一種篩選具有調(diào)節(jié)斑馬魚胃腸動力活性化合物的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種篩選具有調(diào)節(jié)斑馬魚胃腸動力活性化合物的方法。該方法包括胚胎準(zhǔn)備、藥物處理、活體標(biāo)記、實(shí)驗(yàn)結(jié)果影像采集和結(jié)果分析及統(tǒng)計(jì)。本發(fā)明首次利用鈣黃綠素作為熒光標(biāo)記物對斑馬魚胃腸道進(jìn)行標(biāo)記，通過對斑馬魚胃腸道蠕動次數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，進(jìn)行胃腸道活性藥物的篩選；通過對相關(guān)條件的優(yōu)化，獲得了穩(wěn)定可靠、成功率高和重復(fù)性好的篩選方法；對高通量篩選調(diào)節(jié)胃腸動力化合物具有重要意義。
【專利說明】
-種篩選具有調(diào)節(jié)斑馬魚胃腸動力活性化合物的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種篩選具有調(diào)節(jié)斑馬魚胃腸動力活性化合物的方法，特別設(shè)及一種 巧黃綠素為標(biāo)記物的篩選調(diào)節(jié)胃腸道動力化合物的方法，屬于藥物篩選技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 胃腸運(yùn)動功能是消化道最主要的功能之一，其調(diào)節(jié)機(jī)制非常復(fù)雜。自改革開放W 來，隨著經(jīng)濟(jì)的高速發(fā)展，社會競爭的日趨激烈，人們生活節(jié)奏的加快和工作壓力的增大而 導(dǎo)致的胃腸動力障礙性疾病問題日漸普遍。截至目前為止，胃腸動力障礙性疾病已成為臨 床的常見病和多發(fā)病。在日常醫(yī)療工作中，約50%的患者會因消化道問題就診，而其中約 30%-40%的患者最終會被確診為腸動力障礙。胃腸動力障礙性疾病主要的病理過程包括 胃腸協(xié)調(diào)運(yùn)動素亂、胃排空延遲和小腸排空減慢等。其發(fā)病機(jī)制可能與飲食、神經(jīng)屯、理、神 經(jīng)激素、胃酸和幽口螺旋桿菌感染等因素相關(guān)。胃腸動力障礙性疾病多屬于功能性疾病，且 目前尚無特效治療方法，患者每年均需花費(fèi)高額的治療費(fèi)用，且其生活質(zhì)量亦受到不同程 度的影響。因此如何W快速且有效的活體方法來篩選新型促胃腸動力藥物，將具有非常重 要的社會效益和廣闊的市場前景。
[0003] 目前篩選促胃腸動力藥物的研究中，主要利用（1)離體器官進(jìn)行藥物篩選，觀察受 試物對離體胃、腸平滑肌等的影響，得到大量初步的結(jié)果。再利用（2)小型哺乳動物進(jìn)行二 次驗(yàn)證，即利用影像技術(shù)觀察活體動物的胃腸動力;或是將實(shí)驗(yàn)動物處死后，檢測受試物對 實(shí)驗(yàn)動物胃排空、腸推動等的影響，從而驗(yàn)證大量初步結(jié)果。W上過程相當(dāng)緩慢且成本較 高，加上離體器官缺少周圍神經(jīng)反饋，無法準(zhǔn)確模擬胃腸運(yùn)動，不能準(zhǔn)確反應(yīng)藥物在體內(nèi)微 環(huán)境下的活性，無法系統(tǒng)性解釋藥物毒性及活性;而小型哺乳動物模型又無法快速地驗(yàn)證 其結(jié)果，且不適合高通量篩選。因此造成胃腸動力藥物大量篩選出現(xiàn)了一個很大的斷層。
[0004] 斑馬魚(Daniorerio)是一種小型熱帶淡水魚，屬于經(jīng)科，是一種理想的脊椎模式 生物，現(xiàn)已被美國國家衛(wèi)生研究院列為繼人類和小鼠之后的第Ξ大模式生物。斑馬魚與人 類在基因水平具有高達(dá)87%的同源性，約70%的人類基因至少有一個明顯的斑馬魚同源基 因。在信號通路傳導(dǎo)、蛋白質(zhì)功能和生理結(jié)構(gòu)等方面，斑馬魚與人類相比也表現(xiàn)出很高的保 守性。與其他哺乳動物模型比，斑馬魚產(chǎn)卵量高，發(fā)育周期短，藥物用量少，可重復(fù)性強(qiáng)，可 直觀地反應(yīng)出藥物的治療效果及毒副作用，更適用于大規(guī)模的化合物篩選研究。
[0005] 斑馬魚胃腸道在細(xì)胞功能和解剖學(xué)方面與人類相似，均由內(nèi)皮細(xì)胞、結(jié)締組織、外 縱肌和環(huán)狀肌組成。斑馬魚胚胎發(fā)育至26-126hpf，其腸道的管腔形成，并不斷生長，內(nèi)胚層 分化形成有功能的腸道上皮。在未喂食情況下，斑馬魚胚胎發(fā)育至72hpf，腸道首次出現(xiàn)不 穩(wěn)定的自發(fā)收縮。伴隨著發(fā)育的進(jìn)行，第120-144hpf，大部分卵黃囊被吸收，斑馬魚腸道自 發(fā)的蠕動及攝食能力增強(qiáng)。由于早期發(fā)育階段斑馬魚全身透明，因此方便由透明的斑馬魚 胚胎進(jìn)行胃腸動力觀察。
