家畜衣原體Taqman-MGB探針實時熒光定量PCR檢測用引物、試劑盒和方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種家畜衣原體Taqman—MGB探針實時熒光定量PCR檢測用引物、試劑盒和方法。該試劑盒根據靶序列上MOMP的一個區(qū)域設計兩條引物和一條探針，可特異性的擴增家畜衣原體。該試劑盒包括擴增反應液、陽性對照、陰性對照和滅菌去離子水。本發(fā)明只需要兩步法擴增法及簡單的反應條件就可以快速、高效、特異性、高靈敏度地檢測目的靶序列，且操作簡便，不需要昂貴的儀器和試劑，對操作人員沒有技術上的要求，檢測成本低，檢測時間短。
【專利說明】家畜衣原體Taqman-MGB探針實時熒光定量PCR檢測用引物、試劑盒和方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及動物疫病分子生物學檢驗方法及檢驗試劑領域，具體涉及一種家畜衣原體Taqman-MGB探針實時熒光定量PCR檢測用引物、試劑盒和方法。
【背景技術】
[0002]動物衣原體病ipilamydiosis)是由各類衣原體{Chlamydia)感染哺乳動物、禽類等動物所發(fā)生的一類十分重要的自然疫源性傳染病。該病呈地方流行，常造成很大危害及經濟損失。衣原體科的最新分類研究表明，衣原體科分為衣原體屬{Chlamydia )和嗜衣原體屬iChlamydophila)，包括沙眼衣原本{ChlamydiatracAoffiaiis)、豬源衣原體{Chlamydia Swi1S)、鼠沙眼衣原體OiuridarumsKH產嗜衣原體 iChlamydophila aAoriws)、貓嗜衣原體{Chlamydophilafelis~)、家畜靖灰盾、體 ipilamydophila pecorum)、肺炎衣原體{Chlamydophila pneumoniae)和鶴踏熱衣原體{Chlamydophila psittaci) 0感染動物的衣原體主要有6種:豬源衣原體、貓衣原體、家畜衣原體、肺炎衣原體和鸚鵡熱衣原體。家畜衣原體屬于嗜性衣原體屬。目前已經從牛、綿羊、山羊、考拉和豬分離到該菌。考拉感染家畜衣原體后引起不育癥和尿道疾??；其他動物感染后會引起流產、結膜炎、腦脊髓炎、腸炎、肺炎等疾病。家畜衣原體首次從間歇性腦脊髓炎病牛分離出來。C常發(fā)現于健康小反會動物如綿羊腸道(Clarkson M.J.等，1997),但有些分離株與結膜炎、關節(jié)炎和睪丸炎有關(Rodolakis A..等，1989;StorZ J..等，1968)。豬C peco/Yffl?感染引發(fā)肺炎、多發(fā)性關節(jié)炎、胸膜炎、心包炎和流產。沙眼衣原體和C 混合感染可能是豬衣原體流產的主要原因。由此可見家畜衣原體對養(yǎng)殖業(yè)有著很大的危害，對養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展造成極大的威脅。本發(fā)明就此研究開發(fā)了家畜衣原體TaqMan-MGB熒光定量PCR檢測方法，這種方法能夠快速準確的檢測到家畜衣原體，在最短的時間內做出相應的對策。
`[0003]TaqMan探針是一種募核昔酸探針，突光基團鏈接在探針的5’末端,洋滅基團則在3，端。當探針與靶序列配對時，熒光基團發(fā)射的熒光因與3’端的淬滅基團接近而被淬滅。在進行延伸反應時，聚合酶的5’外切酶活性將探針切斷，使得熒光基團與淬滅基團分離，發(fā)射熒光。一分子的產物生成就會伴隨著一分子的熒光信號的產生。隨著擴增循環(huán)數的增加，釋放出來的熒光基團不斷的積累。因此TaqMan探針檢測的是積累熒光。目前，水解探針已被用于基因檢測、病毒定量、癌細胞基因微突變檢測、細胞因子基因定量等，其結果都具有高特異性與高敏感性。
