一種鏈霉菌正向突變株篩選方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及微生物菌株篩選領(lǐng)域，特別涉及一種鏈霉菌正向突變株篩選方法，包括以下步驟：菌株誘變；原始以及誘變的菌株分別接種于再生平板上，并培養(yǎng)至生長(zhǎng)成熟；分別制備成濃度為106-107個(gè)/ml的孢子懸液；取出相同體積的孢子懸液，且取出的體積小于孢子懸液的總體積；將取出的孢子懸液分別接種于篩選平板不同板孔的培養(yǎng)基上且使其均勻分布于培養(yǎng)基上，培養(yǎng)至生長(zhǎng)成熟；從每個(gè)板孔中均取出相同體積的培養(yǎng)基塊，分別進(jìn)行浸提并測(cè)定抗生素含量；將誘變菌株和原始菌株的抗生素含量對(duì)比，挑選出正向突變菌株。本發(fā)明提供的鏈霉菌正向突變株篩選方法，可以避免因接種量的巨大差異而導(dǎo)致篩選出的菌株出現(xiàn)假陽(yáng)性，從而避免篩選準(zhǔn)確性低的問(wèn)題。
【專利說(shuō)明】一種鏈霉菌正向突變株篩選方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及微生物菌株篩選領(lǐng)域，具體而言，涉及一種鏈霉菌正向突變株篩選方法。
【背景技術(shù)】
[0002]現(xiàn)有抗生素大部分由鏈霉菌產(chǎn)生。為提高抗生素生產(chǎn)菌株的產(chǎn)量，往往需要對(duì)生產(chǎn)菌株進(jìn)行誘變，提高該菌株的抗生素產(chǎn)量。但是，從大量突變株中準(zhǔn)確挑選出正向突變的高產(chǎn)菌株存在較大困難。
[0003]目前，高產(chǎn)菌株的篩選方法主要是用滅菌后的牙簽或接種環(huán)從再生平板上挑取單菌落孢子，之后將孢子直接接種于裝有固體培養(yǎng)基的96孔板上。由于孢子接種量存在巨大差異，生長(zhǎng)在96孔板每個(gè)板孔中培養(yǎng)基上的菌數(shù)不同，之后取整個(gè)板孔中的培養(yǎng)基進(jìn)行浸提，測(cè)定生產(chǎn)的抗生素含量會(huì)有很大差異。因此，采用牙簽或接種環(huán)挑取再生菌落孢子直接接種，很難實(shí)現(xiàn)接種量一致，篩選的菌株容易出現(xiàn)假陽(yáng)性。因此，上述篩選方法存在準(zhǔn)確度低的問(wèn)題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種鏈霉菌正向突變株篩選方法，以解決上述的問(wèn)題。
[0005]在本發(fā)明的實(shí)施例中提供的一種鏈霉菌正向突變株篩選方法，包括以下步驟: [0006]對(duì)一部分原始菌株 進(jìn) 行誘變；
[0007]將原始菌株以及誘變的菌株分別接種于再生平板上，并培養(yǎng)至生長(zhǎng)成熟；
[0008]分別取生長(zhǎng)成熟的原始菌株孢子以及多個(gè)生長(zhǎng)成熟的誘變菌株孢子，并分別制備成濃度為IO6-1O7個(gè)/ml的孢子懸液；
[0009]由每個(gè)孢子懸液中取出相同體積的孢子懸液，且取出的體積小于孢子懸液的總體積；
[0010]將取出的孢子懸液分別接種于篩選平板不同板孔的培養(yǎng)基上且使孢子懸液均勻分布于培養(yǎng)基上，培養(yǎng)至生長(zhǎng)成熟；
[0011]從篩選平板的每個(gè)板孔中均取出相同體積的培養(yǎng)基塊，分別進(jìn)行浸提并測(cè)定抗生
素含量；
[0012]將誘變菌株的抗生素含量和原始菌株的抗生素含量對(duì)比，挑選出產(chǎn)抗生素能力高于原始菌株的正向突變菌株。
