Nok突變體及其在腫瘤診斷、治療和藥物篩選中的用圖
【專利摘要】本發(fā)明提供了NOK突變體及其在腫瘤診斷、治療和藥物篩選中的用途。具體地，本發(fā)明提供一種分離的核酸、含有所述分離核酸的載體、所述載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系以及所述分類的核酸在腫瘤診斷、治療和藥物篩選平臺(tái)中的應(yīng)用。所述分離的核酸在一定程度上抑制細(xì)胞的增殖以及細(xì)胞錨定非依賴生長特性。
【專利說明】
NOK突變體及其在腫瘤診斷、治療和藥物篩選中的用途
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及癌基因的突變體及其在疾病診斷和治療中的用途，特別涉及Ν0Κ突變 體及其在腫瘤診斷、治療和藥物篩選中的用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 受體型酪氨酸激酶(RPTKs)是一類酶蛋白，它們調(diào)控著機(jī)體內(nèi)多種多樣的生物學(xué) 活動(dòng)，包括細(xì)胞的增殖、分化、細(xì)胞的周期調(diào)控、胚胎形成、血管生成和代謝等（1-3)。由于它 們?cè)诰S持正常細(xì)胞的生理活動(dòng)中有重要作用，因此它們的活性總是受到嚴(yán)格的調(diào)控。但是， 當(dāng)RPTKs的正?；钚员淮騺y后，機(jī)體會(huì)發(fā)生非常嚴(yán)重的功能紊亂，如疾病的發(fā)生，甚至癌癥 (4-8)。在經(jīng)典的受體型酪氨酸激酶活化的過程中，配體首先識(shí)別并結(jié)合受體特異性的胞外 結(jié)構(gòu)域，之后可促使受體同源或者異源二聚體的形成。在胞內(nèi)所形成的受體二聚體中，其中 的一個(gè)受體可以通過發(fā)揮其激酶的特性磷酸化與之結(jié)合的另一個(gè)受體，通過相互的磷酸化 最終導(dǎo)致受體復(fù)合物的活化。而二聚體中發(fā)生了磷酸化的位點(diǎn)則可以作為錨定位點(diǎn)，通過 這些錨定位點(diǎn)招募胞內(nèi)關(guān)鍵性的效應(yīng)蛋白或者接頭蛋白，這些效應(yīng)或者接頭蛋白一般都包 含有Src同源的（SH2)和磷酸化酪氨酸結(jié)合的結(jié)合域(PTB)，從而進(jìn)一步激活不同的下游信 號(hào)通路（10)。
[0003] Ν0Κ是最新被發(fā)現(xiàn)的受體型酪氨酸激酶，它可能是該家族中獨(dú)特的一員（11，12)。 前期的研究表明Ν0Κ是一個(gè)強(qiáng)致癌基因，具有導(dǎo)致腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移的特性（11，13)。通過對(duì) 人類癌癥基因組的系統(tǒng)性分析，發(fā)現(xiàn)V395I的突變與人腦星型膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的發(fā)生相關(guān)
[4] 。與Ν0Κ相比，STYK1僅僅只有一個(gè)氨基酸的差別，即由203位的脯氨酸替換為了亮氨酸 (14KSTYK1這個(gè)基因是學(xué)者Ye等在人的胚胎腦cDNA文庫中首次克隆得到。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] Ν0Κ基因是最新被鑒定的包含激酶結(jié)構(gòu)域的癌基因，它屬于受體型酪氨酸激酶家 族中非典型的一類受體蛋白，并具有潛在的致癌特性。Ν0Κ在多種腫瘤中其表達(dá)明顯上升， 比如肺癌，乳腺癌，結(jié)腸癌等等。盡管如此，目前很少有關(guān)于Ν0Κ突變與其癌癥發(fā)生的相關(guān)性 報(bào)道。
[0005] 在本研究中，我們制備了Ν0Κ的兩個(gè)定點(diǎn)突變子，分別為P203L和V395I，其核酸序 列分別如SEQ ID N0:1和SEQ ID勵(lì):2所示。勵(lì)1((?203〇也被稱為絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激 酶l(STYKl)，是Ν0Κ的另外一個(gè)別名。而V395I突變是在人腦星型膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn) 的。通過本文研究發(fā)現(xiàn)，這兩個(gè)突變子均沒有削弱Ν0Κ的激酶活性，但是其中的突變V395I抑 制了Ν0Κ的自身磷酸化。盡管在整體上這兩個(gè)突變對(duì)Ν0Κ介導(dǎo)的信號(hào)通路有抑制作用，但是 它們對(duì)ERK、Akt和STAT等信號(hào)分子的調(diào)控在不同細(xì)胞中如在HEK293T細(xì)胞中與在HeLa細(xì)胞 和BaF3穩(wěn)定細(xì)胞系中就存在差異。而且，這兩個(gè)突變都能夠顯著性地抑制細(xì)胞的增殖能力。 同時(shí)，這兩個(gè)突變可以充分抑制BaF3穩(wěn)定細(xì)胞系對(duì)IL-3的依賴性生長特性及錨定非依賴生 長特性。
