一種熒光/mri雙模態(tài)成像探針的合成方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種熒光/MRI雙模態(tài)成像探針的合成方法，具體步驟如下：1、向低聚殼聚糖中加入無水DMSO，攪拌至溶解；分別稱取Cy5.5和EDC加入到上述溶液中，室溫避光反應(yīng)；向反應(yīng)后的溶液中加入丙酮，離心，用丙酮洗滌，真空干燥得到固體粉末。2、向步驟1中的固體粉末中加入DMSO，磁力攪拌至溶解完全；再依次加入DMAP和多胺多酸酸酐，于室溫下反應(yīng)。向反應(yīng)后的溶液中加入丙酮，離心，用丙酮洗滌，真空干燥得到固體粉末。3、將步驟2所得到的固體粉末溶解于去離子水中，不斷攪拌下緩慢加入順磁性金屬鹽，溶液于室溫下攪拌，真空濃縮，加入無水乙醇沉淀，用乙醇和乙醚洗滌，過濾，真空干燥得到最終產(chǎn)物。本發(fā)明的產(chǎn)品水溶性好，熒光性能及體外成像效果優(yōu)良。
【專利說明】
一種熒光/MR I雙模態(tài)成像探針的合成方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于雙模態(tài)成像探針領(lǐng)域，具體涉及一種熒光/MRI雙模態(tài)成像探針的合成方法。
【背景技術(shù)】
[0002]腫瘤是威脅人類健康的重要疾病之一，腫瘤疾病的早期診斷和治療是提高患者生存質(zhì)量和治愈率的關(guān)鍵。磁共振成像(Magnetic resonance imaging，MRI)是當(dāng)代臨床診斷中最為成熟的檢測手段之一，其具有空間分辨率高、對人體無電離輻射損傷、可對任意層面選層掃描(橫斷面、矢狀面、冠狀面和任意切面)等特點，但是MRI技術(shù)對骨質(zhì)結(jié)構(gòu)的顯示較差，且靈敏度較低，使得其臨床實際應(yīng)用受到很大的限制。與MRI技術(shù)相比，熒光成像技術(shù)的靈敏度明顯高于MRI，但是其空間分辨率和組織穿透力低于MRI技術(shù)。因而可將MRI與熒光成像技術(shù)有效結(jié)合，以克服單一模態(tài)成像技術(shù)的固有局限性，取長補(bǔ)短，協(xié)同發(fā)揮各自的優(yōu)勢。因此，將MRI造影劑與熒光材料一體化的雙模態(tài)成像探針在生物醫(yī)學(xué)及臨床診斷領(lǐng)域具有重要的研究意義和潛在的應(yīng)用前景。
[0003]傳統(tǒng)的雙模態(tài)成像探針的研究中，熒光成像單元所用的材料主要有半導(dǎo)體量子點、稀土上轉(zhuǎn)換材料、有機(jī)熒光分子等。盡管半導(dǎo)體量子點激發(fā)光譜寬，發(fā)射光譜窄，然而半導(dǎo)體量子點主要是一類由CcUTe等重金屬組成的無機(jī)半導(dǎo)體材料，它們在生物體內(nèi)的安全性受到質(zhì)疑。稀土元素也由于與其配合的水分子會對稀土元素自身的熒光產(chǎn)生淬滅作用，使得其在成像探針領(lǐng)域的進(jìn)一步應(yīng)用受到了限制。作為半導(dǎo)體量子點和稀土元素的替代材料，有機(jī)熒光染料得到了廣泛的應(yīng)用。其中，發(fā)射波長在700-1200nm范圍的近紅外熒光(Near-1nfrared fluorescence ;NIRF)染料是焚光成像中最受關(guān)注的熱點之一。因為其具有較強(qiáng)的組織穿透能力，且在此波長范圍內(nèi)生物組織自身的熒光較弱，避免了背景干擾，可獲得較高的分析靈敏度。另外，傳統(tǒng)的雙模態(tài)成像探針的研究中，磁共振成像單元所用的材料主要是基于氧化鐵或釓螯合物之類的磁性造影劑，尤其是釓螯合物在凸顯組織差異性、增強(qiáng)成像效果等方面起到了關(guān)鍵的作用。最早應(yīng)用于臨床的釓基造影劑是Gd-DTPA( 二乙三胺五乙酸釓)。然而，隨著臨床應(yīng)用的逐步展開，研究發(fā)現(xiàn)Gd-DTPA容易引起生物體腎源性系統(tǒng)纖維化(Nephrogenic Systemic Fibrosis，NSF)，IL基造影劑的體內(nèi)安全性因此受到了很大的爭議。