[0013]本發(fā)明提供的鏈霉菌正向突變株篩選方法中，將所取的孢子制成孢子懸液且孢子懸液中孢子的濃度為IO6-1O7個(gè)/ml，限定了不同菌株制備的孢子懸液的濃度差異。懸液中孢子的濃度是相對(duì)均一的，由每個(gè)孢子懸液中取出的孢子懸液是相同體積，且取出的體積小于孢子懸液的總體積，因此，用于接種的孢子數(shù)量小于總孢子數(shù)量，這樣對(duì)于每個(gè)菌株來(lái)說(shuō)，接種的孢子數(shù)量之間的差異減小，這樣就可以避免因接種量的巨大差異而導(dǎo)致篩選出的菌株出現(xiàn)假陽(yáng)性，從而避免篩選準(zhǔn)確性低的問(wèn)題?！緦＠綀D】

【附圖說(shuō)明】
[0014]圖1示出了采用液態(tài)培養(yǎng)基灌裝時(shí)不同溫度下各板孔中培養(yǎng)基重量的差異圖；
[0015]圖2示出了采用培養(yǎng)基塊灌裝時(shí)各板孔中培養(yǎng)基重量的差異圖；
[0016]圖3示出了超聲波震蕩提取效率圖 。
【具體實(shí)施方式】
[0017]下面通過(guò)具體的實(shí)施例子并結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)描述。
[0018]實(shí)施例1:
[0019]在本發(fā)明的實(shí)施例中提供的一種鏈霉菌正向突變株篩選方法，包括以下步驟:
[0020]對(duì)一部分原始菌株進(jìn)行誘變；
[0021]將原始菌株以及誘變的菌株分別接種于再生平板上，并培養(yǎng)至生長(zhǎng)成熟；
[0022]分別取生長(zhǎng)成熟的原始菌株孢子以及多個(gè)生長(zhǎng)成熟的誘變菌株孢子，并分別制備成濃度為IO6-1O7個(gè)/ml的孢子懸液；
[0023]由每個(gè)所述孢子懸液中取出相同體積的孢子懸液，且取出的體積小于孢子懸液的總體積；
[0024]將取出的孢子懸液分別接種于篩選平板不同板孔的培養(yǎng)基上且使孢子懸液均勻分布于所述培養(yǎng)基上，培養(yǎng)至生長(zhǎng)成熟；
[0025]從篩選平板的每個(gè)板孔中均取出相同體積的培養(yǎng)基塊，分別進(jìn)行浸提并測(cè)定抗生
素含量；
[0026]將誘變菌株的抗生素含量和原始菌株的抗生素含量對(duì)比，挑選出產(chǎn)抗生素能力高于原始菌株的正向突變菌株。
[0027]采用滅菌的牙簽或接種環(huán)從再生平板上挑取單菌落孢子，直接進(jìn)行接種篩選，由于孢子接種量存在巨大差異，生長(zhǎng)在96孔板每個(gè)板孔中培養(yǎng)基上的菌數(shù)不同，之后取整個(gè)板孔中的培養(yǎng)基進(jìn)行浸提，測(cè)定生產(chǎn)的抗生素含量會(huì)有很大差異。因此，這樣挑選出的正向突變株是不可信的。本實(shí)施例提供的鏈霉菌正向突變株篩選方法中，將所取的孢子制成孢子懸液且孢子懸液中孢子的濃度為IO6-1O7個(gè)/ml，限定了不同菌株制備的孢子懸液的濃度差異。懸液中孢子的濃度是相對(duì)均一的，由每個(gè)孢子懸液中取出的孢子懸液是相同體積，且取出的體積小于孢子懸液的總體積，因此，用于接種的孢子數(shù)量小于總孢子數(shù)量，這樣對(duì)于每個(gè)菌株來(lái)說(shuō)，接種的孢子數(shù)量之間的差異減小，這樣就可以避免因接種量的巨大差異而導(dǎo)致篩選出的菌株出現(xiàn)假陽(yáng)性，從而避免篩選準(zhǔn)確性低的問(wèn)題。
[0028]實(shí)施例2:
[0029]基于實(shí)施例1，本實(shí)施例做了進(jìn)一步的改進(jìn):