[0006] 本發(fā)明一方面涉及分離的核酸，其中所述核酸是癌基因突變體，所述癌基因優(yōu)選 為Ν0Κ基因，所述突變體優(yōu)選為Ν0Κ基因的P203L或V395I突變體，其中P203L的點(diǎn)突變使nok 蛋白的氨基酸203位由P變成L，而V395I突變體點(diǎn)突變使nok蛋白的氨基酸395位由P變成L。 所述突變體的核酸序列如SEQ ID NO: 1或SEQ ID N0:2分別所示。
[0007] 本發(fā)明的另一方面涉及包含NOK基因突變體的載體，優(yōu)選為包含NOK基因突變體 P203L或V395I突變體載體，所述載體用于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染或穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系。
[0008] 本發(fā)明為了進(jìn)一步研究，構(gòu)建了 N0L、P203L和V395I的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染表達(dá)載體和穩(wěn)定轉(zhuǎn) 染表達(dá)載體，例如PCDNA3 · 0-N0K、pCDNA3 · 0-STYK1 和？00嫩3.0-￥3951400!1-01^-]\?：54卩1-CD511B-STYK1-HA和pCDH-CMV-MCS-EFl-CD511Β-Ν0Κ(V3951)-HA。
[0009] 本發(fā)明提供使用所述分離核酸轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系。所述細(xì)胞系為瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞系或穩(wěn) 定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系，優(yōu)選自人胚腎細(xì)胞系HEK293T、人宮頸癌細(xì)胞系HeLa、小鼠髓單核白血病細(xì) 胞系WEHI-3B、小鼠前B細(xì)胞系BaF3。
[0010] 本發(fā)明還提供使用所述分離核酸穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系，所述細(xì)胞系優(yōu)選為小鼠前B 細(xì)胞系BaF3。
[0011] 本發(fā)明的又一方面涉及上述細(xì)胞系在腫瘤的藥物篩選平臺(tái)中的應(yīng)用。
[0012] 本發(fā)明的還一方面涉及所述分離的核酸在制備用于治療腫瘤的藥物中的用途，所 述腫瘤選自Ν0Κ過表達(dá)的腫瘤，優(yōu)選自肺癌，乳腺癌，結(jié)腸癌、宮頸癌、腎細(xì)胞癌、白血病等， 更優(yōu)選自宮頸癌、腎細(xì)胞癌、髓單核白血病，更優(yōu)選自人宮頸癌細(xì)胞HeLa、小鼠前B細(xì)胞 BaF3〇
[0013] 根據(jù)本發(fā)明的研究，與Ν0Κ基因相比，P203L或V3951突變降低了Ν0Κ過表達(dá)細(xì)胞的 增殖性和非依賴性生長性。因此，具有P203L或V395I突變的腫瘤具有更好的預(yù)后。因此，本 發(fā)明提供分離的核酸的探針在制備用于腫瘤診斷和/或預(yù)后試劑盒中的用途，所述腫瘤選 自Ν0Κ過表達(dá)的腫瘤，優(yōu)選自肺癌，乳腺癌，結(jié)腸癌、宮頸癌、腎細(xì)胞癌、白血病等，更優(yōu)選自 宮頸癌、腎細(xì)胞癌、髓單核白血病。
[0014] 總而言之，我們的研究結(jié)果表明，Ν0Κ基因 P203和V395這兩個(gè)氨基酸殘基位點(diǎn)對(duì) Ν0Κ所介導(dǎo)的有絲分裂信號(hào)傳導(dǎo)起著非常重要的作用，并且這兩個(gè)位點(diǎn)的氨基酸替換可能 選擇性地影響著某些特定組織中促有絲分裂信號(hào)的傳遞。
【附圖說明】
[0015] 圖1.N0K基因結(jié)構(gòu)及體細(xì)胞突變。
[0016] 圖2A-圖2C.N0K及其突變體激酶活性檢測(cè)。圖2A是Ν0Κ及其突變體(STYK1及V395I) 的自主磷酸化活性檢測(cè)。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞48小時(shí)后，用抗HA抗體免疫沉淀。轉(zhuǎn)膜后用 抗酪氨酸磷酸化抗體(anti p-Tyr)雜交。圖上半部為裂解液檢測(cè)Ν0Κ及其突變體過表達(dá)情 況，圖下半部為Ν0Κ及其突變體的自主磷酸化檢測(cè)。圖2B和圖2C是Ν0Κ及其突變體的激酶活 性檢測(cè)。將等量N0K、STYK1及V395I質(zhì)粒DNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，48小時(shí)后收取細(xì)胞并用裂解 液裂解。取5微克裂解液與等量多肽底物進(jìn)行孵育，用試劑盒檢測(cè)Ν0Κ及其突變體的酪氨酸 激酶活性。
