專利名稱：蛇毒絲氨酸蛋白酶Harobin的純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種絲氨酸蛋白酶的純化方法，特別涉及一種蛇毒絲氨酸蛋白酶Harobin的純化方法。
背景技術(shù)：
蛇毒絲氨酸蛋白酶Harobin是北京大學(xué)顧軍教授實驗室首次從海蛇毒液中分離得到的海蛇降纖酶基因，是絲氨酸蛋白酶家族成員。序列分析表明，Harobin的基因閱讀框有795個核昔酸(在國際基因文庫注冊，GenBank accession no. AY835844),編碼265個氨基酸殘基，該蛋白序列的I 18氨基酸序列為信號肽序列，19 33氨基酸序列為原肽序列，原肽序列在蛋白的成熟過程中被切除。整個成熟的Harobin(34 265aa)分子量為 25.414，等電點為5. 45。蛇毒絲氨酸蛋白酶Harobin不僅具有溶栓、降纖作用，同時還有降壓作用，其作為治療心血管疾病的效應(yīng)在動物模型中得到初步驗證。相關(guān)的前期工作已經(jīng)發(fā)表在國際SCI雜志“Identification and characterization of Harobin, a novelfibrino (geno) lyticserine protease from a sea snake(Lapemis hardwickii). He J. ,ChenS. and Gu J. FEBSLett.2007,581(16) :2965_2973”。目前，已能使用畢赤酵母對蛇毒絲氨酸蛋白酶Harobin進行表達,但是仍需找到有效的純化方法，才能將蛇毒絲氨酸蛋白酶Harobin推廣應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點與不足，提供一種蛇毒絲氨酸蛋白酶Harobin的純化方法。本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)一種蛇毒絲氨酸蛋白酶Harobin的純化方法，包含以下步驟(I)將表達蛇毒絲氨酸蛋白酶Harobin的畢赤酵母發(fā)酵液離心，收集上清，用緩沖液A對上清透析；(2)通過依次連接的強陽離子瓊脂糖凝膠(SP Sepharose High Performance)層析柱和強陰離子瓊脂糖凝膠(Q Sepharose High Performance)層析柱對步驟(I)得到的透析后的上清進行聯(lián)合層析，首先用緩沖液A洗至280nm吸收值為0，接著用含有O. IM NaCl的緩沖液A對強陰離子瓊脂糖凝膠層析柱洗脫，得到含有目的蛋白的洗脫液；(3)將含有目的蛋白的洗脫液進行苯甲脒瓊脂糖凝膠(BenzamidineSepharose4FF)層析，首先用緩沖液A洗至280nm吸收值為0，接著采用緩沖液B進行非特異蛋白洗脫，直至280nm吸收值是O并保持穩(wěn)定；最后更換緩沖液C進行洗脫，收集緩沖液C洗脫的蛋白樣品；(4)將步驟(3)收集的緩沖液C洗脫的蛋白樣品滴入緩沖液D，使pH值調(diào)回7. 8
8.2 ；
(5)用緩沖液E對步驟(4)最終得到的溶液透析，凍干，得到蛇毒絲氨酸蛋白酶Harobin ；所述的緩沖液A為pH 7. 8 8. 2、15 25mM Tris溶液；優(yōu)選為pH 8. 0,20mMTris
溶液；所述的緩沖液B為含有O. 95 I. 05MNaCl的pH 7. 8 8. 2、15 25mM Tris溶液；優(yōu)選為含有IM NaCl的pH 8. 0、20mM Tris溶液；所述的緩沖液C為pH 3. I 3. 3、45 55mM的甘氨酸溶液；優(yōu)選為pH 3. 2、50mM
的甘氨酸溶液；所述的緩沖液D為pH 7. 8 8. 2,0. 95 I. 05M Tris溶液；優(yōu)選為pH 8. O、IM的Tris溶液；所述的緩沖液E為pH 7. 8 8. 2、15 25mM Tris溶液；優(yōu)選為pH 8. 0,20mMTris溶液；步驟(I)中所述的離心的條件優(yōu)選為4 8 °C、10000 12000rpm、離心30 40min ；步驟(I)中所述的透析的時間優(yōu)選為24 30小時；步驟⑵中所述的聯(lián)合層析的條件優(yōu)選為過柱流速為I 2mL/min，最高柱壓小于 O. 40Mpa ；步驟(3)中所述的苯甲脒瓊脂糖凝膠層析的條件優(yōu)選為過柱流速為I 2mL/min,最高柱壓小于O. 40Mpa ；步驟(5)中所述的透析的時間優(yōu)選為24 30小時。本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點及效果本發(fā)明所提供的純化方法簡單，得到的蛇毒絲氨酸蛋白酶Harobin純度非常高，可達到95%以上，得率85%以上。