[0004]TaqMan — MGB探針是近年來的一種新型探針，它的淬滅基團是一種非熒光的淬滅基團，本身不會發(fā)生熒光，這樣就降低了 PCR反應熒光本底信號的強度，進一步提高了其敏感性。
[0005]中國發(fā)明專利(申請?zhí)枮?200710030435.0,200710030437.X,200710132320.2、200710026389.7,200810052321.0,200810015001.8,200810093986.6,200910041358.8、200910251055.9,200910090037.7,201010555073.9,201110339104.X 等)分別公開了采用
熒光定量PCR擴增技術檢測病菌和動物疫病的方法。但是，目前尚無利用TaqMan-MGB探針熒光定量PCR擴增技術檢測家畜衣原體{C.pecorum)的試劑盒及檢測方法的報道。

【發(fā)明內容】

[0006]為克服現有技術的不足，本發(fā)明的第一個目的是提供一種家畜衣原體TaqMan-MGB探針實時熒光定量PCR檢測用引物，第二個目的是提供使用該引物的家畜衣原體TaqMan-MGB探針實時熒光定量PCR檢測用試劑盒，第三個目的是提供使用上述檢測用引物的試劑盒的使用方法，用于對肉食品出入境進行檢測。
[0007]為了實現上述第一目的本發(fā)明采用如下技術方案:家畜衣原體Taqman — MGB探針實時熒光定量PCR檢測用引物，包括家畜衣原體上游引物，其DNA序列為SEQ ID N0.1 ;家畜衣原體下游引物，其DNA序列為SEQ ID N0.2 ;家畜衣原體MGB探針，其DNA序列為SEQ IDN0.3。
[0008]為了實現上述第二目的本發(fā)明采用如下技術方案:一種家畜衣原體熒光實時定量PCR檢測用試劑盒，包括擴增反應液管、陽性對照管、陰性對照管和滅菌去離子水管，其中:
所述擴增反應液管，管內由以下反應液組成:
DNA序列為SEQ ID N0.1的10 μ mol/L的家畜衣原體上游引物0.2 μ L ;
DNA序列為SEQ ID N0.2的10 μ mmol/L的家畜衣原體下游引物0.2 μ L ;
DNA序列為SEQ ID N0.3的10 μ mol/L的豬家畜衣原體MGB探針0.4 μ L ;
2 X Premix Ex Taq 緩沖液` 10 μ L ;
滅菌去離子水8.2μ L ;
所述陽性對照管，管內為家畜衣原體陽性重組質粒DNA，體積為20 μ L ;
核苷酸序列為SEQ ID N0.4的PCR上游引物和核苷酸序列為SEQ ID N0.5的PCR下游引物按常規(guī)進行PCR擴增，將PCR產物與pMD19-T載體進行連接反應獲得所述陽性重組質粒 DNA;
所述陰性對照管，管內為無家畜衣原體感染的豬的血液基因組DNA，體積為20μ L ; 所述滅菌去離子水管ImL~2mL。
[0009]為了實現上述第二目的本發(fā)明提供一種家畜衣原體熒光實時定量PCR檢測方法:包括如下步驟:
O制備待檢模板DNA:選用商品化的DNA提取試劑盒，提取待測樣品中的DNA，獲得待檢模板DNA ；
2)擴增反應體系為:19μ L擴增反應液，I μ L待檢模板DNA或陽性對照或陰性對照；反應體系的總體積為20 μ L;
3)家畜衣原體熒光定量PCR擴增:將步驟2)配制好的擴增反應體系進行PCR管反應條件:預變性95°C 30s ；95°C 5s, 58°C 30s~34s (使用ABI 7500建議采用34s) 40個循環(huán)；在58°C 30s進行熒光信號的采集。
[0010]4)結果判定:將擴增反應在35個循環(huán)以內及擴增曲線良好的反應直接判定為陽性，35個循環(huán)以后的可直接判定為陰性，同時陽性對照的擴增明顯，陰性對照沒有擴增。