[0017] 圖3A-圖3D.在HEK293T和HeLa細(xì)胞中進(jìn)行Ν0Κ介導(dǎo)的增值信號(hào)通路檢測(cè)。在 冊(cè)1(2931'細(xì)胞（圖34和圖38)和他1^細(xì)胞（圖3(：和圖30)中分別過表達(dá)^)1(及其突變體并檢測(cè) 它們對(duì)RAS/MAPK，PI3K/Akt及STAT信號(hào)通路的影響。用NOK及其突變體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，48小 時(shí)后收取細(xì)胞并進(jìn)行細(xì)胞裂解。用ERK，磷酸化ERK(p-ERK)(Tyr204)，AKT，磷酸化AKT(p-AKT) (Thr 308)，STAT 1，磷酸化STAT 1 (p-STAT 1) (Tyr705)，STAT3，磷酸化STAT3 (p-STAT3) (Ser727)，STAT5，磷酸化STAT5 (p-STAT5) (Tyr694)抗體檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)。結(jié)果代表了三 次相似的獨(dú)立檢測(cè)結(jié)果。
[0018] 圖4A-圖4B.在BaF3細(xì)胞中進(jìn)行Ν0Κ介導(dǎo)的增值信號(hào)通路檢測(cè)。在BaF3過表達(dá)Ν0Κ及 其突變體并檢測(cè)它們對(duì)RAS/MAPK，PI3K/Akt及STAT信號(hào)通路的影響。用Ν0Κ及其突變體瞬時(shí) 轉(zhuǎn)染細(xì)胞，48小時(shí)后收取細(xì)胞并進(jìn)行細(xì)胞裂解。圖4A用ERK，磷酸化ERK(p-ERK)(Tyr204)， 八1(1'，磷酸化厶1(1'(口-厶10')(11^ 308)，5丁厶1'1，圖48使用磷酸化5丁厶1'1(口-5丁厶1!)(丁7『705)， STAT3，磷酸化STAT3 (p-STAT3) (Ser727)，STAT5，磷酸化STAT5 (p-STAT5) (Tyr694)抗體檢測(cè) 相關(guān)蛋白表達(dá)。結(jié)果代表了三次相似的獨(dú)立檢測(cè)結(jié)果。
[0019] 圖5A-圖5C.N0K及其突變體對(duì)細(xì)胞增殖的影響。在HEK293T細(xì)胞（圖5A)及HeLa細(xì)胞 (圖5B)中過表達(dá)Ν0Κ及其突變體。細(xì)胞計(jì)數(shù)后，以每孔~1 X 104細(xì)胞的密度鋪96孔板。轉(zhuǎn)染 48小時(shí)后進(jìn)行cck8檢測(cè)。將1 X 105細(xì)胞/孔Ν0Κ及其突變體的BaF3穩(wěn)定細(xì)胞系接種96孔板， 培養(yǎng)1、2、3天后用cck8方法檢測(cè)細(xì)胞增殖變化（圖5C)。圖示代表了三次相似的獨(dú)立檢測(cè)結(jié) 果。
[0020] 圖6A-圖6C.N0K及其突變體對(duì)錨定非依賴性生長的影響。Ν0Κ及其突變體(STYK1及 V395I)的BaF3穩(wěn)定細(xì)胞系在瓊脂糖培養(yǎng)基中的集落生成檢測(cè)。圖中顯示培養(yǎng)板（圖6A)、鏡 下（圖6B)及統(tǒng)計(jì)學(xué)（圖6C)檢測(cè)結(jié)果。圖示代表了三次相似的獨(dú)立檢測(cè)結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0021] 材料和方法
[0022] 1、質(zhì)粒構(gòu)建和定點(diǎn)突變
[0023] 攜帶HA標(biāo)簽的Ν0Κ基因（Genebank檢索號(hào)：KP729000)全長序列通過PCR經(jīng)Xbal和 Notl酶切位點(diǎn)構(gòu)建到了pCDH-CMV-MCS-EFl-CD511B載體中，同時(shí)通過Hindlll和Xbal酶切位 點(diǎn)構(gòu)建到了口00嫩3.0載體中，得到了質(zhì)粒口〇)!1-01^-]\?：54?1-005118-勵(lì)1(-說和口〇)祖3.0-Ν0Κ。利用Takara Mutant BEST Kit構(gòu)建了Ν0Κ的突變質(zhì)粒和相應(yīng)的載體pCDH-CMV-MCS-EF1-CD511B-STYK1-HA和pCDH-CMV-MCS-EFl-CD511B-N0K(V395I)-HA，以及載體pCDNA3.0-STYK1-HA和pCDNA3 · 0-N0K( V395 I )-HA。定點(diǎn)突變上游所用引物包括：5 ' -GGGGACCTGCTCAGCTTTCTC-3 ' 和5 ' -GTGTTACAAATACCAGAGTTGGTGG-3 '，下游引物包括：5 ' -CTGGGCCACATCCTCCAACAC-3 ' 和5 ' -AGCCTCGTCATCTGCAGTTTTA-3 ' WCR反應(yīng)條件為：94Γ 4min、94°C50s、55°C50s、72°C120s、循環(huán)數(shù)為30個(gè)循環(huán)。所有質(zhì)粒和載體的構(gòu)建均按照標(biāo)準(zhǔn) PCR和克隆方法，先通過亞克隆到PMD-18T-Simple載體，最后再克隆至目的載體。得到的所 有質(zhì)粒均通過雙酶切鑒定和測(cè)序鑒定，鑒定合格。