圖I是透析后的上清液過強陽離子瓊脂糖凝膠和強陰離子瓊脂糖凝膠聯(lián)合層析的紫外吸收圖，其中A為聯(lián)合層析的穿透紫外吸收峰出為使用含O. IMNaCl的pH 8.0、20mM Tris溶液對強陰離子瓊脂糖凝膠柱洗脫的紫外吸收峰。圖2是經(jīng)過聯(lián)合層析得到的洗脫液過苯甲脒瓊脂糖凝膠紫外吸收圖，其中A為穿透紫外吸收峰為含IM NaCL的pH 8. 0、20mM Tris溶液洗脫的紫外吸收峰；C為pH 3. 2、50mM的甘氨酸溶液洗脫的紫外吸收峰。圖3是實施例I的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖，其中泳道I為透析后的上清液；泳道2為強陽離子瓊脂糖凝膠柱和強陰離子瓊脂糖凝膠柱聯(lián)合層析得到的穿透峰的蛋白；泳道3為使用含O. IMNaCl的pH 8. 0、20mM Tris溶液對強陰離子瓊脂糖凝膠柱洗脫的蛋白；泳道4為苯甲脒瓊脂糖凝膠層析過程中用pH 3. 2、50mM甘氨酸溶液洗脫的蛋白。圖4是檢測蛋白純度的高效液相色譜圖；A為Harobin目的蛋白峰。圖5是測定Harobin相對分子質(zhì)量的質(zhì)譜圖；A為Harobin目的蛋白峰。
圖6是纖維蛋白平板溶解活性檢測結(jié)果圖，其中1為純化的Harobin在纖維平板上形成的溶栓圈。圖7是纖維蛋白降解活性檢測的SDS-PAGE圖，其中泳道I為2 μ g纖維蛋白原和2 μ g無Harobin的總蛋白37°C保溫6小時的樣品；泳道2為2 μ g纖維蛋白原和2 μ g純化的Harobin 37°C保溫6小時的樣品。圖8是單鏈高分子量激肽原降解活性檢測的SDS-PAGE圖，其中泳道I為2 μ g單鏈高分子量激肽原和2 μ g無Harobin的總蛋白37°C保溫3小時的樣品；泳道2為2 μ g單鏈高分子量激肽原和2 μ g純化的Harobin 37°C保溫3小時的樣品。圖9是苯甲脒瓊脂糖凝膠層析過程的紫外吸收圖，其中A為穿透紫外吸收峰；B為含O. 5M NaCl的pH 8.0、20mM Tris洗脫紫外吸收峰；C為苯甲脒瓊脂糖凝膠pH 3. 2、50mM甘氨酸洗脫紫外吸收峰。圖10是對比實施例的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖，其中泳道I為飽和度85%硫酸銨沉淀的蛋白；泳道2為苯甲脒瓊脂糖凝膠穿透的蛋白；泳道3為含O. 5MNaCl的pH 8. 0、20mMTris溶液洗脫的蛋白；泳道4為pH 3. 2、50mM甘氨酸溶液洗脫的蛋白。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例及附圖對本發(fā)明作進一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。實施例I(I)將表達蛇毒絲氨酸蛋白酶Harobin的畢赤酵母發(fā)酵液(該表達蛇毒絲氨酸蛋白酶Harobin的畢赤酵母發(fā)酵液可通過如下參考文獻的制備方法制備得到Identification and characterization of Harobin, a novel fibrino(geno)lyticserineprotease from a sea snake(Lapemis hardwickii). He J. ,Chen S. and Gu J. FEBSLett. 2007,581(16) =2965-73) 12000rpm 4°C 離心 40min，收集上清，將上清對緩沖液 A (pH
8.O、2OmM Tris 溶液)透析 24h ；(2)將強陽離子瓊脂糖凝膠層析柱(SP Sepharose High Performance柱,GE)和強陰離子瓊脂糖凝膠層析柱(Q Sepharose High Performance柱，GE)依次連接,將步驟(I)得到的透析后的上清液上強陽離子瓊脂糖凝膠層析柱，測定強陰離子瓊脂糖凝膠層析柱流出的紫外吸收值；具體為首先用緩沖液A洗至280nm吸收值為0，接著用含有O. IM NaCl的緩沖液A對強陰離子瓊脂糖凝膠層析柱洗脫，得到含有目的蛋白的洗脫液；過柱流速為lmL/min,最高柱壓小于O. 40Mpa ;聯(lián)合層析的280nm紫外吸收值如圖I所示；(3)將含有目的蛋白的洗脫液進行苯甲脒瓊脂糖凝膠(BenzamidineSepharose4FF)層析，然后用緩沖液A洗至280nm吸收值為0，采用緩沖液B (含有IM NaCl的pH 8.0、20mM Tris溶液)進行非特異蛋白洗脫，直至280nm吸收值是O并保持穩(wěn)定；更換緩沖液C(50mM甘氨酸，pH 3. 