擇適當(dāng)波長讀取每孔的吸光度讀數(shù)0D450;
[0028] (4)在同一酶聯(lián)板中用配制的一系列已知量的SAH標(biāo)準(zhǔn)品，據(jù)其0D450與已知標(biāo)準(zhǔn) 品濃度獲得曲線方程，再將樣本0D450代入方程求得其對應(yīng)的反應(yīng)產(chǎn)物SAH的生成量；
[0029] (5)根據(jù)含有甲基轉(zhuǎn)移酶的樣品在單位時間內(nèi)催化生成產(chǎn)物SAH的濃度來計算甲 基轉(zhuǎn)移酶的活性。
[0030] 所述的甲基轉(zhuǎn)移酶活性實時測定方法，
[0031] 緩沖液是包括鉀離子濃度范圍在25-200mM，BSA添加濃度在0.1%-0.9%，pH范圍 為7.0-8.5的Tris或TO緩沖系統(tǒng);優(yōu)選是包括鉀離子濃度為100mM，BSA添加濃度0.1 %，pH為 7.8的PB緩沖系統(tǒng)。
[0032]所述的甲基轉(zhuǎn)移酶活性實時測定方法，
[0033]緩沖液配制的用于制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品濃度分別為0、0.3125、 0?625、1?25、2?5、5、lOuM。
[0034]所述的甲基轉(zhuǎn)移酶活性實時測定方法，
[0035]液態(tài)樣品或者緩沖液中甲基供體加入后的濃度范圍為10-30yM，底物加入后的濃 度范圍為10-60yM，示蹤物標(biāo)記的抗體稀釋度1:3000-1:10000，包被的抗原濃度為0.2-lyg/ ml;優(yōu)選液態(tài)樣品或者緩沖液中甲基供體加入后的濃度20yM，底物加入后的濃度20yM，示蹤 物標(biāo)記的抗體加入的稀釋度1:10000，包被的抗原濃度為lug/ml;
[0036]加入每個微孔的緩沖液體系或者液態(tài)樣品的體積為50yl，稀釋后的示蹤物標(biāo)記的 抗體的體積為5〇yl。
[0037] 所述的甲基轉(zhuǎn)移酶活性實時測定方法，在測定HMT時，反應(yīng)時間和溫度分別為37 °C 和20分鐘。
[0038] 所述的甲基轉(zhuǎn)移酶活性實時測定方法，采用包被抗原法:預(yù)先將BSA偶聯(lián)SAH抗原 包被在固相ELISA板中，包被濃度為lug/ml用BSA封閉后，同時加入待檢抗原(含SAH樣本)和 HRP酶標(biāo)抗SAH抗體。待檢抗原與包被抗原共同競爭酶標(biāo)抗體，反應(yīng)后洗板，與包被抗原結(jié)合 的酶標(biāo)抗體保留，與待檢抗原(游離抗原)結(jié)合的酶標(biāo)抗體則被洗掉。最后加入底物顯色，最 終顯色結(jié)果與待檢抗原量成反比，即0D450值越高，待測樣品中SAH含量越低。在實驗過程 中，同一ELISA板中用配制的一系列梯度已知量的SAH作為標(biāo)準(zhǔn)品，作為標(biāo)準(zhǔn)曲線。據(jù)其 0D450讀數(shù)與已知標(biāo)準(zhǔn)品濃度獲得曲線方程，再將樣本0D450代入方程求得其對應(yīng)濃度值。
[0039] 所述的甲基轉(zhuǎn)移酶活性實時測定方法，含有甲基轉(zhuǎn)移酶的樣品來源于基因工程表 達(dá)的產(chǎn)物、生物組織細(xì)胞內(nèi)被純化出的樣品、組織細(xì)胞內(nèi)的甲基轉(zhuǎn)移酶，生物體液或組織細(xì) 胞培養(yǎng)液，生物體液為血液，血漿，血清，唾液，尿液，腦脊液，腹腔或胸腔滲出液，組織液。
[0040] 本發(fā)明另一目的是提供了與上述方法配套的試劑盒，包括:包被有抗S-腺苷同型 半胱氨酸抗體或S-腺苷同型半胱氨酸抗原的微孔板;示蹤物標(biāo)記的抗S-腺苷同型半胱氨酸 抗體或示蹤物標(biāo)記的S-腺苷同型半胱氨酸抗原；S-腺苷同型半胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)品；保證以S-腺 苷蛋氨酸為甲基供體的甲基轉(zhuǎn)移酶有生物學(xué)活性的緩沖液、S-腺苷蛋氨酸、待測甲基轉(zhuǎn)移 酶相應(yīng)的甲基受體物質(zhì)；陽性質(zhì)控品甲基轉(zhuǎn)移酶;示蹤物檢測系統(tǒng)。