[0024] 2、細(xì)胞培養(yǎng)，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染及抗體
[0025] 人胚腎細(xì)胞系HEK293T，人宮頸癌細(xì)胞系HeLa，小鼠髓單核白血病細(xì)胞系WEHI-3B， 小鼠前B細(xì)胞BaF3均購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞中心。其中HEK293T細(xì)胞系和 HeLa細(xì)胞系培養(yǎng)于含有10 %胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，WEHI-3B細(xì)胞培養(yǎng)于含有10 %胎牛 血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，BaF3細(xì)胞培養(yǎng)于含有10 %胎牛血清和10 % IL-3的RPMI1640培養(yǎng) 基中。所有細(xì)胞于5 %C02，37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)HEK293T細(xì)胞或HeLa細(xì)胞匯合度達(dá)到 約80 %時(shí)，利用VigoFect轉(zhuǎn)染試劑按照標(biāo)準(zhǔn)操作步驟瞬時(shí)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒DNA。本實(shí)驗(yàn)所有用到的 抗體為：anti_HA( 1/5000，Proteintech)，anti_Erk和anti_p_Erk( 1/1000，Santa Cruz Biotechnology)，anti-Akt和anti-p-Akt(1/1000，Santa Cruz Biotechnology)，anti-STAT1和anti-p-STATl(1/1000，Bioworld Biotechnology)，anti-STAT 3和anti_p_STAT3 (1/1000，Santa Cruz Biotechnology)，anti_STAT5和anti_p_STAT5(1/1000，Bioworld Biotechno logy)和ant i-0_act in (1/1000，中杉金橋）。
[0026] 3穩(wěn)定細(xì)胞系構(gòu)建
[0027] 利用慢病毒包裝系統(tǒng)和VigoFect轉(zhuǎn)染試劑，將輔助質(zhì)粒pCMV-VSV-G、質(zhì)粒pMD2.G 和質(zhì)粒RSV-Rev及攜帶目的基因的骨架質(zhì)粒pCDH-CMV-MCS-EFl-CD511B瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HEK293T/N 細(xì)胞。轉(zhuǎn)然后48小時(shí)收獲包含有病毒顆粒的培養(yǎng)基，通過離心、過濾等方法純化病毒顆粒， 用無血清培養(yǎng)基重懸病毒顆粒制備的病毒感染液感染目的細(xì)胞BaF3,同時(shí)加入適量促感染 試劑Polybrene(終濃度約為8mg πιΓ1)。感染約12小時(shí)后，更換培養(yǎng)基為新鮮的完全培養(yǎng)基。 穩(wěn)定細(xì)胞系感染效率通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析(GFP表達(dá)情況），陽性克隆子通過RT-PCR和 Western Blot進(jìn)行鑒定，通過有限稀釋法獲取單克隆。
[0028] 4、蛋白質(zhì)印跡
[0029] 收獲轉(zhuǎn)染好的細(xì)胞或者穩(wěn)定細(xì)胞系，用預(yù)冷的lxPBS洗滌細(xì)胞兩次，棄去洗液后用 含有20mM Tris-HCl(pH7.4)，150mM NaCl，lmM EDTA，l%Triton-X100，lmM Na3V〇4,2.5mM sodium pyrophosphate ,ImMP-glycerolphosphate,ImM phenylmethylsulfonyl fluoride,5μg/ml
