一種基于近紅外上轉(zhuǎn)換發(fā)光標(biāo)記和磁分離的赭曲霉毒素a檢測方法
【專利摘要】一種基于近紅外上轉(zhuǎn)換發(fā)光標(biāo)記和磁分離的赭曲霉毒素A檢測方法，用于小麥及其制品等中赭曲霉毒素A(OTA)含量的檢測。通過將NaYF4:Yb0.2,Tm0.02近紅外上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料與赭曲霉毒素A核酸適配體連接形成信號探針，再通過堿基互補配對原則與適配體互補寡核苷酸單鏈修飾的Fe3O4磁性納米材料形成納米復(fù)合物，此時上轉(zhuǎn)換發(fā)光信號達(dá)到最大；當(dāng)檢測體系中存在OTA時，OTA與OTA適配體特異性結(jié)合，從而使雙鏈解鏈，通過監(jiān)控近紅外光區(qū)804nm處的上轉(zhuǎn)換發(fā)光信號強度，能夠定量檢測OTA，線性范圍為0.01?100ng/mL，檢出限為0.005ng/mL。本發(fā)明用于OTA檢測具有靈敏度高、快速簡便的優(yōu)點，并應(yīng)用于啤酒樣品的檢測，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。
【專利說明】
一種基于近紅外上轉(zhuǎn)換發(fā)光標(biāo)記和磁分離的赭曲霉毒素 A檢 測方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] -種基于近紅外上轉(zhuǎn)換發(fā)光標(biāo)記和磁分離的赭曲霉毒素A檢測方法，涉及納米材 料和分析化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，用于對食品中赭曲霉毒素A進行檢測。
【背景技術(shù)】
[0002] 赫曲霉毒素A(0chratoxins A，0TA)主要由純綠青霉（Penicillium Verrucosum)、 赫曲霉(Aspergillus achraceus)和碳黑曲霉(A.carbonarius)三種真菌產(chǎn)生，不少其他產(chǎn) 毒菌株也不斷地被報道。0TA主要污染植物性產(chǎn)品，比如谷物、豆類、花生、葡萄干、咖啡、啤 酒和紅酒，不少報道顯示，部分動物性產(chǎn)品中也存在0TA，這是因為食物鏈蓄積作用，動物攝 食部分受0TA污染的植物性產(chǎn)品導(dǎo)致0TA在動物體內(nèi)富集。0TA具有較強的肝臟、腎臟和神經(jīng) 毒性和致畸、致癌、致突變作用，對人類身體健康和食品安全造成很大的危害。因此，建立準(zhǔn) 確、靈敏、快速的0TA檢測技術(shù)對于食品安全具有重大意義。
[0003] 目前檢測0TA的主要方法有薄層色譜法(TLC)、高效液相色譜法(HPLC)、液相色譜 質(zhì)聯(lián)用法(LC-MS/MS)、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)和膠體金免疫層析分析法(GICA)等。ELISA 主要基于抗原抗體親和反應(yīng)，常用于OTA現(xiàn)場快速檢測和大批量樣品篩選。但抗體易受外界 條件影響，尤其是溫度，而且抗體的制備需要經(jīng)過動物或者細(xì)胞實驗，繁瑣費時，成本較高； 而基于儀器的分析方法則需要大量的人力和財力投入，常常只用于實驗室分析。所以開發(fā) 一種快速方便，穩(wěn)定性好、靈敏度高、特異性強、成本低廉的新型檢測方法是很有必要的。
[0004] 核酸適配體(Aptamer)通過指數(shù)富集配體系統(tǒng)進化（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)技術(shù)從體外篩選得到的，能與相應(yīng)配體專一 性緊密結(jié)合的一類單鏈寡核苷酸序列。這種寡核苷酸序列形成的高級結(jié)構(gòu)能夠識別與之對 應(yīng)的任何類型的蛋白和低分子等靶物質(zhì)，并與靶物質(zhì)具有高度親和力。與抗體相比，適配體 的靶分子范圍廣，體外篩選，易人工合成和修飾，分子較小，穩(wěn)定性好，對溫度不敏感，容易 保存，而且適配體作為識別分子已經(jīng)在臨床診斷、臨床治療、藥物運輸、蛋白質(zhì)組研究和食 品安全中得到廣泛應(yīng)用。
[0005] 近年來，新型納米材料在分析檢測中的快速發(fā)展受到越來越多的科研工作者的青 睞，并涌現(xiàn)出了很多具有優(yōu)秀特性的納米材料。其中上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米材料引起獨特的光學(xué) 特性被人們所熟知。