[0006] 中國專利文獻(xiàn)CN103301480A(申請?zhí)?01310181252.4)公開了一種斑馬魚腸蠕動 模型的建立方法及篩選促胃腸動力藥物的方法，包括（1)斑馬魚選??；（2)模型誘導(dǎo)及化合 物處理；（3)巧光顯微鏡定量分析。該方法選擇斑馬魚作為實(shí)驗(yàn)動物，利用尼羅紅作為染料 標(biāo)記其胃腸道，通過計(jì)算促腸蠕動排空率來研究胃腸蠕動情況。在該發(fā)明中，發(fā)明人優(yōu)選的 尼羅紅染料標(biāo)記斑馬魚胃腸道的時(shí)間為16h。因此應(yīng)用該方法研究胃腸蠕動時(shí)，整個實(shí)驗(yàn)周 期較長。除此之外，2016年發(fā)表于南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)的《過度喂養(yǎng)建立斑馬魚幼魚肥胖模 型》一文中，作者發(fā)現(xiàn)尼羅紅可W活體標(biāo)記斑馬魚肝臟、膜腺等臟器內(nèi)的脂肪細(xì)胞。由此可 知，尼羅紅染料可經(jīng)斑馬魚胃腸道吸收，進(jìn)入其體內(nèi)。因此中國專利文獻(xiàn)CN103301480A中定 義的一一尼羅紅染色后計(jì)算促腸蠕動排空率，并不能準(zhǔn)確反應(yīng)胃腸道蠕動情況。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種基于巧黃綠素為標(biāo)記物的篩選影響斑馬魚 胃腸動力的化合物的方法。本發(fā)明可W方便、高效且快速的對影響胃腸動力的化合物進(jìn)行 定量評價(jià)。
[0008] 本發(fā)明技術(shù)方案如下：
[0009] -種篩選具有調(diào)節(jié)斑馬魚胃腸動力活性化合物的方法，步驟如下：
[0010] (1)將斑馬魚受精卵置于培養(yǎng)容器中的胚胎培養(yǎng)水中，解育108~132小時(shí)，挑選健 康的斑馬魚胚胎，隨機(jī)分組為受試組、陽性對照組和溶劑對照組；
[0011] (2)向受試組斑馬魚胚胎的胚胎培養(yǎng)水中加入溶解于溶劑中的待篩選藥物，向陽 性對照組斑馬魚胚胎的胚胎培養(yǎng)水中加入陽性對照藥物，向溶劑對照組斑馬魚胚胎的胚胎 培養(yǎng)水中加入溶劑，繼續(xù)解育20~28小時(shí)；
[0012] (3)吸除受試組、陽性對照組和溶劑對照組中的液體，加入質(zhì)量濃度為0.15~ 0.25 %的巧黃綠素溶液，23~27 °C標(biāo)記8~12min，吸除液體，胚胎培養(yǎng)水清洗；
[OOU] (4)將受試組、陽性對照組和溶劑對照組的斑馬魚胚胎進(jìn)行麻醉，利用圖像采集工 具，對斑馬魚胚胎中顯示黃綠巧光的胃腸道部分進(jìn)行影像采集，得到受試組斑馬魚胚胎、陽 性對照組斑馬魚胚胎和溶劑對照組斑馬魚胚胎的胃腸道蠕動影像；
[0014] (5)根據(jù)步驟(4)采集的影像，分別在相同時(shí)間內(nèi)對受試組、陽性對照組和溶劑對 照組的斑馬魚胚胎的胃腸道蠕動次數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)，并利用T檢驗(yàn)對斑馬魚胃腸道的蠕動能力 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；
[0015] 當(dāng)受試組的胃腸道蠕動次數(shù)高于溶劑對照組，且T檢驗(yàn)結(jié)果顯示P《0.05,則差異 顯著，待篩選藥物具有顯著促進(jìn)胃腸道蠕動的作用；
[0016] 當(dāng)受試組的胃腸道蠕動次數(shù)高于溶劑對照組，且T檢驗(yàn)結(jié)果顯示P《0.01，則差異 非常顯著，待篩選藥物具有非常顯著促進(jìn)胃腸道蠕動的作用；
[0017] 當(dāng)受試組的胃腸道蠕動次數(shù)低于溶劑對照組，且T檢驗(yàn)結(jié)果顯示P《0.05,則差異 顯著，待篩選藥物具有顯著抑制胃腸道蠕動的作用；
[0018] 當(dāng)受試組的胃腸道蠕動次數(shù)低于溶劑對照組，且T檢驗(yàn)結(jié)果顯示P《0.01，則差異 非常顯著，待篩選藥物具有非常顯著抑制胃腸道蠕動的作用；
[0019] 當(dāng)受試組與溶劑對照組的胃腸道蠕動次數(shù)經(jīng)T檢驗(yàn)后，結(jié)果顯示P〉0.05，則統(tǒng)計(jì)學(xué) 上差異不顯著，待篩選藥物對胃腸道蠕動沒有作用。
[0020] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟（1)中培養(yǎng)容器為標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格的6孔或12孔細(xì)胞培養(yǎng) 板。