[0011]本發(fā)明的原理是:針對一段1000bp左右的靶序列上MOMP保守區(qū)域設計2條引物和一條MGB探針，利用探針只與模板特異性地結合，其結合的位點在兩條引物之間。探針的5’端標記有報告基團FAM, 3’端標記有非淬滅基團,本身不產生突光,可以大大降低本低信號的強度。同時探針上還連接有MGB修飾基團，可以將探針的Tm值提高10°C左右。因此為了獲得同樣的Tm值，可以將MGB探針設計的更短，既降低了合成車成本，也使得探針設計的成功率大為提高。這種實驗方法所使用的儀器比較簡單，同時克服了傳統(tǒng)PCR固有的檢測時間長、容易污染及檢測成本等缺點、此外，該檢測方法對檢測人員的技術素質要求較低，實際操作極為簡單，不需要特殊的試劑和儀器設備，有利于建立成本低廉的快速篩選體系。
[0012]TaqMan-MGB探針熒光定量PCR擴增技術是一種簡便、快速、高度特異性的基因擴增方法。將此基因擴增技術與普通PCR或普通的TaqMan探針技術進行比較，可發(fā)現該技術在靈敏度、特異性和檢測范圍等指標上優(yōu)于上面的技術，且不依賴于任何專門的儀器設備即可實現現場高通量快速檢測?，F有的家畜衣原體的檢測周期較長，約I天，操作繁瑣，而本發(fā)明的試劑盒僅需50min左右。
[0013]本發(fā)明的優(yōu)點是(I)、不需要特殊試劑與設備；(2)、高特異性:應用MOMP的保守區(qū)段，二條引物及一條MGB探針，根據是否擴增就能判斷靶標物質的存在與否，陽性率可達于99.8%，假陽性率小于0.1% ; (3)、快速、高效擴增:檢測時間50min左右；(4)、靈敏度高:最低檢測極限達到2.8X 10拷貝/uL ; (5)、鑒定簡便:通過最后的擴增曲線就可以進行結果的精確的，無需電泳等其他任何分析步驟；(6)、用途:可用于畜產品及其相關產品的快速檢測。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1特異性試驗結果 圖2靈敏度試驗結果；
圖3穩(wěn)定性試驗結果；
圖4標準曲線的建立；
圖1中:分別采用了家畜衣原體菌株VR-1575，肺炎衣原體菌株53592，流產衣原體菌株VR-656,鸚鵡熱衣原體，沙眼衣原體菌株VR-878，小鼠衣原體VR-123，貓衣原體，陰性對照。
【具體實施方式】
[0015]實施例1，引物的設計及篩選
家畜衣原體熒光定量PCR擴增引物及探針，其設計是根據GenBank公布的家畜衣原體MOMP基因的參考序列，用MEGA5進行比對，分析序列并在其保守區(qū)域進行引物與探針的設計。采用探針設計軟件Primer Express 3.0,設計4套突光定量引物，由英駿(上海)有限公司合成，利用ABI 7500 FAST PCR儀對反應進程中的擴增情況進行實時監(jiān)控，對不同引物組擴增的起始時間、進入最大擴增速率的時間、最大擴增速率及達到平臺期所需時間等參數進行分析，篩選出擴增速率最高、特異性好的一組熒光定量PCR擴增引物，分別標記為SEQ ID N0.1~SEQ ID N0.3。其中引物組中上游引物:SEQ ID N0.1 ;下游引物:SEQID N0.2 ;探針:SEQ ID N0.3 ；SEQ ID N0.1 ~SEQ ID N0.3 的濃度分別為 10 μ mol/L, 10μ mol/L ,10 μ mol/L，體積比為1: 1: 2。同時，利用PCR引物軟件設計陽性重組質粒DNA的PCR引物，其核苷酸序列分別為=PCR上游引物:SEQ ID N0.4 ；PCR下游引物:SEQ ID N0.5 ；它們的體積比為1:1。
[0016]SEQ ID N0.1 代表的序列為:5’ -GCAGAGCCAAGTTTATTAATTG-3’