[0004]基于上述研究現(xiàn)狀分析可以看出，熒光/MRI雙模態(tài)成像探針的合成應(yīng)從兩方面入手:一是選擇合適的具有較高靈敏度和熒光性能的熒光成像材料;二是選擇合適的具有高弛豫性能和安全性能的磁共振成像材料，可以是對傳統(tǒng)的釓基造影劑的修飾改性，也可以是以生物體內(nèi)本來就存在的順磁性金屬來替代外來金屬釓。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明提供一種體內(nèi)安全、高效的熒光/MRI雙模態(tài)成像探針的合成方法。針對上述問題，本發(fā)明選擇NIRF染料Cy5.5作為熒光成像分子，以具有生物相容性、生物可降解性、無毒性等優(yōu)良特性的水溶性低聚殼聚糖修飾的多胺多酸類順磁性金屬配合物作為磁共振成像分子，合成出一種兼具熒光成像和磁共振成像的雙模態(tài)成像探針。
[0006]本發(fā)明的具體技術(shù)方案如下:
[0007]一種熒光/MRI雙模態(tài)成像探針的合成方法，具體步驟如下:
[0008]步驟1、向低聚殼聚糖中加入10?30mL無水DMS0，于50?70°C下攪拌直至溶解;分別稱取Cy5.5和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(EDC)加入到上述溶液中，室溫避光反應(yīng)18?36h;向反應(yīng)后的溶液中加入10?30mL丙酮，離心，用丙酮洗滌產(chǎn)物，真空干燥，得到固體粉末。
[0009]步驟2、稱取步驟I中所得到的固體粉末，向固體粉末中加入5?15mLDMSO，磁力攪拌至溶解完全；再依次加入4-二甲氨基吡啶(DMAP)和多胺多酸酸酐，于室溫下反應(yīng)20?48h ο向反應(yīng)后的溶液中加入1?30mL丙酮，離心，用丙酮洗滌產(chǎn)物，真空干燥，得到固體粉末。
[0010]步驟3、稱取步驟2所得到的固體粉末溶解于10?50mL去離子水中，不斷攪拌下緩慢加入順磁性金屬鹽，溶液于室溫下攪拌6?1h，真空濃縮，加入10?40mL無水乙醇沉淀，用乙醇和乙醚洗滌產(chǎn)物，過濾，真空干燥，得到熒光/MRI雙模態(tài)成像探針。
[0011]步驟I中，所使用的低聚殼聚糖的聚合度為6、8、11或20。
[0012]步驟I中，低聚殼聚糖、Cy5.5、EDC與無水DMSO的用量比為I?1.1mmol: Immol:Immol:20?60mLo
[0013]步驟2中，所述的多胺多酸酸酐是二乙三胺五乙酸酸酐(DTPAA)或I，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸酸酐(DOTAA)或乙二胺四乙酸酸酐(EDTAA)。
[0014]步驟2中，加入的固體粉末、DMAP、多胺多酸酸酐與DMSO的用量比為lmmol:l?1.2mmοI:Immol:50?150mLo
[0015]步驟3中，所述的順磁性金屬鹽為Gd、Mn或Fe的硝酸鹽、氯化鹽、硫酸鹽或醋酸鹽中的一種。
[0016]步驟3中，加入的固體粉末、順磁性金屬鹽與去離子水的用量比為Immol:1?4mmol:100?500mL。
[0017]所述的真空干燥溫度為30?450C，干燥時間為6?1h;步驟2中，所述的真空干燥溫度為35?60°C，干燥時間為8?12h;步驟3中，所述的真空干燥溫度為35?60°C，干燥時間為8?12h0