[0041] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果在于：
[0042] 1、可以直接測定產(chǎn)物SAH的含量從而直接反映了 MT的合成SAH的能力；
[0043] 2、本發(fā)明中SAH生成和測定在同一個體系內(nèi)同時完成，不存在滯后，結(jié)果準(zhǔn)確及 時；
[0044] 3、用免疫學(xué)方法測定SAH，不僅特異而且非常敏感，不受SAH存在形式上即結(jié)合型 和游離型的影響；
[0045] 4、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明不需要特殊儀器，僅利用常規(guī)實驗室中的酶標(biāo)儀即可 進(jìn)行檢測；
[0046] 因此，采用本發(fā)明的試劑盒使得MT活性測定更加準(zhǔn)確、可靠、直接、簡易而快速，可 同時獲得樣品中MT活性和SAH含量。
[0047] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的關(guān)鍵點在于：
[0048] 1 .同時法，即把m酶促化學(xué)反應(yīng)和生成的關(guān)鍵產(chǎn)物的定量過程放在一起同時進(jìn) 行，這對于MT活性很低的樣品尤其有必要，然后再引入免疫學(xué)反應(yīng)進(jìn)行的定量產(chǎn)物的檢測。 而在免疫反應(yīng)的過程中，MT催化的化學(xué)反應(yīng)仍然在進(jìn)行，即不斷有新的產(chǎn)物SAH生成。本發(fā) 明的關(guān)鍵點，即把催化反應(yīng)和免疫反應(yīng)有機(jī)結(jié)合為一體從而達(dá)到到最佳檢測靈敏度。
[0049] 2.最精確地、沒有任何延誤地反映MT活性的動態(tài)變化，由于產(chǎn)物SAH不穩(wěn)定，如果 不能在第一時間對其測定，也不能夠有效地、可靠而正確地算出ffl 1酶活性。利用該方法能夠 以最短的時間，同時測出樣品中MT活性和SAH含量。
[0050] 3.只需提供與待測MT相應(yīng)的作用底物，便可以利用該方法測出樣品中MT的活性。
[0051] 4.免疫學(xué)方法和生物化學(xué)反應(yīng)的有機(jī)結(jié)合，使得生物化學(xué)反應(yīng)中的物質(zhì)能夠被有 效、快速、特異、敏感地測出。
[0052] 5.使得該同時法能夠敏感地反映MT活性變化的反應(yīng)液配方，既保證酶學(xué)催化的生 物化學(xué)反應(yīng)能夠正常進(jìn)行，又使得免疫檢測步驟得以有效地實施。
[0053] 本發(fā)明以HMT為主要實驗酶，還從以下幾點進(jìn)行了深入研究和探討：
[0054]第一:確定抗SAH抗體與S-腺苷蛋氨酸及另一底物有無交叉，以避免交叉反應(yīng)對競 爭ELISA的干擾，若存在交叉反應(yīng)，則需要設(shè)置好對照去除交叉反應(yīng)帶來的背景。
[0055]第二:摸索不同pH條件反應(yīng)緩沖液及鉀離子、BSA等對甲基轉(zhuǎn)移酶催化生成SAH的 影響。
[0056]第三:摸索MT濃度及底物的最佳濃度。
[0057]第四：確MT合適反應(yīng)時間，并設(shè)置合適時段測SAH反應(yīng)生成量。
[0058]第五:做實驗反復(fù)優(yōu)化每個組分的最佳濃度，反應(yīng)時間，緩沖液配方和pH值，標(biāo)準(zhǔn) 曲線和標(biāo)準(zhǔn)品范圍等。
[0059]因此，本發(fā)明通過一系列條件摸索，找到一套適合于MT催化的生化反應(yīng)與測定SAH 的免疫反應(yīng)同時進(jìn)行，并獲得最佳檢測效果的最佳反應(yīng)體系和條件。
