一種酸性木聚糖酶突變體的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于酶基因改造技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種酸性木聚糖酶突變體及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]木聚糖(xylan)廣泛存在于自然界中，是半纖維素的重要組分，它是自然界中含量僅次于纖維素的第二豐富的多聚糖，幾乎占地球可更新有機(jī)碳含量的三分之一。在被子植物中木聚糖占干物質(zhì)重的15%?30%，在裸子植物中占干物質(zhì)重的7%?12%。但木聚糖具有很強(qiáng)的抗?fàn)I養(yǎng)作用，在動物的消化道內(nèi)不能被消化和吸收，而且會影響其它養(yǎng)分的吸收利用，因而大大限制了富含木聚糖飼料(大麥、小麥、黑麥等)的應(yīng)用。木聚糖酶(Xylanase)是指能專一降解半纖維素木聚糖為低聚木糖和木糖的一組酶的總稱。人們對木聚糖酶的研究早在六十年代就已開始，主要研究集中在食品、飼料、造紙、能源工業(yè)等方面的木聚糖酶，已經(jīng)從不同來源的微生物中分離到大量的不同類型不同功能的木聚糖酶。并分離出多種木聚糖酶基因，已工業(yè)化生產(chǎn)多種木聚糖酶產(chǎn)品。
[0003]因?yàn)槟壳霸陬w粒生產(chǎn)過程中有一個短暫的80?90°C的高溫階段。青霉菌來源木聚糖酶熱穩(wěn)定性較差，其水溶液在65°C下保溫5分鐘剩余酶活性低于30%，使該酶在顆粒飼料的應(yīng)用受到限制。采用飼料制粒后木聚糖酶液體噴涂到飼料上的方法不僅增加設(shè)備投入，而且對酶制劑的穩(wěn)定性、飼料中分布均一性都無法很好的保證。因此，提高木聚糖酶熱穩(wěn)定性對目前飼料用木聚糖酶具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種耐熱木聚糖酶突變體及其應(yīng)用。申請人通過對來源于繩狀青霉(Penicillium funiculosum)的木聚糖酶進(jìn)行蛋白質(zhì)工程改造，獲得了突變體蛋白，其耐熱性得到顯著提高，有利于其在飼料領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用。
[0005]本發(fā)明一方面提供了一種木聚糖酶突變體，其氨基酸序列為SEQ ID NO:1的木聚糖酶的第130位氨基酸由Thr突變?yōu)镻ro。
[0006]上述木聚糖酶突變體的氨基酸序列為SEQ ID NO: 3，其一種編碼核苷酸序列為SEQID N0:4o
[0007]本發(fā)明另一方面提供了一種木聚糖酶突變體，其氨基酸序列為SEQ ID N0:3的木聚糖酶突變體的第68位氨基酸由Ser突變?yōu)锳sn。
[0008]上述木聚糖酶突變體的氨基酸序列為SEQ ID NO: 5，其一種編碼核苷酸序列為SEQID N0:6o
[0009]本發(fā)明還提供了一種木聚糖酶突變體，其氨基酸序列為SEQ ID N0:5的木聚糖酶突變體的第148位氨基酸由Thr突變?yōu)锳rg。
[0010]上述木聚糖酶突變體的氨基酸序列為SEQ ID NO: 7，其一種編碼核苷酸序列為SEQID N0:8o
[0011]本發(fā)明還提供了上述木聚糖酶突變體在飼料中的應(yīng)用。寸
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[0028]XynPF-Rl:TTAAGAGACGGTAATAGTAGAAG
[0029]以繩狀青霉(Penicillium funiculosum)基因組為模板，利用上述引物XynPF-Fl和XynPF-Rl進(jìn)行PCR擴(kuò)增，膠回收PCR產(chǎn)物，連接pEASY_T載體，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5a中，挑取正確的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行測序。測序結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)化子中木聚糖酶的核苷酸序列為SEQ IDNO:2，其編碼的氨基酸序列為SEQ ID NO:1，申請人將該木聚糖酶命名為XynPF。
