豬源衣原體Taqman-MGB探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)用引物、試劑盒和檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種豬源衣原體(C.cuis)Taqman-MGB探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)用引物、試劑盒和檢測(cè)方法。本方法根據(jù)靶序列上MOMP的1個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)2條引物和一條MGB探針，可特異性的擴(kuò)增豬源衣原體。該試劑盒包括擴(kuò)增反應(yīng)液管、陽性對(duì)照、陰性對(duì)照和滅菌去離子水。本發(fā)明只需兩步擴(kuò)增反應(yīng)及信號(hào)收集就可快速、高效、特異、靈敏地檢測(cè)目的靶序列，且操作簡(jiǎn)便，不需要昂貴的儀器和試劑，對(duì)操作人員沒有技術(shù)上的要求，檢測(cè)成本低，檢測(cè)時(shí)間短。
【專利說明】豬源衣原體Taqman-MGB探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)用引物、試劑盒和檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及動(dòng)物疫病分子生物學(xué)檢測(cè)方法及檢測(cè)試劑領(lǐng)域，具體涉及一種豬源衣原體Taqman-MGB探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)用引物、試劑盒和檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]動(dòng)物衣原體病ipilamydiosis)是由各類衣原體{Chlamydia)感染哺乳動(dòng)物、禽類等動(dòng)物所發(fā)生的一類十分重要的自然疫源性傳染病。該病呈地方流行，常造成很大危害及經(jīng)濟(jì)損失。衣原體科的最新分類研究表明，衣原體科分為衣原體屬{Chlamydia )和嗜衣原體屬iChlamydophila)，包括沙眼衣原本{ChlamydiatracAoffiaiis)、豬源衣原體{Chlamydia Swi1S)、鼠沙眼衣原體OiuridarumsKH產(chǎn)嗜衣原體 iChlamydophila aAoriws)、貓嗜衣原體{Chlamydophilafelis~)、家畜靖灰盾、體 ipilamydophila pecorum)、肺炎衣原體{Chlamydophila pneumoniae)和鶴踏熱衣原體{Chlamydophila psittaci) 0感染動(dòng)物的衣原體主要有6種:豬源衣原體、貓衣原體、家畜衣原體、肺炎衣原體和鸚鵡熱衣原體。豬源衣原體是屬于衣原體屬的一個(gè)種，豬是豬源衣原體的天然宿主。目前只是從豬中分離得到，在豬的腸道樣品中分離率最高。豬源衣原體對(duì)養(yǎng)豬業(yè)有著很大的影響。各種品系的豬都能感染豬源衣原體，并導(dǎo)致豬的結(jié)膜炎、肺炎或無癥狀亞臨床感染，本病對(duì)四環(huán)素敏感。從美國(guó)愛荷華州和內(nèi)布拉斯加州、意大利和比利時(shí)的農(nóng)場(chǎng)分離出對(duì)四環(huán)素不敏感的豬源衣原體，這種穩(wěn)定的耐四環(huán)素表現(xiàn)型與染色體中存在耐藥基因有關(guān)。由此可見豬源衣原體的防控對(duì)養(yǎng)豬業(yè)尤為重要。從而也可以通過檢測(cè)豬肉食品中是否含有豬源衣原體來進(jìn)一步降低感染的可能性。
[0003]TaqMan探針是一種募核昔酸探針，突光基團(tuán)鏈接在探針的5’末端,洋滅基團(tuán)則在3，端。當(dāng)探針與靶序列配對(duì)時(shí)，熒光基團(tuán)發(fā)射的熒光因與3’端的淬滅基團(tuán)接近而被淬滅。在進(jìn)行延伸反應(yīng)時(shí)，聚合酶的5’外切酶活性將探針切斷，使得熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分離，發(fā)射熒光。一分子的產(chǎn)物生成就會(huì)伴隨著一分子的熒光信號(hào)的產(chǎn)生。隨著擴(kuò)增循環(huán)數(shù)的增加，釋放出來的熒光基團(tuán)不斷的積累。因此TaqMan探針檢測(cè)的是積累熒光。目前，水解探針已被用于基因檢測(cè)、病毒定量、癌細(xì)胞基因微突變檢測(cè)、細(xì)胞因子基因定量等，其結(jié)果都具有高特異性與高敏感性。