[0060] 上述技術(shù)路線已經(jīng)在以下實例中得到充分詳細(xì)的證實。從中不難看出，本發(fā)明涉 及到的方法的優(yōu)越性包括但不限于以下：（1)直接測定MT的重要產(chǎn)物SAH而不是次級產(chǎn)物因 而是最直接的反映MT的SAH合成能力；（2)SAH生成和測定在同一個體系內(nèi)一步同時完成，能 夠很好地捕捉到不同情況下MT活性的變化，更好地控制酶反應(yīng)時間，因而結(jié)果會非常準(zhǔn)確 而及時；（3)用特異性，靈敏度，親和力都很高的抗SAH抗體及時定量SAH產(chǎn)物，不僅特異，而 且非常敏感，不受SAH存在形式(結(jié)合型和游離型）的影響；（4)方便，快捷，因此非常有利于 研究各種因素對樣品中MT活性的影響，即使影響很微妙，也能夠測定出來。
[0061] 本發(fā)明的重大意義在于，提供了新的MT測定方法和產(chǎn)品，使得研究人員能夠隨時 方便而準(zhǔn)確地測定m酶活性，有助于與各種m酶相關(guān)的研究和開發(fā)工作的深入了解，對于 回答蛋氨酸代謝，體內(nèi)甲基化狀況（甲基化過程），為各種情況下的甲基化機(jī)制的探討，表觀 遺傳學(xué)的深入研究，代謝性疾病，腫瘤的發(fā)生，發(fā)展，預(yù)后，營養(yǎng)，疾病和健康的研究和監(jiān)測 有重大的意義。
【附圖說明】
[0062]為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，以下對實施例或現(xiàn)有 技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單介紹。
[0063]圖1:直接競爭性ELISA步驟與組成部分示意圖。圖中顯示包被到板上結(jié)合的是抗 原而非抗體的例子。
[0064] 圖2: SAH標(biāo)準(zhǔn)曲線示意圖。其中橫軸為以10為底，SAH標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對數(shù)值，縱軸為 0D450/0D450議^與1-0D450/0D450零靜的比值的自然對數(shù)值，或稱為LOGIT。
【具體實施方式】
[0065] 下面結(jié)合實驗結(jié)果及數(shù)據(jù)進(jìn)一步對本發(fā)明作詳細(xì)說明。未提到的原料為常規(guī)商品 化試劑，可以從市場上購得。
[0066]實施例1抗SAH抗體與同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶底物SAM和Hey交叉反應(yīng)
[0067] 實驗材料
[0068] HRP酶標(biāo)抗SAH抗體：Arthus Biosystems，MAH00301;牛血清白蛋白BSA-SAH: Arthus Biosystems，ACT00301; S-腺苷同型半脫氨酸（SAH)標(biāo)準(zhǔn)品：Arthus Biosystems， AST00301；
[0069] S-腺苷蛋氨酸：Sigma，A2408，；同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(HMT):北京愛必信生物 技術(shù)有限公司 Abt-P-〇05;BSA，Tris-Cl，NaCl，NaH2P〇4，Na2HP〇4，Na2HP〇4.12H2〇:北京華美加 成生物技術(shù)有限公司；KC1:天津大茂化學(xué)試劑廠；同型半胱氨酸（Hey)，ProCl in 300: Sigma;TMB顯色液：湖州英創(chuàng)生物技術(shù)有限公司；硫酸：湖南康都制藥有限公司；96孔酶聯(lián) 板:美國Corn i ng高吸附酶聯(lián)板條。
[0070] 試劑配制：
[0071 ]根據(jù)初始的實驗，實驗體系所使用的BSA-SAH包被濃度為0.2ug/ml，SAH的檢測范 圍為0-luM，而酶反應(yīng)所生成的SAH超出了該檢測范圍，故對SAH抗原的包被濃度進(jìn)行重新調(diào) 整后，將SAH的檢測范圍擴(kuò)大為0-10uM，BSA-SAH的包被濃度為lug/ml，方便后期的各種條件 的考察。