[0030]針對(duì)實(shí)施例1中制備孢子懸液的步驟，可以由下列步驟制得:
[0031]用接種環(huán)分別挑取相同環(huán)數(shù)的生長(zhǎng)成熟的原始菌株的孢子以及多個(gè)生長(zhǎng)成熟的誘變菌株的孢子；
[0032]將挑取的孢子分別加入至不同的含有無(wú)菌水和玻璃珠的無(wú)菌菌種保藏管中；
[0033]將所有菌種保藏管加蓋后置于渦旋混勻器上震蕩，使孢子鏈斷裂，制得孢子懸液。
[0034]經(jīng)計(jì)數(shù)得知，采用10 μ I規(guī)格的接種環(huán)每取I環(huán)生長(zhǎng)成熟的孢子加入到1.0ml無(wú)菌水中，孢子個(gè)數(shù)均為IO6-1O7個(gè)，即孢子的濃度為IO6-1O7個(gè)/ml。相應(yīng)的，接種環(huán)的規(guī)格可變，如常用的5μ I規(guī)格；相應(yīng)的，接種的環(huán)數(shù)也是可變的，所挑取的環(huán)數(shù)與環(huán)的規(guī)格以及每個(gè)菌株的孢子量有關(guān)。渦旋混勻器上的保藏管中的玻璃珠隨水流旋轉(zhuǎn)震蕩起來(lái)有助于打碎孢子鏈，因此，相應(yīng)的，保藏管的規(guī)格是可變的，只要與所取液體體積相應(yīng)即可；相應(yīng)的，玻璃珠的規(guī)格和數(shù)量可變，以打碎孢子鏈為準(zhǔn)。優(yōu)選地，采用10 μ I規(guī)格的接種環(huán)挑取生長(zhǎng)成熟的孢子1-2環(huán)至含有1.0ml無(wú)菌水和2-3粒直徑為3mm玻璃珠的2ml塑料菌種保藏管中，渦旋混勻器上震蕩2min后制得孢子懸液。此外，孢子生長(zhǎng)成熟是指生長(zhǎng)有菌株的培養(yǎng)基表面出現(xiàn)均勻白色或灰白色。
[0035]為了提高篩選效率，同時(shí)保證每個(gè)板孔中的菌株在測(cè)定完抗生素含量后仍留有部分孢子用于傳種，優(yōu)選地，板孔的直徑為6-20mm,深度為6_20mm。
[0036]24孔篩選平板為實(shí)驗(yàn)室常用的24孔培養(yǎng)板，規(guī)格為:板長(zhǎng)X板寬=128 X 86mm，孔直徑16mm,孔深度16mm,且每個(gè)孔是相同的規(guī)格；培養(yǎng)菌落的培養(yǎng)板，以培養(yǎng)板中含有1/3-1/2體積的固體培養(yǎng)基為宜。經(jīng)試驗(yàn)表明，24孔篩選平板的每個(gè)板孔中含有1.0-1.5ml培養(yǎng)基較為合適:加入太少，放置較長(zhǎng)時(shí)間后固體培養(yǎng)基容易出現(xiàn)干裂現(xiàn)象；加入太多則導(dǎo)致板孔上方空間太小，不利于板孔內(nèi)儲(chǔ)存一定量空氣，供菌株生長(zhǎng)過(guò)程中的呼吸作用。因此，優(yōu)選地，所述板孔的直徑為16mm,深度為16mm,且每個(gè)板孔中含有1.0-1.5ml培養(yǎng)基。
[0037]目前，培養(yǎng)基的制備一般是將加熱融化的液態(tài)培養(yǎng)基直接加入培養(yǎng)容器中制得，但是，對(duì)于本實(shí)施例來(lái)說(shuō)，需要向多個(gè)板孔中灌裝培養(yǎng)基，在向板孔中灌裝相同體積的液態(tài)培養(yǎng)基過(guò)程中，液態(tài)培養(yǎng)基溫度不斷下降，由于加熱融化的液態(tài)培養(yǎng)基密度受溫度影響較大，因此，導(dǎo)致加入板孔中培養(yǎng)基的重量波動(dòng)較大。