[0030] aprotinin,和5ygml leupeptin(pH7·5)的反應(yīng)液于冰上裂解細(xì)胞30分鐘。裂解后 于4°C高速離心后取上清裂解液，定量測(cè)定裂解液中的蛋白濃度。用相同蛋白總量的細(xì)胞裂 解液進(jìn)行10 % SDS-PAGE膠電泳。電泳結(jié)束后，于300mA恒流條件下將SDS-PAGE膠中蛋白轉(zhuǎn)印 到硝酸纖維膜上，轉(zhuǎn)膜約2.5小時(shí)。用5%脫脂牛奶溶液于室溫封閉蛋白膜1小時(shí)，之后于相 應(yīng)一抗溶液中4°C孵育過夜。第二天，用辣根過氧化物酶耦聯(lián)的相應(yīng)二抗進(jìn)行雜交，室溫孵 育1小時(shí)。最后于暗室中顯影檢測(cè)蛋白表達(dá)情況。
[0031 ] 5、細(xì)胞增值實(shí)驗(yàn)和錨定非依賴生長實(shí)驗(yàn)
[0032] 針對(duì)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，取約1 X 104個(gè)轉(zhuǎn)染后的HEK293T細(xì)胞和HeLa細(xì)胞種植于96孔 板中的一個(gè)孔中，每組至少設(shè)置4個(gè)平行孔。于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一段時(shí)間后，于每孔中加 入相應(yīng)試劑，根據(jù)最后培養(yǎng)基顏色的變化確定細(xì)胞的增殖，增殖實(shí)驗(yàn)按照cell counting kit-8試劑盒標(biāo)準(zhǔn)說明操作。針對(duì)錨定非依賴生長實(shí)驗(yàn)，首先制備2ml含有0.7 %瓊脂的 RPMI1640完全培養(yǎng)基，將此培養(yǎng)基倒入細(xì)胞培養(yǎng)皿中，待其冷卻后作為底層膠。再準(zhǔn)備約1 X104個(gè)各穩(wěn)定細(xì)胞系，分別與2ml含有0.4%瓊脂糖的RPMI1640完全培養(yǎng)基混合均勻，將混 勻后的細(xì)胞懸液倒入底層膠，待細(xì)胞懸液凝固，往凝固好的上層膠上加入lml RPMI1640完 全培養(yǎng)基，并置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約兩周。兩周后觀察各皿中集落形成情況，選取其中直 徑大于〇. 2mm的集落作為陽性集落，并拍照、計(jì)數(shù)。
[0033] 6、免疫沉淀
[0034]利用VigoFect轉(zhuǎn)染試劑將各質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，收獲轉(zhuǎn)染 后的細(xì)胞并應(yīng)預(yù)冷的lxTOS洗滌細(xì)胞兩遍。棄去洗液后用加入了磷酸酶抑制劑的細(xì)胞裂解 液（50mM Tris，at pH7.4.，150mM NaCl，10%glycerol，lmM EDTA，l%Triton X-100)于冰 上裂解細(xì)胞半小時(shí)。離心后收獲上清蛋白溶液，并加入適量anti-HA beads，4°C孵育過夜。 過夜孵育后的蛋白液于8000Xg離心30s后，棄上清。再用Wash Buffer洗滌珠子5遍，每次10 分鐘。最后棄去洗液并加入SDS-PAGE loading buffer。樣品煮沸10分鐘后，進(jìn)行SDS-PAGE 電泳。電泳后的蛋白通過電轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜上。剪取所需位置的膜塊，用5%脫脂牛奶室溫 封閉1小時(shí)，再用相應(yīng)的一抗4°C雜交孵育過夜，第二天用辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗孵育 膜塊，最后于暗室顯影。
[0035] 7、自身磷酸化分析
[0036]用VigoFect 轉(zhuǎn)染試劑分別將質(zhì)粒 pCDNA3.0、pCDNA3.0-N0K、pCDNA3.0-STYKl和 PCDNA3.0-V395I瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，收獲各細(xì)胞，并用預(yù)冷的1 X roS洗 滌細(xì)胞兩遍。于4000rpm離心5分鐘后獲取細(xì)胞。加入適量的添加了磷酸酶抑制劑的RIPA buffer于冰上裂解細(xì)胞半小時(shí)。低溫高速離心后，獲取裂解上清液。在裂解上清中加入 anti-HA beads并于4°C孵育過夜，使目的蛋白與珠子充分結(jié)合。第二天，8200Xg離心30s收 獲珠子，并用wash buffer冼滌珠子5次，每次10分鐘。棄去洗液后得到結(jié)合了目的蛋白的珠 子。對(duì)結(jié)合了目的蛋白的珠子進(jìn)行SDS-PAGE電泳和western blot分析，一抗使用anti-p-Tyr抗體，最后通過顯影檢測(cè)Ν0Κ及突變組中的Ν0Κ蛋白的磷酸化水平。
[0037] 8、體外酪氨酸激酶活性測(cè)試