[0072]酶反應(yīng)緩沖液：100mM PB，100mM KC1，BSA 0.1%調(diào)pH7.80，pH8.0，pH8.5;SAH標(biāo)準(zhǔn) 品（SAHNa): 10uM、5uM、2 ? 5uM、1 ? 25uM、0 ? 625uM、0 ? 3125uM、4uM、0uM，緩沖液為pH 7 ? 80酶反 應(yīng)緩沖液;SAH質(zhì)控品（SAHNa): 4uM，緩沖液為pH7.80酶反應(yīng)緩沖液。
[0073]取包被 BSA-SAH 抗原 ELSIA 板條，SAH 標(biāo)準(zhǔn)曲線用 0、0.3125、0.625、1.25、2.5、5、 10uM標(biāo)準(zhǔn)品，SAM和Hey交叉物濃度0、10、50、100、50CMLHRP-抗SAH酶標(biāo)抗體1:10000用HRP 稀釋液稀釋。標(biāo)準(zhǔn)品和交叉類似物Hey和SAM每孔50ul，HRP-抗SAM抗體稀釋后每孔加50ul。 37°C反應(yīng)lh，洗板后100ul TMB37°C顯色15min，終止液加50ul后讀數(shù)。結(jié)果如下：
[0074] 表2抗SAH單克隆抗體與SAM和Hey的反應(yīng)率(A/A0)
[0076] A/A0;反應(yīng)率(A0為OnM時0D450讀數(shù)，A為游離小分子競爭孔的0D450讀數(shù)）
[0077] 交叉率=(C游離抗原50%抑制/C交叉物50%抑制)*100%
[0078] 根據(jù)結(jié)果來看，Hey與抗SAH單克隆抗體的交叉反應(yīng)遠(yuǎn)小于1 %，而SAM與抗SAH單克 隆抗體雖然存在交叉，但交叉基本在1 %~5%范圍內(nèi)，因此，實驗實施時可添加僅有SAM的 實驗組以去除交叉反應(yīng)所造成的背景。
[0079] 根據(jù)圖2所示標(biāo)準(zhǔn)曲線示例，橫軸為以10為底，SAH標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對數(shù)值，縱軸為 0D450/0D450零靜與1-0D450/0D450零靜的自然對數(shù)值。擬合的曲線后將樣本0D450代入方程 即可求得其對應(yīng)SAH濃度值。
[0080] 實施例2:體外測定HMT活性最適宜緩沖體系
[0081 ]取包被BSA-SAH抗原的ELISA板條，分別以pH7 ? 79、pH8 ? 04、pH8 ? 23、pH8 ? 39的20mM Tris緩沖液和口117.〇4117.44117.84118.0的10〇111]\1?8緩沖液配制含20碰3厶11、20碰此7和 lug/ml HMT的HMT體系反應(yīng)液，反應(yīng)液每孔50ul，HRP標(biāo)記的抗體每孔5〇111。37°(：反應(yīng)20min， 洗板后每孔加入l〇〇ul TMB，37°C顯色15min后加入終止液50ul后讀數(shù)。其中SAH標(biāo)準(zhǔn)曲線用 0、0 ? 3125、0 ? 625、1 ? 25、2 ? 5、5、10uM標(biāo)準(zhǔn)品，且分別用pH7 ? 緩沖液和pH 8 ? 25Tris緩沖液 配制。將所檢測到的標(biāo)曲進(jìn)行擬合，并分別計算各實驗組SAH的生成量。結(jié)果如下表所示： [0082] 表3不同pH、緩沖液條件下HMT催化SAH生成對比
[0083]
[0084] SAH的生成量由檢測值去除背景值表示。由以上的結(jié)果可知：（1)在不同pH條件下， 底物、酶量不變時，PH8.38的Tris緩沖液及pH7.8的TO緩沖液中的SAH生成量分別為Tris和 PB緩沖液中最高；（2)隨著pH的升高，SAH的生成量有一定程度的提高，但隨著pH上升到一定 范圍后，SAH生成量的提高不是很顯著；（3)而對比Tr i s和TO緩沖液，TO緩沖液中的SAH生成 量稍高。
[0085]為考察離子添加對HMT體系的影響，初步以pH7.8的TO緩沖液K+、BSA考察。結(jié)果如 下表所示：
[0086] 表4不同濃度K+、BSA條件下HMT催化SAH生成對比(PB緩沖液）
[0089] 由上述結(jié)果可知：（1)K+的添加對促進(jìn)SAH的生成并無顯著效果，但相對而言， 100mM的K+對SAH的生成少量促進(jìn)作用，而稍高濃度的K+如200mM將造成SAH的生成量減少； (2)BSA的添加在一定濃度范圍內(nèi)可使SAH的生成量提高，但隨著BSA濃度的增加，這種促進(jìn) 作用將逐步減弱。