[0018]有益效果:
[0019](I)本發(fā)明在技術(shù)上采用MRI造影劑與有機(jī)熒光染料分子相結(jié)合的方式，得到兼具熒光成像和核磁共振成像的雙模態(tài)成像探針，實現(xiàn)一次給藥便可得到多種診斷信息的目的，有效地提高了臨床診斷的準(zhǔn)確性和全面性，克服了傳統(tǒng)單一模態(tài)成像技術(shù)的弊端；
[0020](2)本發(fā)明以低聚殼聚糖修飾的多胺多酸類順磁性金屬配合物作為磁共振成像分子，殼聚糖是天然可再生豐產(chǎn)資源，成本較低，且無毒，有良好的生物相容性和生物可降解性，減輕了環(huán)境壓力，其結(jié)構(gòu)上富余的氨基和羥基還具有絡(luò)合游離金屬離子的能力，提高了成像探針的體內(nèi)安全性；
[0021](3)本發(fā)明的產(chǎn)品水溶性好，縱向弛豫率為10?15Π1Μ—1.s—1，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)單一模態(tài)的造影劑Gd-DTPA(同等測定條件下，其縱向弛豫率= 3.85^-1.s—O，且體外成像效果優(yōu)良，是一種優(yōu)異的潛在診療材料，為新型多功能診斷探針的設(shè)計開發(fā)提供了理論和實驗基礎(chǔ)。
【附圖說明】
[0022]圖1為本發(fā)明實施例1中熒光/MRI雙模態(tài)成像探針的合成示意圖；
[0023]圖2為本發(fā)明實施例1中合成的熒光/MRI雙模態(tài)成像探針及Cy5.5的熒光發(fā)射圖譜(插圖=Gd-DTPA的熒光發(fā)射圖譜)；
[0024]圖3為本發(fā)明實施例1中合成的熒光/MRI雙模態(tài)成像探針的縱向弛豫率圖；
[0025]圖4為本發(fā)明實施例1中合成的熒光/MRI雙模態(tài)成像探針在不同濃度下的體外縱向弛豫加權(quán)成像圖。
【具體實施方式】
[0026]下面結(jié)合具體實施例和說明書附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，并且本發(fā)明的保護(hù)范圍不僅局限于以下實施例。
[0027]實施例1
[0028](I)稱取聚合度為11的低聚殼聚糖0.990(^(0.511111101)置于1001^圓底燒瓶中，加入2011^無水0150，于50°(:下攪拌直至溶解。分別稱取0.74148(0.511111101)075.5和0.19178(0.5mmol)EDC加入到上述溶液中，室溫避光反應(yīng)24h。向反應(yīng)后的溶液中加入30mL丙酮，離心，用丙酮洗滌產(chǎn)物，于30°C下真空干燥1h，得到固體粉末。
[0029](2)稱取0.2722g(0.1mmol)步驟(I)中所得固體粉末于50mL圓底燒瓶中，加入5mLDMS0，磁力攪拌至溶解完全。再依次加入12.22mg(0.1mmol)DMAP和0.0357g(0.1mmol)DTPAA，于室溫下反應(yīng)48h ο向反應(yīng)后的溶液中加入30mL丙酮，離心，用丙酮洗滌產(chǎn)物，于40 °C下真空干燥I Ih，得到固體粉末。
[0030](3)稱取0.3078g(0.1mmoI)步驟(2)中所得固體粉末溶解于1mL去離子水中，不斷攪拌下緩慢加入0.1487g(0.4mmol )GdCl3.6H2O，溶液于室溫下攪拌1h，真空濃縮，加入35mL無水乙醇沉淀，用乙醇和乙醚洗滌產(chǎn)物，過濾，于50 °C下真空干燥I Oh，得到熒光/MRI雙模態(tài)成像探針。