[0021] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟（1)中斑馬魚受精卵為健康成年AB系斑馬魚交配后 產(chǎn)出的受精卵。
[0022] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(1)和步驟(2)中的解育條件為:27~29°C，光照13~ 15小時(shí)/黑暗9~11小時(shí)的控光環(huán)境;進(jìn)一步優(yōu)選的，解育條件為:28°C，光照14小時(shí)/黑暗10 小時(shí)的控光環(huán)境；
[0023] 優(yōu)選的，所述胚胎培養(yǎng)水組分如下：
[0024] NaCl 5mM，KCl 0.17mM，CaCl2 0.4mM，MgS〇4 0.16mM，去離子水配制。
[002引根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(1)中解育時(shí)間為120小時(shí)。
[0026] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟（1)中隨機(jī)分組的條件為每組不低于15條斑馬魚胚 胎。
[0027] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(2)中陽性藥物為促進(jìn)胃腸道蠕動的陽性對照藥物 或者抑制胃腸道蠕動的陽性對照藥物；
[00%]進(jìn)一步優(yōu)選的，促進(jìn)胃腸道蠕動的陽性對照藥物為多潘立酬(Domperidonum)或是 鹽酸依托必利（11〇91'1(10曲化〇(3111〇1'1(1611:〇91'1(16);抑制胃腸道蠕動的陽性對照藥物為鹽 酸洛贓下胺（loperamide hy化ochloride)。
[0029] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(2)中溶劑為二甲基亞諷、甲醇或水。
[0030] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(3)中巧黃綠素的質(zhì)量濃度為0.2%;
[00川優(yōu)選的，所述步驟(3)中標(biāo)記的溫度為25 °C，時(shí)間為1 Omin，環(huán)境為避光。
[0032] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(3)中胚胎培養(yǎng)水清洗2~3次。胚胎培養(yǎng)水清洗斑馬 魚胚胎2~3次后看不到各培養(yǎng)孔中巧黃綠素的黃綠色巧光。
[0033] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟（4)中麻醉為采用質(zhì)量濃度為0.02%的Ξ卡因 (t;ricaine，eth5d 3-aminobenzoate methanesulfonate)進(jìn)行麻醉。在該條件下麻醉，斑馬 魚胚胎完全進(jìn)入麻醉狀態(tài)，但其胃腸蠕動能力尚未受到影響。
[0034] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(4)中影像采集工具為巧光顯微鏡或激光共聚焦顯 微鏡；
[0035] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(5)中計(jì)數(shù)的時(shí)間為Imin。
[0036] 有益效果
[0037] 1、本發(fā)明首次利用巧黃綠素作為巧光標(biāo)記物對斑馬魚胃腸道進(jìn)行標(biāo)記，通過對斑 馬魚胃腸道蠕動次數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，進(jìn)行胃腸道活性藥物的篩選;通過對相關(guān)條件的優(yōu)化， 獲得了穩(wěn)定可靠、成功率高和重復(fù)性好的篩選方法；
[0038] 2、本發(fā)明所述篩選具有調(diào)節(jié)斑馬魚胃腸動力活性化合物的方法，該方法不僅具有 成本低、操作簡便的優(yōu)點(diǎn)，而且具有靈敏度高、篩選速度快、高通量性等優(yōu)點(diǎn)，可W準(zhǔn)確反應(yīng) 藥物在體內(nèi)微環(huán)境下的活性，應(yīng)用前景廣闊。
【附圖說明】
[0039] 圖1為不同濃度多潘立酬處理斑馬魚后，巧黃綠素胃腸道標(biāo)記后的照片；
[0040] 圖中：A-C為溶劑對照組:A為巧光條件下巧黃綠素胃腸道標(biāo)記照片;B為可見光下 巧黃綠素胃腸道標(biāo)記照片;C為巧光與可見光同時(shí)存在下巧黃綠素胃腸道標(biāo)記照片；
[0041] D-F為多潘立酬溶液濃度lOyg/mL的處理組:D為巧光條件下巧黃綠素胃腸道標(biāo)記 照片;E為可見光下巧黃綠素胃腸道標(biāo)記照片;F為巧光與可見光同時(shí)存在下巧黃綠素胃腸 道標(biāo)記照片；