[0090] 表5不同濃度K+、Mg2+條件下HMT催化SAH生成對比（Tris緩沖液）
[0091]
[0092]由于Mg2+在PB溶液中將發(fā)生較強(qiáng)的水解，故在TO緩沖液中不做Mg2+的考察，而在 Tris中添加K+、Mg2+的結(jié)果也表明：（l)Mg2+濃度從25mM增加到200mM，SAH的生成量將持續(xù)下 降，說明Mg 2+并不能促進(jìn)甲基轉(zhuǎn)移酶催化合成SAH。因此在后期的實驗中所使用的酶反應(yīng)緩 沖液均不添加Mg2+;(2)K+添加量對SAH生成的影響與PB緩沖液中的趨勢相似，K+的濃度為 100mM時，SAH的生成較高，但從整體上來看SAH的生成量低于不添加K+的實驗組；（3)Tris中 無論是添加K+還是Mg 2+，SAH的生成量比PB緩沖液中SAH的生成量均低一些。
[0093]綜合上述實驗結(jié)果，后期實驗將選擇0.1 %BSA，100mM K+，pH7.80的TO緩沖液作為 酶反應(yīng)緩沖液。
[0094]實施例3:體外測定HMT的酶濃度及底物濃度
[0095] 取包被BSA-SAH抗原ELSIA板條，以酶反應(yīng)緩沖液pH7.8配制SAH標(biāo)準(zhǔn)品0、0.3125、 0.625、1.25、2.5、5、10uM及4uM質(zhì)控。并配制不同濃度的SAM、Hey和HMT酶配方。標(biāo)準(zhǔn)品和酶 反應(yīng)物每孔50ul，HRP標(biāo)記的抗體每孔50ul。37°(1；反應(yīng)時長取2〇111；[11、30111；[11、40111；[11，洗板后 100ul TMB 37°C顯色15min，終止液50ul后讀數(shù)。
[0096] 表6不同底物濃度、HMT濃度條件下HMT催化SAH生成對比
[0098]根據(jù)上表的結(jié)果，SAM濃度的增加將造成背景值的增加，這是由SAM與抗SAH單克隆 抗體的交叉反應(yīng)所引起。同時，SAM濃度的增加將顯著促進(jìn)SAH的生成量的增加，但在酶濃度 及Hey的濃度一定的條件下，SAM的持續(xù)增加，其轉(zhuǎn)化為SAH的轉(zhuǎn)化率是有所降低的，因此從 背景值及成本兩方面考慮，SAM的濃度不宜過高。相對SAM，Hcy濃度的增加對SAH生成的促進(jìn) 作用比較弱。而HMT酶濃度的提高從整體上來說，可使SAH的量略有提高，但提高量并不顯 著。
[0099] 為進(jìn)一步考察Hey濃度及酶濃度對SAH生成的影響，將SAM的濃度定為20uM，配制不 同濃度的Hey和mrr酶的反應(yīng)液。
[0100] 表7不同Hey濃度、HMT濃度條件下SAH的生成對比
[0102] HMT酶的濃度為0.3ug/ml時，Hey濃度提高，SAH的生成量有所增加，尤其是當(dāng)Hey的 濃度從40uM提高到60uM時，SAH的生成量有顯著增加，而當(dāng)Hey的濃度繼續(xù)提高到80uM時， SAH的生成量開始下降，且HMT的濃度為0.5ug/ml和lug/ml時的趨勢也是如此。因此Hey的最 佳使用濃度不應(yīng)超過60uM。而對于HMT的使用濃度，在SAM和Hey均為20uM的條件下，從 0 ? 3ug/ml到0 ? 5ug/ml，SAH的生成有顯著增加，進(jìn)一步將HMT酶提高到lug/ml時，SAH的生成 仍有一定程度提高，但對比上一步的實驗，SAM和Hey均為20uM，HMT在2ug/ml時，SAH的生成 量與lug/ml實驗組相差不多。
[0103]實施例4:體外測定HMT活性最適宜反應(yīng)時間段確定
[0104] 取包被BSA-SAH抗原ELSIA板條，以酶反應(yīng)緩沖液pH7 ? 8配制SAH標(biāo)準(zhǔn)品0、0 ? 3125、 0.625、1.25、2.5、5、10碰及4碰質(zhì)控。配制5厶11和此7 20碰、冊頂每1耶/1111，5厶11和此7 20碰、 HMT酶0.7ug/ml、SAM和Hey 20uM、HMT酶0.5ug/ml，（均為終濃度）作為生成SAH底物與酶量。 標(biāo)準(zhǔn)品和酶反應(yīng)物每孔50ul，HRP標(biāo)記的抗體每孔5〇111。37°(：反應(yīng)時長取20min、40min、 60min，洗板后100ul TMB 37°C顯色15min，終止液50ul后讀數(shù)。