[0004]TaqMan-MGB探針是近年來的一種新型探針，它的淬滅基團(tuán)是一種非熒光的淬滅基團(tuán)，本身不會(huì)發(fā)生熒光，這樣就降低了 PCR反應(yīng)熒光本底信號(hào)的強(qiáng)度，進(jìn)一步提高了其敏感性。
[0005]中國(guó)發(fā)明專利(申請(qǐng)?zhí)枮?200910103457.4、200910094278、200480005196.8、201310009019.8、20 1 1800 15 187.7、20 11 10143186.2、20 1 1 10279330.5、200910200396.3,200910200393.X ,200910094272.1,200910094279.3 等)分別公開了采
用熒光定量PCR擴(kuò)增技術(shù)檢測(cè)病菌和動(dòng)物疫病的方法。但是，目前尚無利用TaqMan-MGB探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增技術(shù)檢測(cè)豬源衣原體{C.cuis)的試劑盒及檢測(cè)方法的報(bào)道。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]為克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種豬源衣原體TaqMan-MGB探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)用引物，第二個(gè)目的是提供使用該引物的檢測(cè)試劑盒，第三個(gè)目的是提供使用上述檢測(cè)用引物和試劑盒檢測(cè)肉制品的檢測(cè)方法。
[0007]為了實(shí)現(xiàn)上述第一個(gè)目的，本發(fā)明提供的豬源衣原體TaqMan-MGB探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)用引物，包括豬源衣原體上游引物，其DNA序列為SEQ ID N0.1;豬源衣原體下游引物，其DNA序列為SEQ ID N0.2 ;豬源衣原體MGB探針，其DNA序列為SEQ ID N0.3。
[0008]為了實(shí)現(xiàn)上述第二個(gè)目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:豬源衣原體Taqman-MGB探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)用試劑盒包括擴(kuò)增反應(yīng)液管、陽性對(duì)照管、陰性對(duì)照管和滅菌去離子水管，其中:
所述擴(kuò)增反應(yīng)液管，管內(nèi)由以下反應(yīng)液組成:
DNA序列為SEQ ID N0.1的10 μ mo I/L的豬源衣原體上游引物0.4 μ L ;
DNA序列為SEQ ID N0.2的10 μ mmol/L的豬源衣原體下游引物0.4 μ L ;
DNA序列為SEQ ID N0.3的10 μ mo I/L的豬源衣原體MGB探針0.4 μ L ;
2X Premix Ex Taq 緩沖液 10 μ L ;
滅菌去尚子水7.8 μ L ;
合計(jì)19 μ L,為單次反應(yīng)的用量。
[0009]所述陽性對(duì)照管，管內(nèi)為豬源衣原體陽性重組質(zhì)粒DNA，體積為20 μ L ;
核苷酸序列為SEQ ID N0.4的PCR上游引物和核苷酸序列為SEQ ID N0.5的PCR下游引物按常規(guī)PCR進(jìn)行擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物與pMD19-T載體進(jìn)行連接反應(yīng)獲得所述陽性重組質(zhì)粒 DNA。
[0010]所述陰性對(duì)照管，管內(nèi)為無豬源衣原體感染豬的血液基因組DNA，體積為20 μ Lo
[0011]所述滅菌去離子水管ImL~2mL。
[0012]為了實(shí)現(xiàn)上述第三個(gè)目的，提供一種豬源衣原體熒光定量PCR擴(kuò)增技術(shù)快速檢測(cè)方法:包括如下步驟:
O制備待檢模板DNA:采用商品化的DNA提取試劑盒，提取待測(cè)樣品中的DNA，獲得待檢模板DNA ；
2)擴(kuò)增反應(yīng)體系為:19μ L擴(kuò)增反應(yīng)液；I μ L待檢模板DNA或陽性對(duì)照或陰性對(duì)照；反應(yīng)體系的總體積為20 μ L;