[0042] G-I為多潘立酬溶液濃度30yg/mL的處理組:G為巧光條件下巧黃綠素胃腸道標(biāo)記 照片;Η為可見光下巧黃綠素胃腸道標(biāo)記照片；I為巧光與可見光同時(shí)存在下巧黃綠素胃腸 道標(biāo)記照片；
[0043] J-L為多潘立酬溶液濃度50yg/mL的處理組:J為巧光條件下巧黃綠素胃腸道標(biāo)記 照片;K為可見光下巧黃綠素胃腸道標(biāo)記照片；L為巧光與可見光同時(shí)存在下巧黃綠素胃腸 道標(biāo)記照片。
[0044] 圖2為不同濃度多潘立酬溶液處理后，斑馬魚胃腸道蠕動能力的統(tǒng)計(jì)柱狀圖；
[0045] 圖中：*表示pi<0.05;**表示pKO.Ol。
[0046] 圖3為不同濃度鹽酸洛贓下胺處理斑馬魚后，巧黃綠素胃腸道標(biāo)記照片；
[0047] 圖中：A-C為溶劑對照組:A為巧光條件下巧黃綠素胃腸道標(biāo)記照片;B為可見光下 巧黃綠素胃腸道標(biāo)記照片;C為巧光與可見光同時(shí)存在下巧黃綠素胃腸道標(biāo)記照片；
[004引D-F為鹽酸洛贓下胺溶液濃度扣g/mL的處理組:D為巧光條件下巧黃綠素胃腸道標(biāo) 記照片;E為可見光下巧黃綠素胃腸道標(biāo)記照片;F為巧光與可見光同時(shí)存在下巧黃綠素胃 腸道標(biāo)記照片；
[0049] G-I為鹽酸洛贓下胺溶液濃度lOyg/mL的處理組:G為巧光條件下巧黃綠素胃腸道 標(biāo)記照片;Η為可見光下巧黃綠素胃腸道標(biāo)記照片；I為巧光與可見光同時(shí)存在下巧黃綠素 胃腸道標(biāo)記照片。
[0050] 圖4為不同濃度鹽酸洛贓下胺溶液處理后，斑馬魚胃腸道蠕動能力統(tǒng)計(jì)柱狀圖； [0化1] 圖中：*表示ρι<0.05。
[0052] 圖5為不同濃度阿司匹林處理斑馬魚后，巧黃綠素胃腸道標(biāo)記照片；
[0053] 圖中：A-C為溶劑對照組:A為巧光條件下巧黃綠素胃腸道標(biāo)記照片；Β為可見光下 巧黃綠素胃腸道標(biāo)記照片;C為巧光與可見光同時(shí)存在下巧黃綠素胃腸道標(biāo)記照片；
[0054] D-F為多潘立酬溶液處理濃度50yg/mL的陽性對照組:D為巧光條件下巧黃綠素胃 腸道標(biāo)記照片;E為可見光下巧黃綠素胃腸道標(biāo)記照片;F為巧光與可見光同時(shí)存在下巧黃 綠素胃腸道標(biāo)記照片；
[0055] G-I為阿司匹林溶液濃度30yg/mL的處理組:G為巧光條件下巧黃綠素胃腸道標(biāo)記 照片;Η為可見光下巧黃綠素胃腸道標(biāo)記照片；I為巧光與可見光同時(shí)存在下巧黃綠素胃腸 道標(biāo)記照片；
[0056] J-L為阿司匹林溶液濃度50yg/mL的處理組:J為巧光條件下巧黃綠素胃腸道標(biāo)記 照片;K為可見光下巧黃綠素胃腸道標(biāo)記照片；L為巧光與可見光同時(shí)存在下巧黃綠素胃腸 道標(biāo)記照片；
[0057] M-0為阿司匹林溶液濃度l(K)yg/mL的處理組:Μ為巧光條件下巧黃綠素胃腸道標(biāo)記 照片;Ν為可見光下巧黃綠素胃腸道標(biāo)記照片;0為巧光與可見光同時(shí)存在下巧黃綠素胃腸 道標(biāo)記照片。
[0058] 圖6為不同濃度阿司匹林溶液處理后，斑馬魚胃腸道蠕動能力統(tǒng)計(jì)柱狀圖；
[0059] 圖中：陽性對照為多潘立酬溶液濃度50yg/mL的處理組，*表示八0.05;**表示八 0.01。
【具體實(shí)施方式】：
[0060]下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步闡述，但本發(fā)明所保護(hù)范圍不限于 此。
[0061 ] 實(shí)驗(yàn)動物:所用野生型AB系健康斑馬魚，購自國家斑馬魚資源中屯、，雌雄斑馬魚在 28°C，14h光照/1化黑暗條件下分開養(yǎng)殖，每日于9:30(am)和4:30(pm)分別喂食兩次豐年 蟲。用卵時(shí)，于前日將健康成熟斑馬魚按雌雄比1:1或1:2的比例放入交配缸內(nèi)，中間放置隔 板，置于黑暗環(huán)境中，次日亮燈前抽去隔板，光照刺激使其排卵。排卵后半小時(shí)將成魚拱出， 使排卵時(shí)間控制在半小時(shí)內(nèi)，W降低胚胎間發(fā)育時(shí)間的差異。收集受精卵，并用新培養(yǎng)水沖 洗3遍，對受精卵進(jìn)行消毒和清洗，隨后將受精卵置于28°C培養(yǎng)箱內(nèi)，保持14h光照/1化黑暗 周期培養(yǎng)，中間每2地?fù)Q約1/^3水，并及時(shí)吸出死亡胚胎。