[0105]表8不同反應(yīng)時間對HMT催化合成SAH的量的影響
[0107] 從上述結(jié)果顯示，結(jié)果顯示，HMT酶生成SAH量在20-60min時，SAH量無明顯變化，基 本處于平臺期，說明20min后可能底物濃度不夠或者所生成的SAH已經(jīng)對HMT酶產(chǎn)生了產(chǎn)物 抑制，導(dǎo)致SAH生成量無增加。
[0108]實施例5:正常肝細(xì)胞系L02的MT活性 [0109] 實驗材料：
[0110]無菌 PBS，0.25% 胰酶（阿拉丁），10%FBS(元亨圣馬）的 1640培養(yǎng)基(Gibco)，75cm2 方瓶（Corning)，磷酸鹽緩沖液（PBS) :NaCl 8g，Na2HP〇4.12H20 2.885g，KCl 0.2g，KH2P〇4 0.2g，超純水1000ml;胰酶(0.25 %胰蛋白酶）：胰蛋白酶0.1 g，4 % EDTA溶液200y 1，1 X roS溶 液39.8ml;胰蛋白酶充分溶解后用0.2mi無菌過濾頭(Pall)過濾。臺盼藍(lán)溶液(4%曲利苯藍(lán) 溶液，阿拉丁）：曲利苯藍(lán)1.6g，超純水40ml，用濾紙過濾。
[0111] 實驗步驟：
[0112] 1.觀察方瓶內(nèi)細(xì)胞處于80%左右匯合度時，將10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基去除后 用PBS洗一遍；
[0113] 2.加入適量體積的胰酶，保證胰酶覆蓋整個方瓶底部；
[0114] 3.將方瓶置于37 °C、5 %⑶滿養(yǎng)箱中2-3min，當(dāng)細(xì)胞開始成片脫落時，加入5ml含 10 % FBS的1640培養(yǎng)基終止。
[0115] 4 ?離心后用lml左右PBS重懸，臺盼藍(lán)計數(shù)；
[0116] 5.取lml各組細(xì)胞懸液在冰浴中超聲破碎，在15000g下離心取上清。
[0117] 6.取包被BSA-SAH抗原ELSIA板條，BSA-SAH的包被濃度為lug/ml，以酶反應(yīng)緩沖液 卩117.8配制5厶11標(biāo)準(zhǔn)品0、0.3125、0.625、1.25、2.5、5、10碰及4碰質(zhì)控。
[0118] 7.以細(xì)胞破碎液為酶反應(yīng)液分別配制SAM 5uM和20uM，以及SAM 5uM&Hcy20uM，SAM 20uM&Hcy 20uM的反應(yīng)液，標(biāo)準(zhǔn)品和酶反應(yīng)物每孔50ul，HRP-抗SAH酶標(biāo)抗體1:10000用HRP 稀釋液稀釋，每孔50ul，37°C反應(yīng)20min。洗板后100ul TMB 37 °C顯色15min，終止液50ul后 讀數(shù)。結(jié)合臺盼藍(lán)計數(shù)的結(jié)果，將L02的細(xì)胞量調(diào)整為108cell S，并將SAH相應(yīng)地
[0119] 調(diào)整為該密度下的反應(yīng)生成量。
[0120]表9.正常肝細(xì)胞系L02的MT催化合成的SAH
[0122]由上表可知，添加SAM，有SAH生成，說明細(xì)胞裂解液中的MT催化了 SAM的甲基轉(zhuǎn)移， 從而生成SAH，SAM的濃度增加，SAH的生成也有一定程度的增加。而在添加SAM的基礎(chǔ)上再添 加Hey，SAH的生成量也有增加，這說明該細(xì)胞裂解液中存在一定量的HMT，而且還存在其他 種類的MT。足以證明用該方法測定以SAM為甲基供體的一類甲基轉(zhuǎn)移酶活性的可實施性。