[0038]用VigoFect 轉(zhuǎn)染試劑分別將質(zhì)粒 pCDNA3.0、pCDNA3.0-N0K、pCDNA3.0-STYKl和 PCDNA3.0-V395I瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，收獲各細(xì)胞，并用預(yù)冷的1 X roS洗 滌細(xì)胞兩遍。于4000rpm離心5分鐘后獲取細(xì)胞。加入適量的添加了磷酸酶抑制劑的RIPA buffer于冰上裂解細(xì)胞半小時(shí)。低溫高速離心后，獲取裂解上清液。采用BCA發(fā)定量測(cè)定總 蛋白量。吸取5yg總蛋白樣進(jìn)行酪氨酸激酶活性測(cè)試。簡(jiǎn)而言之，將5yg總蛋白樣與底物肽一 起加入至包含有50μ1 激酶反應(yīng)緩沖液(100mM Tris-HCl，pH7.4,50mM MgCl2,5mM MnCl2,5mM dithiothreitol，lmM ATP,50mM sodium orthovanadate)的條形小孔中于室溫孵育30分 鐘，其中底物肽可以與條形小孔中的鏈霉親和素結(jié)合。孵育結(jié)束后，用1XTBS/T洗滌條形小 孔5次，之后于每個(gè)小孔中加入 100μ1 anti-phosphotyrosine recombinant 4G10TM，室溫 反應(yīng)20-30分鐘。棄去反應(yīng)液后用1 XTBS/T洗滌條形小孔5次。之后加入75μ1 TMB底物混合 液，室溫反應(yīng)最多15分鐘。待對(duì)照組中出現(xiàn)淡藍(lán)色時(shí)，即可于每孔中加入適量2M的硫酸溶液 終止反應(yīng)。于分光光度計(jì)上測(cè)定450nm波長下的吸光值，并記錄讀數(shù)。
[0039] 實(shí)施例1:構(gòu)建含有不同位點(diǎn)突變的突變子STYK1和V395I
[0040]利用生物信息學(xué)手段，通過與其它受體型酪氨酸激酶成員如FGFR和PDGFR進(jìn)行序 列比對(duì)，我們已經(jīng)找Ν0Κ諸多保守的絲/蘇/酪氨基酸殘基位點(diǎn)和結(jié)構(gòu)域，如VAIL，HRD和DFG 結(jié)構(gòu)域。而在本研究中，我們構(gòu)建了另外的兩種不同突變。分別是Ν0Κ基因 P203L的突變即 STYK1，和V395I的突變。STYK1首次克隆和鑒定于人的胚胎cDNA文庫中，V395I的突變則發(fā)現(xiàn) 于人的多形性膠質(zhì)瘤樣本中，而Ν0Κ是從患有甲狀腺瘤病人的扁桃體樣本中克隆和鑒定得 到的。和Ν0Κ相比，STYK1的突變位點(diǎn)203位位于胞內(nèi)ICD的sub-domainl中，V395I則位于C末 端(圖1)。
[0041 ]實(shí)施例2:自身磷酸化檢測(cè)
[0042]實(shí)驗(yàn)室前期實(shí)驗(yàn)表明Y417F的突變不僅能顯著性促進(jìn)Ν0Κ介導(dǎo)的有絲分裂信號(hào)通 路，還能導(dǎo)致NOK通過增強(qiáng)自身磷酸化而活化。鑒于此研究結(jié)果，我們檢測(cè)了STYK1和V395I 是否對(duì)自身磷酸化水平有影響。利用HEK293T細(xì)胞，通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后IP檢測(cè)p-Tyr的表達(dá)水 平發(fā)現(xiàn)，在44kD附近N0K組和STYK1組的表達(dá)水平相當(dāng)，但是均高于V3951組的水平。從條帶 上分析N0K和STYK1中p-Tyr的水平比V395I組高出約3倍（圖2A)。除此之外，在75kD附近和 120kD附近也有新條帶的出現(xiàn)。這些條帶可能是N0K的高級(jí)結(jié)構(gòu)如多聚體，可能是與N0K相互 作用的相關(guān)蛋白。針對(duì)這兩個(gè)位置的條帶中P-Tyr的水平發(fā)現(xiàn)，N0K組均要顯著高于STYK1和 乂3951組的水平，其中在751^)附近勵(lì)1(組約為￥3951組的5倍，3了￥1(1組約為￥3951組的2.5倍。 尤其在120kD附近，N0K組p-Tyr信號(hào)顯著增強(qiáng)，而STYK1和V395I組信號(hào)極弱。這可能說明突 變影響到了 N0K與其他未知蛋白之間的相互作用或者自身的磷酸化水平。當(dāng)然，這些結(jié)果和 蛋白需要更進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行發(fā)掘，鑒定和證實(shí)。
[0043]實(shí)施例3:激酶活性測(cè)試
[0044]既然在突變子中自身磷酸化水平發(fā)生了改變，那么突變會(huì)不會(huì)也影響到激酶活 性?所以我們研究了突變對(duì)激酶活性的影響。同樣利用HEK293T細(xì)胞和體外激酶活性測(cè)試系 統(tǒng)，我們發(fā)現(xiàn)Ν0Κ和突變子都保留了自身激酶的活性。而且通過對(duì)三者激酶活性進(jìn)行比較分 析后發(fā)現(xiàn)STYK1和V395I相對(duì)于Ν0Κ的突變并未對(duì)激酶活性產(chǎn)生較大的影響（圖2B)，和Ν0Κ組 相比較，STYK1和V395I對(duì)激酶活性的改變?cè)?%和2%之內(nèi)。這就說明突變沒有從根本上對(duì) Ν0Κ的激酶活性產(chǎn)生正面或者負(fù)面的影響。