[0031 ]本實施例的合成示意圖如圖1所示。此外，在本實施例中還對上述所得的焚光/MRI雙模態(tài)成像探針進(jìn)行了熒光光譜(圖2)、縱向弛豫率(圖3)及體外縱向弛豫加權(quán)成像(圖4)測定。從圖2中可以看出，Cy5.5的最大發(fā)射波長(Aem) = 693nm，制備得到的熒光/MRI雙模態(tài)成像探針Gd-DTPA-Cy5.5_CSn的Xem=676nm，與Cy5.5的熒光光譜相比，Gd-DTPA_Cy5.5-CSn的熒光強(qiáng)度幾乎沒有減弱，但是的位置發(fā)生了輕微地藍(lán)移，可能是由于共軛程度的減弱。圖2插圖是傳統(tǒng)單一模態(tài)的造影劑Gd-DTPA的熒光發(fā)射圖譜，Gd-DTPA的Aem在305nm附近，通過對比發(fā)現(xiàn)，Gd-DTPA的熒光強(qiáng)度明顯弱于Gd-DTPA-Cy5.5-CSn，甚至可以忽略不計。圖3為本實施例中制備得到的Gd-DTPA-Cy5.5-CSn的弛豫率圖。從圖中線性擬合分析得到，Gd-DTPA-Cy5.5-CSn的縱向弛豫率為12.744mM—1S+1，明顯高于同等條件下Gd-DTPA的縱向弛豫率(3.85mM—1S.0。圖4為本實施例中制備得到的Gd-DTPA-Cy5.5-CSn的體外縱向弛豫加權(quán)成像圖。從圖中可以看出，同等濃度條件下，Gd-DTPA的圖像亮度明顯暗于Gd-DTPA-Cy5.5-CSn的圖像，Gd-DTPA-Cy5.5-CSn具有明顯的MRI增強(qiáng)對比效果。以上的分析結(jié)果表明，本實施例中合成得到的成像探針Gd-DTPA-Cy 5.5-CSn能夠同時用在熒光和MRI雙模態(tài)成像。
[0032]實施例2
[0033](I)稱取聚合度為8的低聚殼聚糖0.8030g(0.55mmoI)置于10mL圓底燒瓶中，加入1011^無水0150，于60°(:下攪拌直至溶解。分別稱取0.74148(0.511111101)075.5和0.19178(0.5mmol)EDC加入到上述溶液中，室溫避光反應(yīng)18h。向反應(yīng)后的溶液中加入20mL丙酮，離心，用丙酮洗滌產(chǎn)物，于45°C下真空干燥6h，得到固體粉末。
[0034](2)稱取0.2201g(0.1mmol)步驟(I)中所得固體粉末于50mL圓底燒瓶中，加入1mLDMSO，磁力攪拌至溶解完全。再依次加入14.66mg(0.12mmol )DMAP和0.0357g(0.lmmol)DTPAA，于室溫下反應(yīng)36h ο向反應(yīng)后的溶液中加入20mL丙酮，離心，用丙酮洗滌產(chǎn)物，于35 °C下真空干燥12h，得到固體粉末。
[0035](3)稱取0.2558g(0.1mmoI)步驟(2)中所得固體粉末溶解于40mL去離子水中，不斷攪拌下緩慢加入0.1081g(0.4mmol)FeCl3.6H2O，溶液于室溫下攪拌6h，真空濃縮，加入20mL無水乙醇沉淀，用乙醇和乙醚洗滌產(chǎn)物，過濾，于60 °C下真空干燥Sh，得到熒光/MRI雙模態(tài)成像探針。
[0036]實施例3
[0037](I)稱取聚合度為20的低聚殼聚糖1.9800g(0.55mmol)置于10mL圓底燒瓶中，加入30mL無水DMS0，于70°C下攪拌直至溶解。分別稱取0.74148(0.511111101)075.5和0.19178(0.5mmol)EDC加入到上述溶液中，室溫避光反應(yīng)36h。向反應(yīng)后的溶液中加入25mL丙酮，離心，用丙酮洗滌產(chǎn)物，于35°C下真空干燥9h，得到固體粉末。
[0038](2)稱取0.4341g(0.1mmol)步驟(I)中所得固體粉末于50mL圓底燒瓶中，加入15mLDMSO，磁力攪拌至溶解完全。再依次加入14.66mg(0.12mmol )DMAP和0.0404g(0.lmmol)DOTAA，于室溫下反應(yīng)48h ο向反應(yīng)后的溶液中加入28mL丙酮，離心，用丙酮洗滌產(chǎn)物，于60 °C下真空干燥8h，得到固體粉末。