SEQ ID N0.2 代表的序列為:5’ -TAGCGCAAGGATCACATG-3’
SEQ ID N0.3 代表的序列為:5’ FAM-ATCTCCTGACATACCTTC-MGB3’
SEQ ID N0.4 代表的序列為:5’ -CTCCTTRCAAGCYYTGCCTGT-3’
SEQ ID N0.5 代表的序列為:5’ -GTGAGCWGCTCTTTCRTYRATTAARCG-3’
實施例2，陽性對照品的制備
用試劑盒提取家畜衣原體細胞培養(yǎng)物的核酸，將其核酸進行PCR及電泳鑒定，采用PCR上游引物SEQ ID N0.4和PCR下游引物SEQ ID N0.5進行擴增，并使用膠回收試劑盒回收擴增的條帶。按照1:10的比例和PMD19-T載體進行連接反應，4°C連接過夜，轉化DH5a菌，經抗性選擇和PCR鑒定陽性后，再測序驗證，利用分光光度計測定其核酸的OD值，使其260/280的比值在1.8~2.0之間。
[0017]實施例3，陰性對照品的制備
用試劑盒提取無家畜衣原體感染的豬的血液基因組DNA，進行PCR及電泳鑒定。
[0018]實施例4，家畜衣原體熒光定量PCR擴增快速檢測方法:包括如下步驟:
O制備待檢模板DNA:選用商品化的DNA提取試劑盒，提取樣品中的DNA，獲得待檢模板 DNA。
[0019]2)擴增反應體系為:19 μ L擴增反應液；1 μ L待檢模板DNA或陽性對照或陰性對照；反應體系的總體積為20 μ L。
[0020]3)家畜衣原體熒光定量PCR擴增:將步驟2)配制好的擴增反應體系進行PCR擴增，反應條件:預變性95°C 30s ；95°C 5s, 58°C 30s (使用ABI 7500建議采用34s) 40個循環(huán)；在58°C 30s進行熒光信號的采集。
[0021]4)結果判定:將擴增反應在35個循環(huán)以內及擴增曲線良好的反應直接判定為陽性，35個循環(huán)以后的可直接判定為陰性，同時陽性對照的擴增明顯，陰性對照沒有擴增。
[0022]實施例5，豬衣原體熒光定量PCR擴增的特異性試驗
采用實施例4中的反應體系及反應條件進行特異性的試驗，所采用的模板分別是家畜衣原體菌株VR-1575，肺炎衣原體菌株53592，流產衣原體菌株VR-656，鸚鵡熱衣原體，沙眼衣原體菌株VR-878，小鼠衣原體VR-123，貓衣原體，陰性對照。
[0023]參見圖1的結果顯示:圖中的兩條曲線分別表示只有VR-1575株家畜衣原體菌有檢測結果。
[0024]實施例6，家畜衣原體熒光定量PCR擴增的靈敏度試驗
將所建立的家畜衣原體質控標準品(即陽性質粒)進行10倍倍比稀釋(2.8X IO8拷貝/μ L^2.8X10拷貝/y L)，采用實施例4的反應體系及反應條件進行靈敏度試驗，結果顯示出，建立的該方法最低能夠檢測出2.8 X 10拷貝/ μ L的DNA樣品。
[0025]參見圖2的結果顯示:圖中的曲線從左到右分別表示倍比稀釋后的模板濃度，依次分別為 2.8 X IO8 拷貝 / μ L、2.8 X IO7 拷貝 / μ L、2.8 X IO6 拷貝 / μ L、2.8 X IO5 拷貝 / μ L、2.8Χ104 拷貝 / μ L、2.8Χ103 拷貝 / μ L、2.8X IO2 拷貝 /yL、2.8X10 拷貝 /yL。
[0026]實施例7，家畜衣原體熒光定量PCR擴增的重復性試驗
以重組質粒標準品2.8X106拷貝/yL與2.8X105拷貝/ μ L為模板，采用實施例4的反應體系及反應條件進行重復性試驗，組內與組間重復試驗變異系數為 0.1702%~2.796%，表明該方法具有較好的重復性。
[0027]參見圖3的結果顯示。
[0028]實施例8，家畜衣原體熒光定量PCR擴增的標準曲線的建立