[0006] 上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米材料(Upconversion Nanoparticles，UCNPs)的發(fā)光機制是基于 雙光子或者多光子過程，是一種將紅外光轉(zhuǎn)變成可見光的有效途徑。相對于傳統(tǒng)的有機焚 光染料和其他熒光納米材料，上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米材料作為完全惰性的無機發(fā)光材料具有很大 的優(yōu)勢，光化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，單色性強，具有較長的發(fā)光壽命，可以選擇不同的基質(zhì)材料和摻 雜離子來調(diào)節(jié)上轉(zhuǎn)換發(fā)光，真正實現(xiàn)單激發(fā)多發(fā)射，有利于生物體系中多組分標(biāo)記同時檢 測。鑒于上述優(yōu)點，上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米材料已成為一種優(yōu)秀的生物標(biāo)記材料被廣泛的用于生 物監(jiān)測分析領(lǐng)域。
[0007] 本發(fā)明首先合成了在804nm處有強發(fā)射峰的近紅外上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米材料，其次用 一步合成法制備了氨基化Fe3〇4磁性納米材料，并分別在近紅外上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米材料上修飾 0TA適配體和在Fe304磁性納米材料上修飾互補寡核苷酸鏈，分別組成信號探針和磁性探 針，基于兩者堿基互補配對原則，使得兩種探針形成近紅外上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米材料-磁性納米 材料納米復(fù)合物，此時的發(fā)光強度達(dá)到最大。當(dāng)加入不同量的0TA時，0TA與適配體進行特異 性結(jié)合，使得雙鏈結(jié)構(gòu)解離，部分近紅外上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米材料從磁性納米材料表面脫落，近 紅外上轉(zhuǎn)換發(fā)光強度減弱，以980nm激光作為激發(fā)光源記錄近紅外上轉(zhuǎn)換發(fā)光檢測信號，通 過對不同濃度赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)品的檢測，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，達(dá)到對含赭曲霉毒素A樣品進行 定量檢測的目的。該發(fā)明可以用于啤酒、玉米、谷物、飼料及其制品等樣品中赭曲霉毒素A含 量的檢測。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0008] 一種基于近紅外上轉(zhuǎn)換發(fā)光標(biāo)記和磁分離的赭曲霉毒素A檢測方法：將NaYF4: Yb0.2，TmQ.()2近紅外上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米材料和Fe 3〇4磁性納米材料分別通過EDC/NHS反應(yīng)和戊二 醛交聯(lián)法偶聯(lián)親和素，利用親和素和生物素之間的高親和力，分別偶聯(lián)生物素化0TA適配體 和互補鏈，基于雜交反應(yīng)使兩種材料形成納米復(fù)合物，此時納米復(fù)合物具有最大的發(fā)光信 號。當(dāng)這個復(fù)合物體系中加入目標(biāo)物0TA后，由于0TA適配體與0TA的特異性識別結(jié)合，0TA適 配體優(yōu)先結(jié)合靶標(biāo)0TA，導(dǎo)致0TA適配體與互補鏈的解離，造成近紅外上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米材料 和磁性納米材料的分離，通過外加磁場作用，收集得到的納米復(fù)合物中近紅外上轉(zhuǎn)換發(fā)光 納米材料減少，此時的發(fā)光信號就會相應(yīng)的減弱，根據(jù)加入靶標(biāo)濃度與發(fā)光信號強度變化 量之間的關(guān)系，可以實現(xiàn)0TA的定量檢測;步驟為：