[0045] 實(shí)施例4:突變對(duì)P13K/AKT，RAS/MAPK以及JAK/STAT信號(hào)通路的影響 [0046]考慮到受體型酪氨酸激酶可以通過自身磷酸化而活化，在此過程中其自身p-Tyr 的水平會(huì)顯著升高，因此我們推測(cè)這樣的改變會(huì)可能會(huì)影響到信號(hào)通路的傳遞。因?yàn)棣?Κ與 FGFRs存在相類似交叉的信號(hào)通路如RAS/MAPK和PI3K/AKT信號(hào)通路，于是我們檢測(cè)了突變 與Ν0Κ對(duì)在這兩條經(jīng)典信號(hào)通路的影響。我們發(fā)現(xiàn)在HEK293T細(xì)胞中，Ν0Κ能顯著性地提高p-ERK和ρ-ΑΚΤ的表達(dá)水平，但是STYK1不能激活這些重要信號(hào)分子的磷酸化，V395I雖然能在 一定程度上激活P-ERK和ρ-ΑΚΤ的水平，但是相對(duì)于Ν0Κ而言這種能力明顯削弱（圖3A)。我 們也檢測(cè)了 JAK-STAT信號(hào)通路，發(fā)現(xiàn)突變STYK1和V395I都沒有對(duì)該信號(hào)通路產(chǎn)生明顯影 響，各信號(hào)分子如p-STATl，p-STAT3和P-STAT5都基本維持在相對(duì)穩(wěn)定的水平（圖3A)。同樣， 我們利用HeLa細(xì)胞進(jìn)行了類似的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)STYK1和V395I均能在一定程度上負(fù)性調(diào)節(jié)ERK 和AKT的磷酸化水平，這和HEK293T是一致的。但是針對(duì)JAK-STAT信號(hào)通路而言，我們發(fā)現(xiàn)在 HeLa細(xì)胞中，STYK1和V395I能顯著性抑制P-STAT3的表達(dá)，這與HEK293T細(xì)胞中的情況不一 樣，可能因?yàn)椴煌?xì)胞系而導(dǎo)致的結(jié)果（圖3B)。
[0047]為了進(jìn)一步驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們利用BaF3穩(wěn)定細(xì)胞系進(jìn)行了同樣的研究。在穩(wěn)定 細(xì)胞系中，因突變帶來的影響比瞬時(shí)轉(zhuǎn)染要更加明顯。在STYK1和V395I中，P-ERK、P-STAT1、 P-STAT3和p-STAT5的水平和Ν0Κ相比收到了顯著抑制（圖4)。比如p-STAT5，在Ν0Κ組中過表 達(dá)，但是在STYK1和V395I中，其表達(dá)水平幾乎接近于對(duì)照組；雖然ρ-ΑΚΤ的表達(dá)水平在各組 中的變化不是很明顯，但是P-ERK的表達(dá)在STYK1和V395I中和Ν0Κ組相比都收到了強(qiáng)烈的抑 制，表達(dá)量幾乎下降到了和對(duì)照組接近的水平。以上的實(shí)驗(yàn)結(jié)果更進(jìn)一步驗(yàn)證和證實(shí)了 Ν0Κ 能顯著性地激活有絲分裂信號(hào)通路，而STYK1和V395I能在一定程度上抑制Ν0Κ所介導(dǎo)的 P13K/AKT、RAS/MAPK、和JAK/STAT信號(hào)通路中信號(hào)的傳導(dǎo)。
[0048] 實(shí)施例5:STYK1和V395I能阻斷依賴于IL-3的細(xì)胞生長
[0049] 既然STYK1和V395I能對(duì)信號(hào)通路產(chǎn)生如此明顯的影響，這些變化是否會(huì)因此改變 細(xì)胞的增殖能力?實(shí)驗(yàn)室前期利用穩(wěn)定細(xì)胞系已證實(shí)，當(dāng)細(xì)胞過表達(dá)Ν0Κ時(shí)其增殖能力會(huì)顯 著提升。利用CCK8實(shí)驗(yàn)方法我們首先檢測(cè)了 STYK1和V395I對(duì)HEK293T細(xì)胞增殖能力的影響。 在轉(zhuǎn)染48小時(shí)后發(fā)現(xiàn)CCK8實(shí)驗(yàn)結(jié)果所反映的細(xì)胞增殖能力與信號(hào)通路中對(duì)PI3K/AKT和 MAPK/ERK通路的活化情況相一致，即STYK1和V395I都在一定程度上抑制細(xì)胞的增殖（圖 5A)。同樣為了進(jìn)一步證實(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，利用HeLa細(xì)胞和穩(wěn)定細(xì)胞系和CCK8系統(tǒng)做了同樣的檢 測(cè)，得到了同樣的結(jié)論（圖5B)。尤其在穩(wěn)定細(xì)胞系中，在48小時(shí)之前Ν0Κ組與STYK1和V395I 組之間并不存在明顯差異，但是在48小時(shí)后，Ν0Κ組細(xì)胞依然能持續(xù)增殖生長，而STYK1和 V3951組中的細(xì)胞和對(duì)照組一樣出現(xiàn)明顯的凋亡，細(xì)胞數(shù)量劇減。其中STYK1組的細(xì)胞略高 于對(duì)照組和V395I組，而V395I組和對(duì)照組則處于相似水平（圖5C)。這些實(shí)驗(yàn)說明突變STYK1 和V395I能抑制Ν0Κ依賴于IL-3的細(xì)胞增殖能力。這也從側(cè)面證實(shí)了該突變對(duì)Ν0Κ所介導(dǎo)的 信號(hào)通路的負(fù)性調(diào)控。