[0062] 試劑配制：阿司匹林標(biāo)準(zhǔn)品購自中國食品藥品檢定研究院；多潘立酬標(biāo)準(zhǔn)品購自 加拿大TRC公司；鹽酸洛贓下胺標(biāo)準(zhǔn)品購自德國DR Ehrentorfer公司。W上Ξ種標(biāo)準(zhǔn)品均用 二甲基亞楓(DMS0)溶解后，配制為1 Omg/mL的儲液。
[0063] 胚胎培養(yǎng)水組分如下：
[0064] NaCl 5mM，KCl 0.17mM，CaCl2 0.4mM，MgS〇4 0.16mM，去離子水配制。
[0065] 實(shí)施例1:多潘立酬對斑馬魚胃腸蠕動的影響
[0066] 1.斑馬魚胚胎的獲得與使用
[0067] 采用健康性成熟的AB系斑馬魚，按雌雄1:1或1:2的比例放入交配缸內(nèi)，中間放置 隔板，置于黑暗環(huán)境中，次日亮燈前抽去隔板，光照刺激使其排卵，排卵半小時(shí)后將成魚拱 出，將排卵時(shí)間控制在半小時(shí)內(nèi)，W降低胚胎間發(fā)育時(shí)間的差異。收集受精卵，并用新的斑 馬魚胚胎培養(yǎng)水沖洗3遍，對受精卵進(jìn)行消毒和清洗;隨后將受精卵移入干凈的斑馬魚胚胎 培養(yǎng)用水中，并向所述培養(yǎng)水中加入0.化pm亞甲基藍(lán)，28°C下、14h光照/1化黑暗周期下，控 光培養(yǎng)，中間每24h換約水，并及時(shí)吸出死亡胚胎。將出生后5天的斑馬魚置于解剖鏡下， 選取發(fā)育正常的斑馬魚胚胎，放入6孔板中，每孔20尾，每組3個平行孔。
[006引 2.化合物處理
[0069] 設(shè)置四個實(shí)驗(yàn)組：1個溶劑對照組，3個多潘立酬處理組。移除6孔板中的胚胎培養(yǎng) 水，溶劑對照組加入6ml含體積濃度0.5%二甲基亞諷的培養(yǎng)水溶液;多潘立酬處理組6ml培 養(yǎng)水中分別加入濃度為10yg/mL、30yg/mL和50yg/mL的多潘立酬溶液，由培養(yǎng)水與相應(yīng)濃度 的多潘立酬儲液配制獲得;將W上各實(shí)驗(yàn)組斑馬魚胚胎分別放入28°C恒溫培養(yǎng)箱中，14h光 照/1化黑暗周期下培養(yǎng)24小時(shí)。
[0070] 3.活體標(biāo)記
[0071] 施藥24小時(shí)后，將上述四組6孔板中的藥液吸除，加入質(zhì)量濃度為0.2%的巧黃綠 素溶液，25°C條件下，恒溫避光解育斑馬魚胚胎lOmirulOmin標(biāo)記結(jié)束后，將巧黃綠素溶液 吸除，加胚胎培養(yǎng)水清洗各組斑馬魚胚胎3次，至看不到各培養(yǎng)孔中巧黃綠素的黃綠色巧光 為止。
[0072] 4.實(shí)驗(yàn)結(jié)果影像采集
[0073] 利用質(zhì)量濃度為0.02%的Ξ卡因溶液將上述四組斑馬魚胚胎麻醉。在巧光顯微鏡 下采集斑馬魚胚胎中顯示黃綠巧光的胃腸道蠕動影像，結(jié)果如圖1所示。
[0074] 5.結(jié)果分析及統(tǒng)計(jì)
[00巧]根據(jù)采集影像，在Imin內(nèi)分別對溶劑對照組、1化g/mL、30yg/mL和50yg/mL的多潘 立酬溶液處理組的斑馬魚胚胎的胃腸道蠕動次數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。結(jié)果顯示，溶劑對照組Imin內(nèi) 胃腸道平均蠕動次數(shù)為11.5; Ξ種濃度多潘立酬藥物處理組（1化g/mL、30yg/mL和50yg/mL) 的斑馬魚胃腸道Imin內(nèi)平均蠕動次數(shù)分別為:12、15和21.3，如表1所示。
[0076] 表 1
[0077]
[007引 注：*表不 f)〈0.05;林表不 f)〈0.01;
[0079] 由表1可W看出，隨著多潘立酬濃度的增加，斑馬魚的胃腸道蠕動能力增加。
[0080] 利用T檢驗(yàn)對斑馬魚胃腸道的蠕動能力進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果顯示多潘立酬藥物 濃度為3〇yg/血時(shí)，與溶劑對照組(0.5%二甲基亞諷)相比較，其胃腸道蠕動能力顯著增加， 且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<〇. 05)，如圖2所示;多潘立酬藥物濃度為50yg/mL時(shí)，與溶劑對照 組(0.5%二甲基亞諷處理組)相比較，斑馬魚胃腸道蠕動能力增加更為明顯，且具有非常顯 著的差異(P<〇.01)，如圖2所示。
[0081 ] 實(shí)施例2:鹽酸洛贓下胺對斑馬魚胃腸蠕動的影響
[0082] 1.斑馬魚胚胎的獲得與使用
[0083] 采用健康性成熟的AB系斑馬魚，按雌雄1:1或1:2的比例放入交配缸內(nèi)，中間放置 隔板，置于黑暗環(huán)境中，次日亮燈前抽去隔板，光照刺激使其排卵，排卵半小時(shí)后將成魚拱 出，將排卵時(shí)間控制在半小時(shí)內(nèi)，W降低胚胎間發(fā)育時(shí)間的差異。收集受精卵，并用新的斑 馬魚胚胎培養(yǎng)水沖洗3遍，對受精卵進(jìn)行消毒和清洗;隨后將受精卵移入干凈的斑馬魚胚胎 培養(yǎng)用水中，并向所述培養(yǎng)水中加入0.化pm亞甲基藍(lán)，28°C、14h光照/1化黑暗周期下控光 培養(yǎng)，中間每2地?fù)Q約1/^3水，并及時(shí)吸出死亡胚胎。將出生后5天的斑馬魚置于解剖鏡下，選 取發(fā)育正常的斑馬魚胚胎，放入6孔板中，每孔20尾，每組3個平行孔。