3)豬源衣原體實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增:將步驟2)配制好的擴(kuò)增反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件:預(yù)變性95°C 30s ；95°C 5s, 60°C 30s (使用ABI 7500建議采用34s) 40個(gè)循環(huán)；在60°C 30s進(jìn)行熒光信號(hào)的采集。
[0013]4)結(jié)果判定:將擴(kuò)增反應(yīng)在35個(gè)循環(huán)以內(nèi)及擴(kuò)增曲線良好的反應(yīng)直接判定為陽性，35個(gè)循環(huán)以后的可直接判定為陰性，同時(shí)陽性對(duì)照的擴(kuò)增明顯，陰性對(duì)照沒有擴(kuò)增。
[0014]本發(fā)明的原理是:針對(duì)一段1000bp左右的靶序列上MOMP保守區(qū)域設(shè)計(jì)2條引物和一條MGB探針，利用探針只與模板特異性地結(jié)合，其結(jié)合的位點(diǎn)在兩條引物之間。探針的5’端標(biāo)記有報(bào)告基團(tuán)FAM, 3’端標(biāo)記有非淬滅基團(tuán),本身不產(chǎn)生突光,可以大大降低本低信號(hào)的強(qiáng)度。同時(shí)探針上還連接有MGB修飾基團(tuán)，可以將探針的Tm值提高10°C左右。因此為了獲得同樣的Tm值，可以將MGB探針設(shè)計(jì)的更短，既降低了合成車成本，也使得探針設(shè)計(jì)的成功率大為提高。這種實(shí)驗(yàn)方法所使用的儀器比較簡(jiǎn)單，同時(shí)克服了傳統(tǒng)PCR固有的檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、容易污染及檢測(cè)成本等缺點(diǎn)、此外，該檢測(cè)方法對(duì)檢測(cè)人員的技術(shù)素質(zhì)要求較低，實(shí)際操作極為簡(jiǎn)單，不需要特殊的試劑和儀器設(shè)備，有利于建立成本低廉的快速篩選體系。
[0015]TaqMan-MGB探針熒光定量PCR擴(kuò)增技術(shù)是一種簡(jiǎn)便、快速、高度特異性的基因擴(kuò)增方法。將此基因擴(kuò)增技術(shù)與普通PCR或普通的TaqMan探針技術(shù)進(jìn)行比較，可發(fā)現(xiàn)該技術(shù)在靈敏度、特異性和檢測(cè)范圍等指標(biāo)上優(yōu)于上面的技術(shù)，且不依賴于任何專門的儀器設(shè)備即可實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)高通量快速檢測(cè)?，F(xiàn)有的豬源衣原體的檢測(cè)周期較長(zhǎng)，約I天，操作繁瑣，而本發(fā)明的試劑盒僅需50min左右。
[0016]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是(I)、不需要特殊試劑與設(shè)備；(2)、高特異性:應(yīng)用MOMP的保守區(qū)段，2條引物及一條MGB探針，根據(jù)是否擴(kuò)增就能判斷靶標(biāo)物質(zhì)的存在與否，陽性率可達(dá)于99.5%，假陽性率小于0.1% ; (3)、快速、高效擴(kuò)增:檢測(cè)時(shí)間50min左右；(4)、靈敏度高:最低檢測(cè)極限達(dá)到1.7 X IO2拷貝/ μ L，比普通的PCR高100倍，其所建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)R2=0.999，擴(kuò)增效率為達(dá)到104.6%，由此可見所建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線的擴(kuò)增效率是比較好的，其熒光曲線與所檢測(cè)的靶基因濃度之間的相關(guān)性比較好，準(zhǔn)確度比較高，標(biāo)本的檢出率達(dá)到98.8% ; (5)、鑒定簡(jiǎn)便:通過最后的擴(kuò)增曲線就可以進(jìn)行結(jié)果的精確的，無需電泳等其他任何分析步驟；(6)、用途:可用于豬及其相關(guān)產(chǎn)品的快速檢測(cè)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1特異性試驗(yàn)結(jié)果；
圖2靈敏度試驗(yàn)結(jié)果；
圖3穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果；