[0039](3)稱取0.4745g(0.1mmoI)步驟(2)中所得固體粉末溶解于50mL去離子水中，不斷攪拌下緩慢加入0.0536g(0.2mmol) (CH3COO)3Mn.2H20，溶液于室溫下充分?jǐn)嚢?h，真空濃縮，加入40mL無水乙醇沉淀，用乙醇和乙醚洗滌產(chǎn)物，過濾，于45 °C下真空干燥I Ih，得到熒光/MRI雙模態(tài)成像探針。
[0040]實施例4
[0041 ] (I)稱取聚合度為6的低聚殼聚糖0.6480g(0.6mmol)置于10mL圓底燒瓶中，加入1511^無水0150，于60°(:下攪拌直至溶解。分別稱取0.44488(0.611111101)075.5和0.11508(0.6mmol)EDC加入到上述溶液中，室溫避光反應(yīng)30h。向反應(yīng)后的溶液中加入1mL丙酮，離心，用丙酮洗滌產(chǎn)物，于40°C下真空干燥Sh，得到固體粉末。
[0042](2)稱取0.5464g(0.3mmol)步驟(I)中所得固體粉末于50mL圓底燒瓶中，加入12mLDMSO，磁力攪拌至溶解完全。再依次加入36.65mg(0.3mmol )DMAP和0.1212g(0.3mmol)DOTAA，于室溫下反應(yīng)24h ο向反應(yīng)后的溶液中加入1mL丙酮，離心，用丙酮洗滌產(chǎn)物，于50 °C下真空干燥I Oh，得到固體粉末。
[0043](3)稱取0.3338g(0.15mmol)步驟(2)中所得固體粉末溶解于20mL去離子水中，不斷攪拌下緩慢加入0.2031g(0.45mmol)Gd(N03)3.6H2O，溶液于室溫下攪拌8h，真空濃縮，加入1mL無水乙醇沉淀，用乙醇和乙醚洗滌產(chǎn)物，過濾，于35°C下真空干燥12h，得到熒光/MRI雙模態(tài)成像探針。
[0044]實施例5
[0045](I)稱取聚合度為11的低聚殼聚糖0.4158g(0.21mmol)置于10mL圓底燒瓶中，加入12mL無水DMS0，于65°C下攪拌直至溶解。分別稱取0.14838(0.211111101)075.5和0.03838(0.2mmol)EDC加入到上述溶液中，室溫避光反應(yīng)25h。向反應(yīng)后的溶液中加入18mL丙酮，離心，用丙酮洗滌產(chǎn)物，于30°C下真空干燥1h，得到固體粉末。
[0046](2)稱取0.2722g(0.1mmol)步驟(I)中所得固體粉末于50mL圓底燒瓶中，加入5mLDMSO，磁力攪拌至溶解完全。再依次加入13.44mg(0.1 lmmol)DMAP和0.0256g(0.1mmol)EDTAA，于室溫下反應(yīng)20h ο向反應(yīng)后的溶液中加入25mL丙酮，離心，用丙酮洗滌產(chǎn)物，于55 °C下真空干燥9h，得到固體粉末。
[0047](3)稱取0.3573g(0.12mmol)步驟(2)中所得固體粉末溶解于30mL去離子水中，不斷攪拌下緩慢加入0.0335g(0.15mmol)MnS04.4出0，溶液于室溫下攪拌8h，真空濃縮，加入30mL無水乙醇沉淀，用乙醇和乙醚洗滌產(chǎn)物，過濾，于55°C下真空干燥9h，得到熒光/MRI雙模態(tài)成像探針。
【主權(quán)項】