[0084] 2.化合物處理
[00化]設(shè)置四個實(shí)驗(yàn)組：1個溶劑對照組，3個鹽酸洛贓下胺處理組。移除6孔板中的培養(yǎng) 水，溶劑對照組加入6ml含體積濃度0.5 %二甲基亞諷的培養(yǎng)水溶液，鹽酸洛贓下胺處理組 6ml培養(yǎng)水中分別加入濃度為扣g/mL、10yg/mL和30yg/mL的鹽酸洛贓下胺溶液，由培養(yǎng)水與 相應(yīng)濃度的多潘立酬儲液配制獲得;將W上各實(shí)驗(yàn)組斑馬魚胚胎分別放入28°C恒溫培養(yǎng)箱 中，1地光照/1化黑暗周期下培養(yǎng)24小時(shí)。
[00化]3.活體標(biāo)記
[0087]施藥24小時(shí)后，將上述四組6孔板中的藥液吸除，加入質(zhì)量濃度為0.2%的巧黃綠 素溶液;25°C條件下，恒溫避光解育斑馬魚胚胎lOmiriDlOmin標(biāo)記結(jié)束后，將巧黃綠素溶液 吸除，加胚胎培養(yǎng)水清洗各組斑馬魚胚胎2次，至看不到各培養(yǎng)孔中巧黃綠素的黃綠色巧光 為止。
[0088] 4.實(shí)驗(yàn)結(jié)果影像采集
[0089] 利用質(zhì)量濃度為0.02%的Ξ卡因溶液將上述四組斑馬魚胚胎麻醉。在巧光顯微鏡 下采集斑馬魚胚胎中顯示黃綠巧光的胃腸道蠕動影像，結(jié)果如圖3所示。
[0090] 5.結(jié)果分析及統(tǒng)計(jì)
[0091] 根據(jù)采集影像，在Imin內(nèi)對溶劑對照組、5yg/mL、lOyg/mL和30yg/mL的鹽酸洛贓下 胺溶液處理組的斑馬魚胚胎的胃腸道蠕動次數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果如表2所示。
[0092] 表 2
[0093]
[0094] 注:*表示 1)<0.05;
[00M]由表2可W看出，當(dāng)鹽酸洛贓下胺溶液濃度為30yg/mL時(shí)，6孔板中20條斑馬魚胚胎 全部死亡。運(yùn)表明在該濃度下，鹽酸洛贓下胺對斑馬魚胚胎具有較大毒害作用。但是鹽酸洛 贓下胺溶液濃度為扣g/mL和lOyg/mL時(shí)，20條斑馬魚胚胎正常存活。溶劑對照組Imin內(nèi)胃腸 道平均蠕動次數(shù)為11.7;5yg/mL鹽酸洛贓下胺藥物處理組，斑馬魚胃腸道Imin內(nèi)平均蠕動 次數(shù)為11.3; 1化g/mL鹽酸洛贓下胺藥物處理組，斑馬魚胃腸道Imin內(nèi)平均蠕動次數(shù)為8.2。
[0096] W上結(jié)果表明，在濃度小于30yg/mL時(shí)，隨著鹽酸洛贓下胺濃度的增加，斑馬魚的 胃腸道蠕動能力降低。利用T檢驗(yàn)對斑馬魚胃腸道的蠕動能力進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，鹽酸洛贓下 胺濃度為lOyg/mL時(shí)，與溶劑對照組(0.5 %二甲基亞諷處理組）相比較，斑馬魚胃腸道蠕動 能力顯著降低，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<〇.05)，結(jié)果如圖4所示。
[0097] 實(shí)施例3:阿司匹林對斑馬魚胃腸道蠕動的影響
[0098] 1.斑馬魚胚胎的獲得與使用
[0099] 采用健康性成熟的AB系斑馬魚，按雌雄1:1或1:2的比例放入交配缸內(nèi)，中間放置 隔板，置于黑暗環(huán)境中，次日亮燈前抽去隔板，光照刺激使其排卵，排卵半小時(shí)后將成魚拱 出，將排卵時(shí)間控制在半小時(shí)內(nèi)，W降低胚胎間發(fā)育時(shí)間的差異。收集受精卵，并用新的斑 馬魚胚胎培養(yǎng)水沖洗3遍，對受精卵進(jìn)行消毒和清洗;隨后將受精卵移入干凈的斑馬魚胚胎 培養(yǎng)用水中，并向所述培養(yǎng)水中加入0.化pm亞甲基藍(lán)，28 °C、14h光照/1化黑暗周期下，控光 培養(yǎng)。中間每2地?fù)Q約1/^3水，并及時(shí)吸出死亡胚胎。將出生后5天的斑馬魚置于解剖鏡下，選 取發(fā)育正常的斑馬魚胚胎，放入6孔板中，每孔20尾，每組3個平行孔。
[0100] 2.化合物處理
[0101] 設(shè)置六個實(shí)驗(yàn)組：1個溶劑對照組，1個陽性對照組，3個待測化合物處理組。移除6 孔板中的培養(yǎng)水，溶劑對照組加入6ml含體積濃度0.5 %二甲基亞諷的培養(yǎng)水溶液；陽性對 照組加入6ml含濃度為50yg/mL的多潘立酬培養(yǎng)水溶液;Ξ個待測化合物處理組分別在6ml 培養(yǎng)水中加入濃度為30yg/mL、50yg/mL和10化g/mL的阿司匹林溶液。將W上各實(shí)驗(yàn)組斑馬 魚胚胎分別放入28°C恒溫培養(yǎng)箱中，14h光照/1化黑暗周期下培養(yǎng)24小時(shí)。