圖4標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立；
圖1中:分別采用了豬源衣原體菌株VR-1474，肺炎衣原體菌株53592，流產(chǎn)衣原體菌株VR-656,鸚鵡熱衣原體，沙眼衣原體菌株VR-878，小鼠衣原體VR-123，貓衣原體，陰性對(duì)照。
【具體實(shí)施方式】
[0018]實(shí)施例1，引物的設(shè)計(jì)及篩選
豬源衣原體熒光定量PCR擴(kuò)增引物及探針，其設(shè)計(jì)是根據(jù)GenBank公布的豬源衣原體MOMP基因的參考序列，用MEGA5進(jìn)行比對(duì)，分析序列并在其保守區(qū)域進(jìn)行引物與探針的設(shè)計(jì)。采用探針設(shè)計(jì)軟件Primer Express 3.0,設(shè)計(jì)4套突光定量引物，由英駿(上海)有限公司合成，利用ABI 7500 FAST PCR儀對(duì)反應(yīng)進(jìn)程中的擴(kuò)增情況進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控，對(duì)不同引物組擴(kuò)增的起始時(shí)間、進(jìn)入最大擴(kuò)增速率的時(shí)間、最大擴(kuò)增速率及達(dá)到平臺(tái)期所需時(shí)間等參數(shù)進(jìn)行分析，篩選出擴(kuò)增速率最高、特異性好的一組熒光定量PCR擴(kuò)增引物，分別標(biāo)記為SEQID N0.1~SEQ ID N0.3。其中豬源衣原體引物組中引物上游:SEQ ID N0.1 ;引物下游:SEQ ID N0.2 ;探針:SEQ ID N0.3 ；SEQ ID N0.1 ~SEQ ID N0.3 的濃度分別為 10 μ mol/L，10 ymol/L ,10 μ mol/L，體積比為1:1:1。同時(shí)，利用PCR引物軟件設(shè)計(jì)陽性重組質(zhì)粒DNA的PCR引物，其核苷酸序列分別為=PCR上游引物:SEQ ID N0.4 ；PCR下游引物:SEQ IDN0.5 ;它們的體積比為1:1。[0019]SEQ ID N0.1 代表的序列為:5’ -CGTCTCCATGCAAATCAA-3’。
[0020]SEQ ID N0.2 代表的序列為:5’ -TCGTCGATTAAGCGAGTC-3’。
[0021]SEQ ID N0.3 代表的序列為:5’ FAM-CAACAGTAACTGCGTATT-MGB3’。
[0022]SEQ ID N0.4 代表的序列為:5’ -CTCCTTRCAAGCYYTGCCTGT-3’。
[0023]SEQ ID N0.5 代表的序列為:5’ -GTGAGCWGCTCTTTCRTYRATTAARCG-3’。
[0024]實(shí)施例2，陽性對(duì)照品的制備
采用商品化的試劑盒提取豬源衣原體細(xì)胞培養(yǎng)物的核酸，將其核酸進(jìn)行PCR及電泳鑒定，采用PCR上游引物SEQ ID N0.4和PCR下游引物SEQ ID N0.5進(jìn)行擴(kuò)增，并使用膠回收試劑盒回收擴(kuò)增的條帶。按照1:10的比例和PMD19-T載體進(jìn)行連接反應(yīng)，4°C連接過夜，轉(zhuǎn)化DH5 α菌，經(jīng)抗性選擇和PCR鑒定陽性后，再測(cè)序驗(yàn)證，利用分光光度計(jì)測(cè)定其核酸的OD值，使其260/280的比值在1.8~2.0之間。從而獲得陽性重組質(zhì)粒DNA。
[0025]實(shí)施例3，陰性對(duì)照品的制備
采用商品化的試劑盒提取無豬源衣原體感染的豬血液基因組DNA，進(jìn)行PCR及電泳鑒定。
[0026]實(shí)施例4，豬源衣原體實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增快速檢測(cè)方法:包括如下步驟: O制備待檢模板DNA:采用商品化的DNA提取試劑盒，提取待測(cè)樣品中的DNA，獲得待檢模板DNA ；
2)擴(kuò)增反應(yīng)體系為:19μ L試劑盒擴(kuò)增管中的擴(kuò)增反應(yīng)液；1 μ L待檢模板DNA或陽性對(duì)照或陰性對(duì)照；反應(yīng)體系的總體積為20 μ L;
3)豬源衣原體熒光定量PCR擴(kuò)增:將步驟2)配制好的擴(kuò)增反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件:預(yù)變性95°C 30s ；95°C 5s, 60°C 30s (使用ABI 7500建議采用34s) 40個(gè)循環(huán)；在60°C 30s進(jìn)行熒光信號(hào)的采集。