以24孔篩選平板為例，采用液態(tài)培養(yǎng)基灌裝，測(cè)定了不同溫度下各板孔中培養(yǎng)基重量的差異，據(jù)此，以橫坐標(biāo)為板孔數(shù)，縱坐標(biāo)為每個(gè)板孔中培養(yǎng)基的重量得到圖1。如圖1所示，當(dāng)在85°C灌裝時(shí)，各板孔中培養(yǎng)基塊重量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差可達(dá)15.02%，極差值(最大值與最小值差)可達(dá)823mg ;當(dāng)在50°C灌裝時(shí)，各板孔中培養(yǎng)基塊重量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差可達(dá)7.91%，極差值可達(dá)554.9mg。為此，對(duì)培養(yǎng)基灌裝方法進(jìn)行了改進(jìn)，具體地，灌裝過(guò)程如下:向9cm培養(yǎng)皿中加入50-60ml經(jīng)加熱融化的液態(tài)培養(yǎng)基，待液態(tài)培養(yǎng)基凝固后，用直徑15mm打孔器從培養(yǎng)皿中打取培養(yǎng)基塊，將其轉(zhuǎn)入
24孔板的板孔中，每個(gè)板孔中加入一塊培養(yǎng)基塊；加蓋后加熱使板孔中培養(yǎng)基塊融化，待板孔中液態(tài)培養(yǎng)基冷卻凝固后備用。之后將上述每個(gè)板孔中的培養(yǎng)基測(cè)量重量，以橫坐標(biāo)為板孔數(shù)，縱坐標(biāo)為每個(gè)板孔中培養(yǎng)基的重量得到圖2。如圖2所示，各板孔中培養(yǎng)基重量標(biāo)準(zhǔn)偏差控制在2.5%范圍內(nèi)，有效降低了板孔間培養(yǎng)基的重量差異。采用固體瓊脂塊灌膠法代替?zhèn)鹘y(tǒng)液態(tài)灌膠法，保證了各板孔中培養(yǎng)基實(shí)際含量高度一致，提高了篩選模型的精密度和準(zhǔn)確度。優(yōu)選地，板孔的培養(yǎng)基的制備方法包括下列步驟:從同一塊固體培養(yǎng)基上取相同體積的培養(yǎng)基，分別放入每個(gè)板孔中；將板孔加蓋進(jìn)行加熱使其融化后冷卻凝固。
[0038]所取孢子懸液體積是根據(jù)培養(yǎng)板孔的大小及固體培養(yǎng)基表面的干濕程度而定。取太多懸液會(huì)造成板孔中出現(xiàn)積水，造成缺氧狀態(tài)，不利于孢子萌發(fā)生長(zhǎng)；取太少懸液會(huì)由于液體太少，孢子懸液無(wú)法均勻分布于板孔中培養(yǎng)基表面。經(jīng)試驗(yàn)表明，取孢子懸液20-50 μ I至24孔篩選平板的每個(gè)板孔中為宜，輕輕晃動(dòng)24孔篩選平板，使孢子懸液均勻分布于板孔中培養(yǎng)基的表面上。
[0039]將誘變的菌株以及原始菌株分別接種于再生平板上，并培養(yǎng)至生長(zhǎng)成熟的步驟中，接種后至生長(zhǎng)成熟需要7天，此外，測(cè)定的菌株培養(yǎng)至生長(zhǎng)成熟和測(cè)定抗生素的過(guò)程也需要數(shù)天，因此，等測(cè)定完成后，再返回再生平板上去重新挑選菌株孢子，保存在生化培養(yǎng)箱中的再生平板培養(yǎng)基往往由于長(zhǎng)期放置已經(jīng)干裂，很難在從上面挑選出孢子來(lái)，此步驟極易造成篩選到的優(yōu)勢(shì)菌株丟失。為了解決這一問(wèn)題，優(yōu)選地，取出的培養(yǎng)基塊小于板孔的直徑，這樣，板孔中殘留的孢子可用于菌株的保存。
[0040]打孔器是一種常用儀器，用于打取培養(yǎng)基塊簡(jiǎn)便易行，因此，優(yōu)選地，培養(yǎng)基塊由打孔器從板孔中打取。