[0030]實(shí)施例2木聚糖酶突變體基因的擴(kuò)增及合成
[0031]為了提高木聚糖酶XynPF的耐熱性，通過定向進(jìn)化技術(shù)對該酶進(jìn)行了大量突變的篩選，設(shè)計(jì)PCR引物XynPF-F2、XynPF_R2如下:
[0032]XynPF-F2:GGCGAATTCGCTGTTACATCCAACGAGACCGG (下劃線為限制性內(nèi)切酶 EcoRI識別位點(diǎn))
[0033]XynPF-R2:ATAGCGGCCGCTTAAGAGACGGTAATAGTAGAAG (下劃線為限制性內(nèi)切酶 NotI識別位點(diǎn))
[0034]以XynPF基因(SEQ ID NO:2)為模板，利用上述引物用GeneMorph II隨機(jī)突變PCR試劑盒(Stratagene)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，膠回收PCR產(chǎn)物，EcoRI, Not I進(jìn)行酶切處理后與經(jīng)同樣酶切后的pET21a載體連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21 (DE3)中，涂布于LB+Amp平板，37°C倒置培養(yǎng)，待轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)后，用牙簽逐個挑至96孔板，每個孔中加入150ul含有0.1mMIPTG的LB+Amp培養(yǎng)基，37°C 220rpm培養(yǎng)6h左右，離心棄上清，菌體用緩沖液重懸，反復(fù)凍融破壁，獲得含有木聚糖酶的大腸桿菌細(xì)胞裂解液。
[0035]分別取出30ul裂解液至兩塊新的96孔板；將其中一塊于75°C處理5min ;然后將兩塊96孔板都加入30ul底物，于37°C反應(yīng)30min后，DNS法測定生成的還原糖，計(jì)算不同突變子高溫處理后的酶活水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，有些突變對木聚糖酶的耐熱性沒有影響，有些突變甚至使其耐熱性或酶活變得更差了 ；另外還有些突變，雖然能提高木聚糖酶對溫度的耐受性，但突變后其酶學(xué)性質(zhì)發(fā)生了顯著的變化，這些均不符合要求。最終，申請人得到既能顯著提高木聚糖酶XynPF的耐熱性，又不會影響其酶活及原有酶學(xué)性質(zhì)的突變位點(diǎn)及位點(diǎn)的組合:T130P單點(diǎn)突變，S68N、T130P兩點(diǎn)突變，以及S68N、T130P和T148R三點(diǎn)突變。
[0036]將含T130P單點(diǎn)突變的木聚糖酶突變體命名為XynBl，其氨基酸序列為SEQ IDNO:3，編碼核苷酸序列為SEQ ID NO:4 ;含S68N、T130P兩點(diǎn)突變的木聚糖酶突變體命名為XynB2，其氨基酸序列為SEQ ID NO:5，編碼核苷酸序列為SEQ ID NO:6 ;含S68N、T130P和T148R三點(diǎn)突變的木聚糖酶突變體命名為XynB3，其氨基酸序列為SEQ ID NO:7，編碼核苷酸序列為SEQ ID N0:8。以上核苷酸序列由上海捷瑞生物公司合成。
[0037]用引物XynPF_F2、XynPF_R2對上述三個突變體進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物兩端引入EcoR1.Not I位點(diǎn)。PCR反應(yīng)條件為:94°C變性5min ;然后94°C變性30s，56°C復(fù)性30s，72°C延伸lmin，30個循環(huán)后，72°C保溫lOmin。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，XynBU XynB2、XynB3的基因片段大小均為570bp。
[0038]通過上述同樣的PCR方法擴(kuò)增得到野生型木聚糖酶XynPF的基因片段。
[0039]實(shí)施例3畢赤酵母工程菌株的構(gòu)建
[0040]將上述克隆得到的木聚糖酶突變體基因XynBl、XynB2和XynB3片段，通過EcoRI和Not I位點(diǎn)與表達(dá)載體pPIC9K相連接，構(gòu)建表達(dá)載體pPIC9K-XynBl、pPIC9K_XynB2、pPIC9K-XynB3