[0027]4)結(jié)果判定:將擴(kuò)增反應(yīng)在35個(gè)循環(huán)以內(nèi)及擴(kuò)增曲線良好的反應(yīng)直接判定為陽性，35個(gè)循環(huán)以后的可直接判定為陰性，同時(shí)陽性對(duì)照的擴(kuò)增明顯，陰性對(duì)照沒有擴(kuò)增。
[0028]實(shí)施例5，豬源衣原體實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增的特異性試驗(yàn)
采用實(shí)施例4中步驟3)的反應(yīng)體系及反應(yīng)條件進(jìn)行特異性的試驗(yàn)，所采用的模板分別是豬源衣原體菌株VR-1474，肺炎衣原體菌株53592，流產(chǎn)衣原體菌株VR-656，鸚鵡熱衣原體，沙眼衣原體菌株VR-878，小鼠衣原體VR-123，貓衣原體，陰性對(duì)照。
[0029]參見圖1的結(jié)果顯示:只有豬源衣原體菌株VR-1474有擴(kuò)增曲線。(圖中兩條曲線均表示VR-1474株豬源衣原體菌擴(kuò)增結(jié)果。)
實(shí)施例6，豬源衣原體熒光定量PCR擴(kuò)增的靈敏度試驗(yàn)
將所建立的豬源衣原體質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品(即前面構(gòu)建的陽性質(zhì)粒)進(jìn)行10倍倍比稀釋(1.7 X IO8拷貝/ μ L~l.7 X 10拷貝/ μ L)，采用實(shí)施例4中步驟3)的反應(yīng)體系及反應(yīng)條件進(jìn)行靈敏度試驗(yàn)，結(jié)果顯示出，本發(fā)明建立的方法最低能夠檢測(cè)出1.7X IO2拷貝/ μ L的DNA樣品。
[0030]參見圖2的結(jié)果顯示；圖中的曲線從左到右分別表示倍比稀釋后的模板濃度，依次分別為 1.7X IO8 拷貝 /μ L、l.7X IO7 拷貝 /μ L、l.7X IO6 拷貝 /μ L、1.7X IO5 拷貝 /μ L、1.7 X IO4 拷貝 / μ L、1.7 X IO3 拷貝 / μ L、1.7 X IO2 拷貝 / μ L、1.7 X IO1 拷貝 / μ L、l.7拷貝/ μ L。[0031]實(shí)施例7，豬源衣原體實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增的重復(fù)性試驗(yàn)
以重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品1.7 X IO7拷貝/ μ L與1.7 X IO6拷貝/ μ L為模板，采用實(shí)施例4中步驟3)的反應(yīng)體系及反應(yīng)條件進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)，組內(nèi)與組間重復(fù)試驗(yàn)變異系數(shù)為0.458%~1.174%，表明該方法具有較好的重復(fù)性。參見圖3的結(jié)果顯示。
[0032]實(shí)施例8，豬源衣原體熒光定量PCR擴(kuò)增的標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立
把重組質(zhì)粒的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行五個(gè)倍比稀釋，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作，以熒光強(qiáng)度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，循環(huán)數(shù)為縱坐標(biāo)作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，相關(guān)系數(shù)R2=0.999，擴(kuò)增效率達(dá)到104.6%, Υ=3.2147Χ+41.218。由此可見本實(shí)驗(yàn)所建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線的擴(kuò)增效率是比較好的，其熒光曲線與所檢測(cè)的靶基因濃度之間的相關(guān)性比較好，準(zhǔn)確度比較高。參見圖4的結(jié)果顯示。
【權(quán)利要求】
1.豬源衣原體Taqman-MGB探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)用引物，其特征在于:包括豬源衣原體上游引物，其DNA序列為SEQ ID N0.1; 豬源衣原體下游引物，其DNA序列為SEQ ID N0.2 ； 豬源衣原體MGB探針，其DNA序列為SEQ ID N0.3。