[0050] 實(shí)施例6: STYK1和V395I削弱了 Ν0Κ促進(jìn)的錨定非依賴生長能力
[0051] 為了進(jìn)一步從功能上驗(yàn)證以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們研究了突變對(duì)穩(wěn)定細(xì)胞系的克隆形 成能力。各穩(wěn)定細(xì)胞系饑餓數(shù)小時(shí)后進(jìn)行軟瓊脂實(shí)驗(yàn)，在培養(yǎng)箱培育15天左右后對(duì)形成的 克隆集落進(jìn)行分析計(jì)數(shù)。大于0.2微米的細(xì)胞集落被劃分為陽性克隆。我們發(fā)現(xiàn)Ν0Κ組中細(xì) 胞集落形成數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他三組。其中V395I組中細(xì)胞的集落約為Ν0Κ組的24%，而STYK1 組中的集落和對(duì)照組相當(dāng)，約為Ν0Κ組的6.7 %。這說明V3951和STYK1均抑制了Ν0Κ所介導(dǎo)的 細(xì)胞錨定非依賴生長特性(圖6)。
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【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種分離的核酸，其中所述核酸是癌基因突變體，所述癌基因優(yōu)選為NOK基因，所述 突變體優(yōu)選為N0K基因的P203L或V395I突變體，所述突變體的核酸序列優(yōu)選如SEQ ID N0:1 或SEQ ID NO :2分別所示。2. -種含有根據(jù)權(quán)利要求1所述分離的核酸的載體。3. -種使用根據(jù)權(quán)利要求1所述分離的核酸所轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系，所述細(xì)胞系為瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 細(xì)胞系或穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系，優(yōu)選自人胚腎細(xì)胞系HEK293T、人宮頸癌細(xì)胞系HeLa、小鼠前B細(xì) 胞系BaF3。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的細(xì)胞系，其優(yōu)選為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系，更優(yōu)選為小鼠前B細(xì)胞 系BaF3。5. 根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的細(xì)胞系在腫瘤的藥物篩選平臺(tái)中的用途。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述分離的核酸在制備用于治療腫瘤的藥物中的用途，所述腫瘤選 自N0K過表達(dá)的腫瘤，優(yōu)選自B淋巴瘤、肺癌，乳腺癌，結(jié)腸癌、宮頸癌、腎細(xì)胞癌、白血病等， 更優(yōu)選自B淋巴瘤、宮頸癌、腎細(xì)胞癌。7. 檢測(cè)根據(jù)權(quán)利要求1所述分離的核酸的探針在制備用于腫瘤診斷和/或預(yù)后試劑盒 中的用途，所述腫瘤選自N0K過表達(dá)的腫瘤，優(yōu)選自B淋巴瘤、肺癌，乳腺癌，結(jié)腸癌、宮頸癌、 腎細(xì)胞癌、白血病等，更優(yōu)選自B淋巴瘤、宮頸癌、腎細(xì)胞癌。
【文檔編號(hào)】C12Q1/02GK106065402SQ201610244757
【公開日】2016年11月2日
【申請(qǐng)日】2016年4月19日 公開號(hào)201610244757.4, CN 106065402 A, CN 106065402A, CN 201610244757, CN-A-106065402, CN106065402 A, CN106065402A, CN201610244757, CN201610244757.4
【發(fā)明人】劉力, 侯晟琦
【申請(qǐng)人】中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所