1.一種熒光/MRI雙模態(tài)成像探針的合成方法，其特征在于，具體步驟如下:步驟1、向低聚殼聚糖中加入10?30mL無水DMSO，于50?70 °C下攪拌直至溶解;分別稱 取Cy5.5和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽加入到上述溶液中，室溫避光反 應(yīng)18?36h;向反應(yīng)后的溶液中加入10?30mL丙酮，離心，用丙酮洗滌產(chǎn)物，真空干燥，得到 固體粉末；步驟2、稱取步驟1中所得到的固體粉末，向固體粉末中加入5?15mL DMSO，磁力攪拌至 溶解完全;再依次加入4-二甲氨基吡啶和多胺多酸酸酐，于室溫下反應(yīng)20?48h;向反應(yīng)后 的溶液中加入1 〇?30mL丙酮，離心，用丙酮洗滌產(chǎn)物，真空干燥，得到固體粉末；步驟3、稱取步驟2所得到的固體粉末溶解于10?50mL去離子水中，不斷攪拌下緩慢加 入順磁性金屬鹽，溶液于室溫下攪拌6?1 Oh，真空濃縮，加入10?40mL無水乙醇沉淀，用乙 醇和乙醚洗滌產(chǎn)物，過濾，真空干燥，得到熒光/MRI雙模態(tài)成像探針。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種熒光/MRI雙模態(tài)成像探針的合成方法，其特征在于，步驟 1中，所使用的低聚殼聚糖的聚合度為6、8、11或20。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種熒光/MRI雙模態(tài)成像探針的合成方法，其特征在于，步驟 1中，低聚殼聚糖、Cy5.5、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽與無水DMSO的用 量比為1 ?1 ? lmmol: lmmol: lmmol: 20?60mL〇4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種熒光/MRI雙模態(tài)成像探針的合成方法，其特征在于，步驟 2中，所述的多胺多酸酸酐是二乙三胺五乙酸酸酐或1，4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷_1，4,7,10-四乙酸酸酐或乙二胺四乙酸酸酐。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種熒光/MRI雙模態(tài)成像探針的合成方法，其特征在于，步驟 2中，加入的固體粉末、4-二甲氨基吡啶、多胺多酸酸酐與DMSO的用量比為lmmol: 1? 1.2mmol: lmmol: 50~150mL〇6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種熒光/MRI雙模態(tài)成像探針的合成方法，其特征在于，步驟 3中，所述的順磁性金屬鹽為Gd、Mn或Fe的硝酸鹽、氯化鹽、硫酸鹽或醋酸鹽中的一種。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種熒光/MRI雙模態(tài)成像探針的合成方法，其特征在于，步驟 3中，加入的固體粉末、順磁性金屬鹽與去離子水的用量比為lmmol: 1?4mmol: 100?500mL。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種熒光/MRI雙模態(tài)成像探針的合成方法，其特征在于，步驟 1中，所述的真空干燥溫度為30?45°C，干燥時間為6?10h;步驟2中，所述的真空干燥溫度 為35?60°C，干燥時間為8?12h;步驟3中，所述的真空干燥溫度為35?60°C，干燥時間為8 ?12h〇
【文檔編號】A61K49/08GK105999304SQ201610302365
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年5月9日
【發(fā)明人】黃燕, 張岐, 張小燕, 華明清, 李華明, 朱衛(wèi)華
【申請人】江蘇大學(xué)