[0041]經(jīng)試驗(yàn)證明，24孔篩選平板上接種孢子，4天后生長(zhǎng)成熟，為了防止培養(yǎng)基干裂等原因造成的菌株死亡，有足夠的可用孢子用于保存菌株，選用直徑為5mm的打孔器打取24孔篩選平板上板孔中的培養(yǎng)基塊，優(yōu)選地，打孔器的直徑為5mm ;根據(jù)5mm的打孔器打取24孔篩選平板上板孔中的培養(yǎng)基塊的體積，優(yōu)選地，管的容量為2ml ;加入的浸提液無(wú)水甲醇以浸沒(méi)培養(yǎng)基塊為宜，經(jīng)驗(yàn)證得知，0.6ml及以上的體積即可浸沒(méi)，優(yōu)選地，選用Iml無(wú)水甲醇；由于無(wú)水甲醇極易揮發(fā)，為了保證每個(gè)塑料管中的無(wú)水甲醇體積相同，無(wú)水甲醇加入塑料管后應(yīng)立即加蓋并進(jìn)行超聲波震蕩；將震蕩后的管中物質(zhì)經(jīng)微孔濾膜過(guò)濾后得到浸提液。優(yōu)選地，浸提液采用液相色譜測(cè)定抗生素含量。
[0042]將上述方法得到的含有培養(yǎng)基塊和Iml無(wú)水甲醇的2ml管，置于超聲波下震蕩浸提不同時(shí)間，將震蕩后的管中物質(zhì)經(jīng)0.45 μ m的微孔濾膜過(guò)濾后得到浸提液，經(jīng)液相色譜測(cè)定抗生素含量，得到實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)如表1，以表1的超聲時(shí)間為橫坐標(biāo)，測(cè)定峰高為縱坐標(biāo)，可以得到如圖3所示的超聲波震蕩提取效率。
[0043]表1:超聲波震蕩提取效率表
[0044]
【權(quán)利要求】
1.一種鏈霉菌正向突變株篩選方法，其特征在于，包括以下步驟: 對(duì)一部分原始菌株進(jìn)行誘變； 將原始菌株以及誘變的菌株分別接種于再生平板上，并培養(yǎng)至生長(zhǎng)成熟； 分別取生長(zhǎng)成熟的原始菌株孢子以及多個(gè)生長(zhǎng)成熟的誘變菌株孢子，并分別制備成濃度為IO6-1O7個(gè)/ml的孢子懸液； 由每個(gè)所述孢子懸液中取出相同體積的孢子懸液，且取出的體積小于孢子懸液的總體積； 將取出的孢子懸液分別接種于篩選平板不同板孔的培養(yǎng)基上且使孢子懸液均勻分布于所述培養(yǎng)基上，培養(yǎng)至生長(zhǎng)成熟； 從所述篩選平板的每個(gè)板孔中均取出相同體積的培養(yǎng)基塊，分別進(jìn)行浸提并測(cè)定抗生素含量； 將誘變菌株的抗生素含量和原始菌株的抗生素含量對(duì)比，挑選出產(chǎn)抗生素能力高于原始菌株的正向突變菌株。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種 鏈霉菌正向突變株篩選方法，其特征在于，在所述分別取生長(zhǎng)成熟的原始菌株孢子以及多個(gè)生長(zhǎng)成熟的誘變菌株孢子，并分別制備成濃度為IO6-1O7個(gè)/ml的孢子懸液的步驟中，所述孢子懸液 具體由下列步驟制得: 用接種環(huán)分別挑取相同環(huán)數(shù)的生長(zhǎng)成熟的原始菌株的孢子以及多個(gè)生長(zhǎng)成熟的誘變菌株的孢子； 將挑取的所述孢子分別加入至不同的含有無(wú)菌水和玻璃珠的無(wú)菌菌種保藏管中； 將所有所述菌種保藏管加蓋后置于渦旋混勻器上震蕩，使孢子鏈斷裂，制得孢子懸液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種鏈霉菌正向突變株篩選方法，其特征在于，在所述將取出的孢子懸液分別接種于篩選平板不同板孔的培養(yǎng)基上且使孢子懸液均勻分布于所述培養(yǎng)基上，培養(yǎng)至生長(zhǎng)成熟的步驟中: 所述板孔的直徑為6-20mm,深度為6_20mm。