[0009] (1)通過高溫?zé)峤夥夹g(shù)，制備NaYF4: Ybo.2，Tmo.02近紅外上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米材料，并 對其做表面修飾。稱取YC13 ? 6H20，YbCl3 ? 6H20，TmCl3 ? 6H2〇(Ln:78mol%Y3+，20mol%Yb3+， 2mo 1 % Tm3+;總共lmmo 1)加入到1 OOmL三口燒瓶中，加入6mL油酸以及15mL 1 -十八烯。在攪拌 下，逐漸升溫至160°C，待形成均一的溶液后，自然冷卻至室溫。準(zhǔn)確稱取2.5mmol NaOH和 4mmol NH4F溶于10mL甲醇溶液中。將上述溶液緩慢加入到三口燒瓶中，磁力攪拌30min。再 將溶液緩慢加熱去除甲醇，氬氣保護下加熱到300°C，并且持續(xù)lh。反應(yīng)結(jié)束后，自然冷卻至 室溫，用水和乙醇離心所得材料清洗三次，儲存?zhèn)溆谩?br>[0010] (2)利用配體交換法對上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米顆粒進行表面羧基化修飾。稱取30mg油酸 修飾NaYF4: Ybo.2，Tmo.〇2UCNPs分散于4mL氯仿溶液中。于圓底燒瓶中，加入200mg聚丙稀酸(相 對分子量2000)和8mL超純水，攪拌均勻充分溶解。將UCNPs氯仿溶液緩慢加入到圓底燒瓶 中，磁力攪拌24h后，離心收集材料，用超純水清洗數(shù)次，得到聚丙烯酸修飾NaYF4: Ybo. 2， Tmo. Q2近紅外上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米材料，儲存?zhèn)溆谩?br>[0011 ] (3)采用一步溶劑法制備氨基化Fe3〇4磁性納米材料。稱取2.0g無水醋酸鈉，1.0g FeCh ? 6H2O和6.5g 1，6_己二胺加入30mL乙二醇中，磁力攪拌下加熱至50°C，待形成透亮均 一的膠體溶液后，轉(zhuǎn)移到帶內(nèi)襯的反應(yīng)釜中，在198°C件下反應(yīng)6h。待反應(yīng)釜冷卻后，將釜內(nèi) 液體轉(zhuǎn)移到燒杯中，磁鐵分離收集黑色固體，棄去上清，反復(fù)清洗幾次。所得黑色固體在60 °(：條件下過夜干燥備用。
[0012] (4)利用EDC/NHS法將羧基化上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米材料與親和素(Avidin)偶聯(lián)。稱取 lOmg聚丙稀酸修飾的NaYF4: Ybo.2，Tm〇.()2近紅外上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米材料分散于5mL lOmmol/L 1^3化115.6)緩沖液中，充分超聲分散，加入0.61^211^/1111^0(：溶液和0.21^211^/1^順3溶 液，37°C搖床中活化2h。離心收集材料，用磷酸緩沖液清洗三次。然后分散于磷酸緩沖液中， 加入lmL 0.5mg/mL親和素溶液，在37°C搖床中反應(yīng)12h。離心收集材料和上清，測定親和素 反應(yīng)前后的紫外吸收。
[0013] (5)利用戊二醛法將氨基化Fe3〇4磁性納米材料與親和素偶聯(lián)。準(zhǔn)確稱取10mg氨基 化Fe3〇4磁性納米材料分散于5mL 10mmol/L磷酸緩沖液中，充分超聲分散，然后加入1.25mL 25 %戊二醛溶液，37 °C孵育2h，磁分離后，用磷酸清洗數(shù)次，磁分離收集后，分散于磷酸緩沖 液中，加入lmL 0.5mg/mL親和素溶液，37°C搖床中反應(yīng)12h后磁分離收集。
[0014] (6)利用通過親和素(Avidin)與生物素(Biotin)之間的特異性結(jié)合將表面修飾親 和素的近紅外上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米顆粒和親和素修飾的Fe3〇4磁性納米材料分別與生物素 (Bi〇t in)修飾的赭曲霉毒素A適配體DNA單鏈和互補鏈連接。具體方法為：將親和素修飾 NaYF4: Ybo.2，Tmo.〇2近紅外上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米材料分散于磷酸緩沖液中，加入一定量的生物素 化0TA適配體，在37 °C搖床中孵育12h，離心收集材料和上清，用磷酸緩沖液清洗三次，將最 后得到的近紅外上轉(zhuǎn)換發(fā)光信號探針（apt-UCNPs)分散于BB緩沖液（10mM Tris，pH8.5， 120mM NaCl，5mM KC1 和20mM CaCl2)中。