2)進行洗脫，收集緩沖液C洗脫的蛋白樣品；過柱流速為lmL/min，最高柱壓小于O. 40Mpa ;過苯甲脒瓊脂糖凝膠FF層析柱的280nm紫外吸收值如圖2所示；(4)將步驟(3)收集的緩沖液C洗脫的蛋白樣品滴入緩沖液D (pH 8. O、IM的Tris溶液)中，使PH值調(diào)為8.0 ;(5)用緩沖液E(pH 8. 0、20mM的Tris溶液)對步驟(4)得到的最終溶液進行透析，凍干，得到蛇毒絲氨酸蛋白酶Harobin。通過15%連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，結(jié)果(圖3)只顯示I條帶。通過高效液相色譜測定，結(jié)果如圖4所示,蛇毒絲氨酸蛋白酶Harobin純度達95%以上。通過質(zhì)譜測定，結(jié)果如圖5所示，蛇毒絲氨酸蛋白酶Harobin的分子量為30901. O道爾頓。通過步驟
(I) (5)的方法，蛇毒絲氨酸蛋白酶Harobin的得率 超過85%。對所純化的蛇毒絲氨酸蛋白酶Harobin測定活性①纖維蛋白平板溶解活性，可參考文獻“Astrup, T. , Mullertz, S. , The fibrin plate method forestimatingfibrinolytic activity. Arch. Biochem. Biophys. , 1952. 40 p. 346-351. ” 進行測定；②纖維蛋白降解活性，可參考文獻“PETER C. HAmiPEL. , MicaA EL W. M0SESS0N.，Degradation of Human Fibrinogen by Plasma a 2-Macroglobulin-Enzyme Complexes.The Journal of Clinical Investigation. , 1973. 9(52) :2175_2184” 進行測定；③單鏈高分子量激肽原降解活性，可參考文獻“Cheryl F. Scott, Lee D. Silver, MarcSchapira, Robert ff. CoIman. , Cleavage of Human High Molecularffeight KininogenMarkedly Enhances Its Coagulant Activity.The American Societyfor ClinicalInvestigation, 1984. 4(73) :954_962”進行測定。纖維蛋白平板溶解活性的結(jié)果如圖6所示，說明Harobin具有良好的體外溶栓活性；纖維蛋白降解活性的結(jié)果如圖7所示，說明Harobin具有良好的體外降纖活性；單鏈高分子量激肽原降解活性的結(jié)果如圖8所示，說明Harobin具有良好的體外降壓活性。對比實施例將表達蛇毒絲氨酸蛋白酶Harobin的畢赤酵母發(fā)酵液(該表達蛇毒絲氨酸蛋白酶Harobin的畢赤酵母發(fā)酵液可通過如下參考文獻的制備方法制備得到identificationand characterization of Harobin,a novel fibrino(geno)lytic serineprotease froma sea snake(Lapemis hardwickii). He J. , Chen S. and Gu J. FEBS Lett. 2007,581 (16)2965-73) 12000rpm 4°C離心40min，收集上清液；在酵母表達上清液中加入硫酸銨至飽和度85%，12000rpm離心30分鐘。取沉淀溶解于平衡緩沖液A (20mM Tris,pH 8.0)，并用平衡緩沖液A透析24小時。再次12000rpm離心20分鐘。取上清進行層析分離，層析柱為Benzamidin Sepharose CL-6B,上樣速度O. 7ml/min,上樣后用平衡緩沖液A洗至280nm吸收值至O，層析圖如圖9所示。采用緩沖液B(20mM Tris, O. 5M NaCl，pH 8.0)進行非特異蛋白洗脫，流速lml/min,直至280nm吸收值是O并保持穩(wěn)定。更換緩沖液C(50mM甘氨酸，PH 3. 2)進行洗脫，收集緩沖液C洗脫的蛋白樣品。通過15%連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，結(jié)果(圖10)顯示10條帶以上。通過高效液相色譜測定，純度為20%左右。蛇毒絲氨酸蛋白酶Harobin的得率為80%?？梢姡景l(fā)明優(yōu)越于現(xiàn)有技術(shù)所提供的方法。