[0102] 3.活體標(biāo)記
[0103] 施藥24小時(shí)后，將上述六組6孔板中的藥液吸除，加入質(zhì)量濃度為0.2%的巧黃綠 素溶液;25°C條件下，恒溫避光解育斑馬魚胚胎lOmirulOmin標(biāo)記結(jié)束后，將巧黃綠素溶液 吸除，加胚胎培養(yǎng)水清洗各組斑馬魚胚胎3次，至看不到各培養(yǎng)孔中巧黃綠素的黃綠色巧光 為止。
[0104] 4.實(shí)驗(yàn)結(jié)果影像采集
[0105] 利用質(zhì)量濃度為0.02%的Ξ卡因溶液將上述六組斑馬魚胚胎麻醉。在巧光顯微鏡 下采集斑馬魚胚胎中顯示黃綠巧光的胃腸道蠕動影像，結(jié)果如圖5所示。
[0106] 5.結(jié)果分析及統(tǒng)計(jì)
[0107] 根據(jù)采集影像，在Imin內(nèi)對溶劑對照組、陽性對照組和Ξ個濃度的阿司匹林處理 組(30yg/mL、50yg/血和100yg/mU的斑馬魚胚胎的胃腸道蠕動次數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)。結(jié)果顯示，溶 劑對照組和陽性對照組Imin內(nèi)胃腸道平均蠕動次數(shù)分別為10.2和21，Ξ種濃度阿司匹林處 理組(3化g/mL、50yg/mL和l(K)yg/mL)的斑馬魚胃腸道，Imin內(nèi)平均蠕動次數(shù)分別為11、13.3 和11.2,如表3所示。
[010引 表3 「01091
[0110]注:*表示pi<0.05;**表示pKO.Ol;
[011。 由表3可W看出，在阿司匹林濃度為30yg/mL和10化g/mL時(shí)，斑馬魚的胃腸道蠕動 能力未受明顯影響。利用T檢驗(yàn)對斑馬魚胃腸道的蠕動能力進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果顯示，阿 司匹林濃度為50yg/mL時(shí)，與溶劑對照組(0.5%二甲基亞諷處理組)相比較，斑馬魚的胃腸 道蠕動能力增加，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，結(jié)果如圖6所示。
[0112]由上述實(shí)施例的結(jié)果可W看出，與現(xiàn)有的篩選影響胃腸動力藥物的篩選技術(shù)相 比，本發(fā)明所述的基于活體斑馬魚的胃腸動力藥物篩選技術(shù)具有W下優(yōu)點(diǎn)：（1)首次利用巧 黃綠素將斑馬魚的胃腸道進(jìn)行了特異性標(biāo)記。標(biāo)記后的胃腸道清晰可見，便于結(jié)果觀察。 (2)巧黃綠素安全可靠。0.2%濃度下，該標(biāo)記物對活體動物不具毒害作用，標(biāo)記結(jié)束后活體 動物可W繼續(xù)培育，并不影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)。（3)巧黃綠素進(jìn)入體內(nèi)特異性標(biāo)記胃腸道，是通過 直接加入養(yǎng)魚水中進(jìn)行的，因此操作簡便。（4)巧黃綠素標(biāo)記斑馬魚胃腸道時(shí)間相對較短， 有效的縮短了實(shí)驗(yàn)周期。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種篩選具有調(diào)節(jié)斑馬魚胃腸動力活性化合物的方法，其特征在于，步驟如下： (1) 將斑馬魚受精卵置于培養(yǎng)容器中的胚胎培養(yǎng)水中，孵育108~132小時(shí)，挑選健康的 斑馬魚胚胎，隨機(jī)分組為受試組、陽性對照組和溶劑對照組； (2) 向受試組斑馬魚胚胎的胚胎培養(yǎng)水中加入溶解于溶劑中的待篩選藥物，向陽性對 照組斑馬魚胚胎的胚胎培養(yǎng)水中加入陽性對照藥物，向溶劑對照組斑馬魚胚胎的胚胎培養(yǎng) 水中加入溶劑，繼續(xù)孵育20~28小時(shí)； (3) 吸除受試組、陽性對照組和溶劑對照組中的液體，加入質(zhì)量濃度為0.15~0.25%的 鈣黃綠素溶液，23~27°C標(biāo)記8~12min，吸除液體，胚胎培養(yǎng)水清洗； (4) 將受試組、陽性對照組和溶劑對照組的斑馬魚胚胎進(jìn)行麻醉，利用圖像采集工具， 對斑馬魚胚胎中顯示黃綠熒光的胃腸道部分進(jìn)行影像采集，得到受試組斑馬魚胚胎、陽性 對照組斑馬魚胚胎和溶劑對照組斑馬魚胚胎的胃腸道蠕動影像； (5) 根據(jù)步驟⑷采集的影像，分別在相同時(shí)間內(nèi)對受試組、陽性對照組和溶劑對照組 