[0015]將親和素修飾的Fe3〇4磁性納米材料分散于5mL磷酸緩沖液中，加入一定量的生物 素化0TA適配體互補鏈，在37°C搖床中孵育12h，磁分離收集材料，用磷酸緩沖液清洗數(shù)次， 將最后得到的互補鏈修飾的磁性納米探針（cDNA-MNPs)分散于BB緩沖液（10mmol/L Tris， pH 8.5，120mmol/L NaCl，5mmol/L KC1 和20mmol/L CaCl2)中，4°C保存。
[0016] (7)對赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)品進行檢測，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過赭曲霉毒素A適配體DNA 與其互補DNA單鏈的雜交，取75yL信號探針和80yL磁性探針在BB緩沖液中37°C反應(yīng)2h，得到 近紅外上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米材料-磁性納米材料復(fù)合物，磁分離收集復(fù)合物，用BB緩沖液清洗數(shù) 次，保證游離的近紅外上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米材料完全除去，重懸于BB緩沖液中，在980nm激光激 發(fā)下得到804nm處的上轉(zhuǎn)換發(fā)光信號，此時復(fù)合物的信號（1〇)最大。配制不同濃度的0TA標(biāo) 準(zhǔn)品加入到納米復(fù)合物體系中，在37°C反應(yīng)2h后，外界磁場分離下清洗數(shù)次，保證脫落下來 的UCNPs完全洗去。于熒光光譜儀中，在980nm激光激發(fā)下測定發(fā)光強度，隨著赭曲霉毒素A 濃度的增加發(fā)光信號（I)逐步減小。根據(jù)發(fā)光差值(AI = I-Io)與對應(yīng)的赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn) 品濃度建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，實驗結(jié)果在〇.〇l-l〇〇ng/mL區(qū)間內(nèi)得到良好線性關(guān)系。
[0017] (8)對赭曲霉毒素A樣品進行檢測：對樣品做簡單的處理，隨后直接加入到上述納 米復(fù)合物體系中37°C孵育2h后，直接在980nm激光下激發(fā)得到804nm處的上轉(zhuǎn)換發(fā)光信號， 從標(biāo)準(zhǔn)曲線中求得對應(yīng)的赭曲霉毒素A的濃度。
[0018]本發(fā)明的優(yōu)點是：
[0019] (1)利用適配體對被檢測物質(zhì)實現(xiàn)特異性捕獲，有效提高了檢測的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確 性。
[0020] (2)利用適配體與抗體相比較，具有可人工合成，不依賴動物和細(xì)胞，周期短、成本 低、批次間差異小，便于化學(xué)修飾，穩(wěn)定性也好，可長期保存。
[0021] (3)利用激光誘導(dǎo)上轉(zhuǎn)換發(fā)光，檢測背景低大大提高了檢測的靈敏度。
[0022] (4)利用一步溶劑法制備Fe304磁性納米材料將其用于分析檢測過程，可以簡化分 離過程，提高檢測效率。
【附圖說明】
[0023]圖1:基于基于近紅外上轉(zhuǎn)換發(fā)光標(biāo)記和磁分離的赭曲霉毒素A檢測方法的實驗原 理圖
[0024]圖2:他￥?4113().2，1'111().()2近紅外上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米材料的電鏡圖（ &);聚丙烯酸修飾 NaYF4: Ybo. 2，Tmo. 〇2近紅外上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米材料的電鏡圖(b)
[0025]圖3:氨基化Fe3〇4磁性納米材料的電鏡圖