[0123]上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的 限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化， 均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 一種甲基轉(zhuǎn)移酶活性實時測定方法，其特征在于，包括在一個反應(yīng)體系內(nèi)兩個同時 進(jìn)行的反應(yīng)：（1)在保證以S-腺苷蛋氨酸為甲基供體的甲基轉(zhuǎn)移酶有生物學(xué)活性的緩沖體 系中，加入含有甲基轉(zhuǎn)移酶的樣品、甲基供體和相應(yīng)的底物或者直接在含有甲基轉(zhuǎn)移酶的 液態(tài)樣品中加入SAM甲基供體和相應(yīng)的底物，進(jìn)行反應(yīng)以便產(chǎn)生S-腺苷同型半胱氨酸產(chǎn)物， 底物為甲基的接受體物質(zhì)；（2)利用免疫學(xué)方法檢測SAH的含量，來確定反應(yīng)體系中甲基轉(zhuǎn) 移酶的活性。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的甲基轉(zhuǎn)移酶活性實時測定方法，其特征在于，利用包被抗原法 和包被抗體法兩種方式的競爭法測量S-腺苷同型半胱氨酸的含量； 1) 包被抗原法:預(yù)先將偶聯(lián)的SAH抗原包被在固相酶聯(lián)板中，同時加入待檢抗原和示蹤 物標(biāo)記的抗SAH抗體，待檢抗原即生化反應(yīng)產(chǎn)生的產(chǎn)物SAH，待檢抗原與包被抗原共同競爭 示蹤物標(biāo)記的抗SAH抗體，反應(yīng)后洗板，與包被抗原結(jié)合的示蹤物標(biāo)記的抗SAH抗體保留，與 待檢抗原結(jié)合的示蹤物標(biāo)記的抗體則被洗掉，最后加入底物顯色，最終顯色結(jié)果與待檢抗 原量成反比，在測定過程中，用配制的一系列梯度已知量的SAH作為標(biāo)準(zhǔn)品，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線； 2) 包被抗體法:先將羊或兔抗鼠 IgG包被的微孔板中加入抗SAH抗體孵育，或者直接包 被抗SAH抗體，洗板;加入示蹤物標(biāo)記的SAH抗原，再加入待檢抗原，待檢抗原即生化反應(yīng)產(chǎn) 生的產(chǎn)物SAH，待檢抗原與示蹤物標(biāo)記的SAH競爭包被在酶聯(lián)板上的抗SAH特異性抗體，孵育 洗板;加入底物顯色，在測定過程中，用配制的一系列梯度已知量的SAH作為標(biāo)準(zhǔn)品，制作標(biāo) 準(zhǔn)曲線。'3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的甲基轉(zhuǎn)移酶活性實時測定方法，其特征在于，采用SAH抗原的 類似物替代SAH抗原進(jìn)行偶聯(lián)或者示蹤物標(biāo)記。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的甲基轉(zhuǎn)移酶活性實時測定方法，其特征在于，采用包被抗原法 的具體步驟如下： (1) 不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品的配制：取S-腺苷同型半胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)品，用緩沖液配制成不同濃度 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品； (2) 在包被有蛋白-SAH偶聯(lián)物或多聚體-SAH偶聯(lián)物的微孔板中，加入辣根過氧化物酶 或堿性磷酸酶標(biāo)記的抗S-腺苷同型半胱氨酸單克隆抗體，含有S-腺苷蛋氨酸、待測甲基轉(zhuǎn) 移酶的樣品及與待測甲基轉(zhuǎn)移酶相應(yīng)的甲基接受體物質(zhì)的緩沖液體系；如果是液態(tài)樣品， 則直接加入S-腺苷蛋氨酸、待測甲基轉(zhuǎn)移酶的樣品及與待測甲基轉(zhuǎn)移酶相應(yīng)的甲基接受體 物質(zhì);標(biāo)準(zhǔn)曲線孔中加入配制好的不同濃度梯度的SAH標(biāo)準(zhǔn)品;混勻后反應(yīng)，洗板； (3) 