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種鏈霉菌正向突變株篩選方法，其特征在于，在所述將取出的孢子懸液分別接種于篩選平板不同板孔的培養(yǎng)基上且使孢子懸液均勻分布于所述培養(yǎng)基上，培養(yǎng)至生長(zhǎng)成熟的步驟中: 所述板孔的直徑為16mm,深度為16mm,且每個(gè)板孔中含有1.0-1.5ml培養(yǎng)基。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種鏈霉菌正向突變株篩選方法，其特征在于，在所述由每個(gè)所述孢子懸液中取出相同體積的孢子懸液，且取出的體積小于孢子懸液的總體積的步驟中: 由每個(gè)所述孢子懸液中取出的體積為20-50 μ I。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種鏈霉菌正向突變株篩選方法，其特征在于，在所述從所述篩選平板的每個(gè)板孔中均取出相同體積的培養(yǎng)基塊，分別進(jìn)行浸提并測(cè)定抗生素含量的步驟中: 所述培養(yǎng)基塊小于所述板孔的直徑。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種鏈霉菌正向突變株篩選方法，其特征在于，在所述從所述篩選平板的每個(gè)板孔中均取出相同體積的培養(yǎng)基塊，分別進(jìn)行浸提并測(cè)定抗生素含量的步驟中:所述培養(yǎng)基塊由打孔器從所述板孔中打取。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種鏈霉菌正向突變株篩選方法，其特征在于，在所述從所述篩選平板的每個(gè)板孔中均取出相同體積的培養(yǎng)基塊，分別進(jìn)行浸提并測(cè)定抗生素含量的步驟中，所述打孔器的直徑為5mm ;所述浸提具體包括下列步驟: 將所述培養(yǎng)基塊轉(zhuǎn)移進(jìn)容量為2ml的管中，加入不少于0.6ml的無(wú)水甲醇，立即加蓋并進(jìn)行超聲波震蕩； 將震蕩后的管中物質(zhì)經(jīng)微孔濾膜過(guò)濾后得到浸提液。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的一種鏈霉菌正向突變株篩選方法，其特征在于，所述浸提步驟中: 所述無(wú)水甲醇的加入量為1ml ； 所述超聲波震蕩的時(shí)間為20min。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，在所述將取出的孢子懸液分別接種于篩選平板不同板孔的培養(yǎng)基上且使孢子懸液均勻分布于所述培養(yǎng)基上，培養(yǎng)至生長(zhǎng)成熟的步驟中，所述板孔的培養(yǎng)基的制備方法包括下列步驟: 從同一塊固體培養(yǎng)基上取相同體積的培養(yǎng)基，分別放入每個(gè)板孔中； 將板孔加蓋進(jìn)行加熱使其融化后冷卻凝固。
【文檔編號(hào)】C12N1/20GK103525806SQ201310540710
【公開(kāi)日】2014年1月22日 申請(qǐng)日期:2013年11月4日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月4日
【發(fā)明者】黃永春, 楊少彬, 劉紅梅, 趙鵬, 張偉 申請(qǐng)人:農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所