的斑馬魚胚胎的胃腸道蠕動次數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)，并利用T檢驗(yàn)對斑馬魚胃腸道的蠕動能力進(jìn)行 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析； 當(dāng)受試組的胃腸道蠕動次數(shù)高于溶劑對照組，且T檢驗(yàn)結(jié)果顯示PS0.05,則差異顯著， 待篩選藥物具有顯著促進(jìn)胃腸道蠕動的作用； 當(dāng)受試組的胃腸道蠕動次數(shù)高于溶劑對照組，且T檢驗(yàn)結(jié)果顯示PS0.01，則差異非常 顯著，待篩選藥物具有非常顯著促進(jìn)胃腸道蠕動的作用； 當(dāng)受試組的胃腸道蠕動次數(shù)低于溶劑對照組，且T檢驗(yàn)結(jié)果顯示PS0.05,則差異顯著， 待篩選藥物具有顯著抑制胃腸道蠕動的作用； 當(dāng)受試組的胃腸道蠕動次數(shù)低于溶劑對照組，且T檢驗(yàn)結(jié)果顯示PS0.01，則差異非常 顯著，待篩選藥物具有非常顯著抑制胃腸道蠕動的作用； 當(dāng)受試組與溶劑對照組的胃腸道蠕動次數(shù)經(jīng)T檢驗(yàn)后，結(jié)果顯示P>0.05，則統(tǒng)計(jì)學(xué)上差 異不顯著，待篩選藥物對胃腸道蠕動沒有作用。2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟（1)中培養(yǎng)容器為標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格的6孔或 12孔細(xì)胞培養(yǎng)板； 優(yōu)選的，所述步驟(1)中斑馬魚受精卵為健康成年AB系斑馬魚交配后產(chǎn)出的受精卵。3. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟（1)和步驟(2)中的孵育條件為：27 ~29°C，光照13~15小時(shí)/黑暗9~11小時(shí)的控光環(huán)境;進(jìn)一步優(yōu)選的，孵育條件為:28°C，光 照14小時(shí)/黑暗10小時(shí)的控光環(huán)境； 優(yōu)選的，所述胚胎培養(yǎng)水組分如下： NaCl 5mM，KCl 0.17mM，CaCl2 0.4mM，MgS〇4 0.16mM，去離子水配制。4. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(1)中孵育時(shí)間為120小時(shí)； 優(yōu)選的，所述步驟(1)中隨機(jī)分組的條件為每組不低于15條斑馬魚胚胎。5. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)中陽性藥物為促進(jìn)胃腸道蠕動 的陽性對照藥物或者抑制胃腸道蠕動的陽性對照藥物； 進(jìn)一步優(yōu)選的，促進(jìn)胃腸道蠕動的陽性對照藥物為多潘立酮(Domperidonum)或是鹽酸 依托必利（Itopride Hydrochlorideltopride);抑制胃腸道懦動的陽性對照藥物為鹽酸洛 哌丁胺（loperamide hydrochloride)。6. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟（2)中溶劑為二甲基亞砜、甲醇或 水。7. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟（3)中鈣黃綠素的質(zhì)量濃度為 0.2% ； 優(yōu)選的，所述步驟(3)中標(biāo)記的溫度為25 °C，時(shí)間為lOmin，環(huán)境為避光； 優(yōu)選的，所述步驟(3)中胚胎培養(yǎng)水清洗2~3次。8. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟（4)中麻醉為采用質(zhì)量濃度為 0 · 02% 的三卡因（tricaine，ethyl 3-aminobenzoate 11161:11&1168111;1^〇仙七6)進(jìn)行麻醉。9. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(4)中影像采集工具為熒光顯微鏡 或激光共聚焦顯微鏡。10. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(5)中計(jì)數(shù)的時(shí)間為lmin。
【文檔編號】C12Q1/02GK105999303SQ201610285698
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年5月3日
【發(fā)明人】孫晨, 韓建, 張?jiān)? 何秋霞, 劉可春, 王希敏, 彭維兵, 楚杰
【申請人】山東省科學(xué)院生物研究所