加入辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶的底物，顯色，加入終止液終止反應(yīng)，在酶標(biāo)儀 上選擇適當(dāng)波長讀取每孔的吸光度讀數(shù)光密度值； (4) 在同一酶聯(lián)板中用配制的一系列已知量的SAH標(biāo)準(zhǔn)品，據(jù)其光密度值與已知標(biāo)準(zhǔn)品 濃度獲得曲線方程，再將樣本光密度值代入方程求得其對應(yīng)的反應(yīng)產(chǎn)物SAH的生成量； (5) 根據(jù)含有甲基轉(zhuǎn)移酶的樣品在單位時間內(nèi)催化生成產(chǎn)物SAH的濃度來計算甲基轉(zhuǎn) 移酶的活性。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的甲基轉(zhuǎn)移酶活性實時測定方法，其特征在于， 緩沖液是包括鉀離子濃度范圍在25-200mM，BSA添加濃度在0.1%-0.9%，pH范圍為 7.0-8.5的Tris或1?緩沖系統(tǒng)；優(yōu)選是包括鉀離子濃度為100mM，BSA添加濃度0.1 %，pH為 7.8的PB緩沖系統(tǒng)。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的甲基轉(zhuǎn)移酶活性實時測定方法，其特征在于，緩沖液配制的用 于制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品濃度分別為0、0.3125、0.625、1.25、2.5、5、10μΜ。7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的甲基轉(zhuǎn)移酶活性實時測定方法，其特征在于，液態(tài)樣品或者緩 沖液中甲基供體加入后的濃度范圍為10_30μΜ，底物加入后的濃度范圍為10-60μΜ;優(yōu)選液 態(tài)樣品或者緩沖液中甲基供體加入后的濃度20μΜ，底物加入后的濃度20μΜ; 加入每個微孔的緩沖液體系或者液態(tài)樣品的體積為50μ1，稀釋后的示蹤物標(biāo)記的抗體 的體積為50μ1。8. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的甲基轉(zhuǎn)移酶活性實時測定方法，其特征在于，在測定ΗΜΤ時，反 應(yīng)時間和溫度分別為37 °C和20分鐘。9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的甲基轉(zhuǎn)移酶活性實時測定方法，其特征在于，含有甲基轉(zhuǎn)移酶 的樣品來源于基因工程表達(dá)的產(chǎn)物、生物組織細(xì)胞內(nèi)被純化出的樣品、組織細(xì)胞內(nèi)的甲基 轉(zhuǎn)移酶，生物體液或組織細(xì)胞培養(yǎng)液等;生物體液為血液，血漿，血清，唾液，尿液，腦脊液， 腹腔或胸腔滲出液，組織液等。10. 權(quán)利要求1-9任一項所述的甲基轉(zhuǎn)移酶活性實時測定方法配套的試劑盒，其特征在 于，包括:包被有抗S-腺苷同型半胱氨酸抗體或S-腺苷同型半胱氨酸抗原的微孔板;示蹤物 標(biāo)記的抗S-腺苷同型半胱氨酸抗體或示蹤物標(biāo)記的S-腺苷同型半胱氨酸抗原；S-腺苷同型 半胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)品；保證以S-腺苷蛋氨酸為甲基供體的甲基轉(zhuǎn)移酶有生物學(xué)活性的緩沖液、 S-腺苷蛋氨酸、待測甲基轉(zhuǎn)移酶相應(yīng)的甲基受體物質(zhì)；陽性質(zhì)控品甲基轉(zhuǎn)移酶;示蹤物檢測 系統(tǒng)。
【文檔編號】G01N33/558GK106053795SQ201610549785
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年7月13日
【發(fā)明人】郝秀娟, 周敏
【申請人】湖南天合生物技術(shù)有限公司