上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種蛇毒絲氨酸蛋白酶Harobin的純化方法，其特征在于包含以下步驟 (1)將表達蛇毒絲氨酸蛋白酶Harobin的畢赤酵母發(fā)酵液離心，收集上清，用緩沖液A對上清透析； (2)通過依次連接的強陽離子瓊脂糖凝膠層析柱和強陰離子瓊脂糖凝膠層析柱對步驟(I)得到的透析后的上清進行聯(lián)合層析，首先用緩沖液A洗至280nm吸收值為0，接著用含有O. IM NaCl的緩沖液A對強陰離子瓊脂糖凝膠層析柱洗脫，得到含有目的蛋白的洗脫液； (3)將含有目的蛋白的洗脫液進行苯甲脒瓊脂糖凝膠層析，首先用緩沖液A洗至280nm吸收值為0，接著采用緩沖液B進行非特異蛋白洗脫，直至280nm吸收值是O并保持穩(wěn)定；最后更換緩沖液C進行洗脫，收集緩沖液C洗脫的蛋白樣品； (4)將步驟(3)收集的緩沖液C洗脫的蛋白樣品滴入緩沖液D，使pH值調(diào)回7.8 8. 2 ； (5)用緩沖液E對步驟(4)最終得到的溶液透析，凍干，得到蛇毒絲氨酸蛋白酶Harobin ； 所述的緩沖液A為pH 7. 8 8. 2、15 25mM Tris溶液；所述的緩沖液B為含有O. 95 I.05MNaCl的pH 7. 8 8. 2、15 25mM Tris溶液；所述的緩沖液C為pH 3. I 3. 3、45 55mM的甘氨酸溶液；所述的緩沖液D為pH 7. 8 8. 2、0. 95 I. 05M Tris溶液；所述的緩沖液E為pH 7. 8 8. 2、15 25mM Tris溶液。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的蛇毒絲氨酸蛋白酶Harobin的純化方法，其特征在于所述的緩沖液A為pH 8.0、20mM Tris溶液；所述的緩沖液B為含有IMNaCl的pH 8. 0、20mM Tris溶液；所述的緩沖液C為pH 3. 2、50mM的甘氨酸溶液；所述的緩沖液D為pH 8. 0、1M的Tris溶液；所述的緩沖液E為pH 8. 0、20mM Tris溶液。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的蛇毒絲氨酸蛋白酶Harobin的純化方法，其特征在于步驟(I)中所述的離心的條件為4 8。。、10000 12000rpm、離心30 40min。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的蛇毒絲氨酸蛋白酶Harobin的純化方法，其特征在于步驟(1)中所述的透析的時間為24 30小時。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的蛇毒絲氨酸蛋白酶HaiObin的純化方法，其特征在于步驟(2)中所述的聯(lián)合層析的條件為過柱流速為I 2mL/min,最高柱壓小于O.40Mpa。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的蛇毒絲氨酸蛋白酶Harobin的純化方法，其特征在于步驟(3)中所述的苯甲脒瓊脂糖凝膠層析的條件為過柱流速為I 2mL/min，最高柱壓小于O.40Mpao
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的蛇毒絲氨酸蛋白酶Harobin的純化方法，其特征在于步驟(5)中所述的透析的時間為24 30小時。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種蛇毒絲氨酸蛋白酶Harobin的純化方法。本發(fā)明將表達Harobin的畢赤酵母發(fā)酵液離心，收集上清，用緩沖液A對上清透析；接著使用依次連接的強陽離子瓊脂糖凝膠層析柱和強陰離子瓊脂糖凝膠層析柱對透析后的上清進行聯(lián)合層析，首先用緩沖液A洗至280nm吸收值為0，接著采用緩沖液B進行非特異蛋白洗脫，直至280nm吸收值是0并保持穩(wěn)定；最后更換緩沖液C進行洗脫，收集緩沖液C洗脫的蛋白樣品；將該蛋白樣品滴入緩沖液D，使pH值調(diào)回7.8～8.2，用緩沖液E透析，凍干，得到Harobin。本發(fā)明簡單，得到的蛇毒絲氨酸蛋白酶Harobin純度非常高，可達到95％以上，得率85％以上。
文檔編號C12R1/84GK102643791SQ20121011481
公開日2012年8月22日 申請日期2012年4月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月18日
發(fā)明者洪岸, 陳小佳, 顧軍 申請人:暨南大學(xué)