2.豬源衣原體Taqman-MGB探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)用試劑盒，其特征在于:包括擴(kuò)增反應(yīng)液管、陽性對(duì)照管、陰性對(duì)照管和滅菌去離子水管，其中: 所述擴(kuò)增反應(yīng)液管，管內(nèi)由以下反應(yīng)液組成: DNA序列為SEQ ID N0.1的10 μ mo I/L的豬源衣原體上游引物0.4 μ L ; DNA序列為SEQ ID N0.2的10 μ mmol/L的豬源衣原體下游引物0.4 μ L ; DNA序列為SEQ ID N0.3的10 μ mo I/L的豬源衣原體MGB探針0.4 μ L ;
2 X Premix Ex Taq 緩沖液 10 μ L ; 滅菌去尚子水7.8 μ L ; 合計(jì)19 μ L,為單次反應(yīng)的用量； 所述陽性對(duì)照管，管內(nèi)為豬源衣原體陽性重組質(zhì)粒DNA，體積為20μ L ; 所述陰性對(duì)照管，管內(nèi) 為無豬源衣原體感染豬的血液基因組DNA，體積為20yL; 所述滅菌去離子水管ImL~2mL。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述豬源衣原體Taqman-MGB探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)用試劑盒，其特征在于:所述陽性重組質(zhì)粒DNA由如下反應(yīng)獲得； 核苷酸序列為SEQ ID N0.4的PCR上游引物和核苷酸序列為SEQ ID N0.5的PCR下游引物按常規(guī)PCR進(jìn)行擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物與pMD19-T載體進(jìn)行連接反應(yīng)獲得陽性重組質(zhì)粒DNA。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述豬源衣原體Taqman-MGB探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)用試劑盒，其特征在于:所述DNA序列為SEQ ID N0.3的豬源衣原體MGB探針的5’端標(biāo)記有報(bào)告基團(tuán)FAM，3’端標(biāo)記有非淬滅基團(tuán)，同時(shí)探針上還連接有MGB修飾基團(tuán)。
5.利用權(quán)利要求2所述試劑盒進(jìn)行豬源衣原體Taqman-MGB探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)的非疾病診斷目的的檢測(cè)方法:包括如下步驟: O制備待檢模板DNA:采用商品化的細(xì)胞培養(yǎng)液DNA提取試劑盒，提取待測(cè)樣品中的DNA,獲得待檢模板DNA ； 2)擴(kuò)增反應(yīng)體系為:19μ L擴(kuò)增反應(yīng)液；I μ L待檢模板DNA或陽性對(duì)照或陰性對(duì)照；反應(yīng)體系的總體積為20 μ L; 3)豬源衣原體實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增:將配制好的步驟2)中的擴(kuò)增反應(yīng)體系進(jìn)行PCR管反應(yīng)，條件:預(yù)變性95°C 30s ；95°C 5s, 60°C 30s~34s 40個(gè)循環(huán)；在60°C 30s進(jìn)行熒光信號(hào)的米集； 4)結(jié)果判定:將擴(kuò)增反應(yīng)在35個(gè)循環(huán)以內(nèi)及擴(kuò)增曲線良好的反應(yīng)直接判定為陽性，35個(gè)循環(huán)以后的可直接判定為陰性，同時(shí)陽性對(duì)照的擴(kuò)增明顯，陰性對(duì)照沒有擴(kuò)增。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK103525944SQ201310540683
【公開日】2014年1月22日 申請(qǐng)日期:2013年11月5日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月5日
【發(fā)明者】李應(yīng)國(guó), 王昱, 聶福平, 楊俊 , 肖進(jìn)文, 王國(guó)民, 袁曾壯 申請(qǐng)人:重慶出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心