把重組質粒的標準品進行五個倍比稀釋，進行標準曲線的制作，以熒光強度的對數值為橫坐標，循環(huán)數為縱坐標作圖，得到標準曲線，相關系數R2=0.999，擴增效率達到101.7%, Υ=3.2815Χ+41.396。由此可見本實驗所建立的標準曲線的擴增效率較好，其熒光曲線與所檢測的靶基因濃度之間的相關性較好，準確度較高。
[0029]參見圖4的結果顯示。`
【權利要求】
1.家畜衣原體Taqman— MGB探針實時熒光定量PCR檢測用引物，其特征在于:包括家畜衣原體上游引物，其DNA序列為SEQ ID N0.1 ； 家畜衣原體下游引物，其DNA序列為SEQ ID N0.2 ； 家畜衣原體MGB探針，其DNA序列為SEQ ID N0.3。
2.家畜衣原體Taqman— MGB探針實時熒光定量PCR檢測用試劑盒，其特征在于:它包括擴增反應液管、陽性對照管、陰性對照管和滅菌去離子水管，其中: 所述擴增反應液管，管內由以下反應液組成: DNA序列為SEQ ID N0.1的10 μ mol/L的家畜衣原體上游引物0.2 μ L ; DNA序列為SEQ ID N0.2的10 μ mmol/L的家畜衣原體下游引物0.2 μ L ; DNA序列為SEQ ID N0.3的10 μ mol/L的家畜衣原體MGB探針0.4 μ L ; 2XPremix Ex Taq 緩沖液 ΙΟμ?; 滅菌去離子水8.2μ L ; 合計19 μ L,為單次反應的用量； 所述陽性對照管，管內為家畜衣原體陽性重組質粒DNA，體積為20μ L ; 所述陰性對照管，管內為無家畜衣原體感染的豬的血液基因組DNA，體積為20μ L ;` 所述滅菌去離子水管ImL~2mL。
3.根據權利要求2所述家畜衣原體Taqman— MGB探針實時熒光定量PCR檢測用試劑盒，其特征在于:所述陽性重組質粒DNA由如下反應獲得: 核苷酸序列為SEQ ID N0.4的PCR上游引物和序列為SEQ ID N0.5的PCR下游引物按常規(guī)進行PCR擴增，將PCR產物與pMD19-T載體進行連接反應獲得所述陽性重組質粒DNA。
4.根據權利要求2所述家畜衣原體Taqman— MGB探針實時熒光定量PCR檢測用試劑盒，其特征在于:所述DNA序列為SEQ ID N0.3的家畜衣原體MGB探針的5’端標記有報告基團FAM，3’端標記有非淬滅基團，同時還連接有MGB修飾基團。
5.利用權利要求2所述試劑盒進行家畜衣原體Taqman-MGB探針實時熒光定量PCR檢測的非疾病診斷目的的檢測方法:包括如下步驟: O制備待檢模板DNA:選用商品化的DNA提取試劑盒，提取待測樣品中的DNA，獲得待檢模板DNA ； 2)擴增反應體系為:19μ L擴增反應液；I μ L待檢模板DNA或陽性對照或陰性對照；反應體系的總體積為20 μ L; 3)家畜衣原體熒光定量PCR擴增:將步驟2)配制好的擴增反應體系進行PCR擴增，反應條件:預變性95°C 30s ；95°C 5s, 58°C 30s~34s 40個循環(huán)；在58°C 30s進行熒光信號的采集； 4)結果判定:將擴增反應在35個循環(huán)以內及擴增曲線良好的反應直接判定為陽性，35個循環(huán)以后的可直接判定為陰性，同時陽性對照的擴增明顯，陰性對照沒有擴增。
【文檔編號】C12N15/11GK103555841SQ201310540047
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年11月5日 優(yōu)先權日:2013年11月5日
【發(fā)明者】楊俊 , 聶福平, 王昱, 李應國, 王國民, 袁曾壯 申請人:重慶出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心