[0026] 圖4:近紅外NaYF4: Ybo. 2，Tmo. 〇2上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米材料的XRD圖
[0027] 圖5:氨基化Fe3〇4磁性納米材料的XRD圖
[0028] 圖6:他￥?4113().2，1'111().()2近紅外上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米材料的發(fā)光光譜
[0029] 圖7:近紅外上轉(zhuǎn)換發(fā)光強度隨赭曲霉毒素A變化疊加圖（a);赭曲霉毒素A檢測標(biāo) 準(zhǔn)曲線圖（b)，濃度范圍在0.01-100ng/mL。
【具體實施方式】
[0030] 本發(fā)明包括但不限于以上實施例，凡是在本發(fā)明的精神和原則下進行的任何等同 替換或者局部改進，都將視為在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
[0031] 實施例1:啤酒實際樣品中赭曲霉毒素A檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線建立及檢測樣品預(yù)處理：啤 酒樣品置于4°C冰箱冷藏30min，超聲脫氣。取脫氣后啤酒樣品20g，置于25mL容量瓶中，加 2%碳酸氫鈉和15%氯化鈉混合提取液至刻度，混勻，用玻璃纖維濾紙過濾至澄清，收集濾 液備用。
[0032] 從本地超市購買5中不同類別的啤酒，利用本發(fā)明方法和酶聯(lián)免疫方法分別測定 其中赭曲霉毒素A的含量，結(jié)果見表一。兩種方法檢測結(jié)果一致，無明顯差異。
[0033]表一:啤酒實際樣品檢測，本發(fā)明方法與ELI SA方法對比
[0034]
[0035] 注:ND為未檢出
[0036] 實施例2:啤酒實際樣品中赭曲霉毒素A的檢測及加標(biāo)回收率實驗樣品預(yù)處理同實 施例1。
[0037]以實施例1得到的5組赭曲霉毒素A濃度數(shù)據(jù)為本底值，分別向其中加入五種不同 濃度的0TA標(biāo)準(zhǔn)品，同樣利用本發(fā)明方法再次檢測其中0TA的含量，得到檢測值?；厥章剩?= (檢測值-本底值)/添加量X 100%。從表二數(shù)據(jù)可以看到回收率在90.0%~105.0%，說明 本發(fā)明穩(wěn)定，靈敏，準(zhǔn)確，適用于啤酒實際樣品中0TA的檢測。
[0038]表二:啤酒實際樣品中赭曲霉毒素A的檢測及加標(biāo)回收率
【主權(quán)項】
1. 一種基于近紅外上轉(zhuǎn)換發(fā)光標(biāo)記和磁分離的赭曲霉毒素 A檢測方法，其特征在于:將 赭曲霉毒素 A(OTA)適配體與近紅外NaYF4:YbQ.2，TmQ.() 2上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米材料偶聯(lián)形成信號探 針，同時生物素化0TA適配體互補寡核苷酸單鏈與Fe3〇 4磁性納米材料連接形成磁性探針，通 過雙鏈雜交形成似￥?4:￥13().2，1'1]1().()2近紅外上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米材料一Fe3〇4磁性納米材料復(fù)合 物；向檢測體系中加入OTA，0TA會優(yōu)先與適配體結(jié)合，導(dǎo)致互補鏈與0TA適配體解離，從而使 一部分NaYF4: Ybo. 2，Tmo. 〇2近紅外上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米材料一Fe3〇4磁性納米材料復(fù)合物分解，充 分磁分離去上清后，利用980nm激發(fā)，收集上轉(zhuǎn)換發(fā)光在804nm處的發(fā)光信號；在0.01-100ng/mL濃度范圍內(nèi)，0TA的濃度與804nm處上轉(zhuǎn)換發(fā)光信號變化呈正相關(guān)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線， 達(dá)到對0TA的定量檢測，可用于啤酒中0TA的檢測。
【文檔編號】G01N33/543GK106053790SQ201610353399
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年5月25日
【發(fā)明人】王周平, 戴邵亮, 吳世嘉, 段諾
【申請人】江南大學(xué)