本發(fā)明涉及一種結(jié)核感染的試劑盒，尤其涉及采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)來(lái)檢測(cè)包含潛伏期在內(nèi)的全程結(jié)核感染的試劑盒及其引物對(duì)和探針。
背景技術(shù)：
：從全球范圍來(lái)看，結(jié)核至今為止仍然是傳染病中發(fā)病率和死亡率最高的疾病之一，據(jù)估計(jì)每年新發(fā)病例約900，0000人，每年約有200，0000人死于結(jié)核病。結(jié)核病是由結(jié)核桿菌引起的一種人畜共患傳染病，是單一致病菌感染導(dǎo)致死亡率最高的感染性疾病。我國(guó)是結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家之一，2000年全國(guó)結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查資料顯示：全年齡組結(jié)核感染率為44.5％，活動(dòng)性結(jié)核患者451萬(wàn)，每年死亡人數(shù)達(dá)13萬(wàn)，結(jié)核病死亡占各種傳染病，寄生蟲(chóng)病死亡的65.1％，幾乎為其它各種傳染病、寄生蟲(chóng)病死亡總和的2倍。由于人類免疫缺陷病毒的廣泛傳播及耐藥結(jié)核分枝桿菌的日益增多，使得這一古老的疾病再次引起人們的廣泛關(guān)注。結(jié)核病成為危害人類健康的重要傳染病之一。由于診斷潛伏性結(jié)核感染的檢測(cè)方法研究進(jìn)展緩慢，導(dǎo)致結(jié)核疫情控制不佳。目前，全血γ-干擾素釋放試驗(yàn)(igra)已經(jīng)在歐美地區(qū)和日本等多個(gè)低結(jié)核疫情國(guó)家廣泛使用，igra采用起源于卡介苗接種菌及大多數(shù)非結(jié)核分枝桿菌所缺失的結(jié)核菌致病菌中的rd1-區(qū)所編碼的特異性刺激蛋白如esat-6和cfp-10來(lái)進(jìn)行檢測(cè)，該類刺激物已經(jīng)有商品化igra試劑，例如quantiferontbgoldtest和tspot.tbtest。有研究者在igra檢測(cè)中量化干擾素-γ(ifn-γ)mrna表達(dá)水平，將其作為ifn-γ指示物，但ifn-γrt-pcr的特異性和靈敏度較差，且無(wú)法鑒別活躍期和潛伏期結(jié)核感染(ltbi)。在中國(guó)，tst作為一種基于對(duì)結(jié)核菌衍生的純化蛋白(ppd)所產(chǎn)生的遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)的檢測(cè)方法仍然是用來(lái)診斷結(jié)核菌潛伏性感染(ltbi)的主要方法。tst的敏感度和特異度都依賴于一個(gè)特定群體中所定義的不同截?cái)嘀刀āＨ绻岣叻磻?yīng)硬結(jié)直徑截?cái)嘀堤禺惗染蜁?huì)增加(同時(shí)敏感度下降)。該實(shí)驗(yàn)的特異度變化很大而且主要依賴與非結(jié)核分支桿菌之間的交叉反應(yīng)的可能性而定。另外，tst不能區(qū)分陳舊感染與新近感染，與卡介苗及環(huán)境非結(jié)核分支桿菌之間存在交叉免疫而導(dǎo)致假陽(yáng)性，更由于在免疫抑制人群中檢測(cè)結(jié)果存在假陰性甚至可能導(dǎo)致誤診。重復(fù)tst反應(yīng)或者兩步法tst檢測(cè)可能導(dǎo)致助推效應(yīng)從而引起敏感度的增加。tst和igras均不能鑒別潛伏期和活動(dòng)期結(jié)核，而根除結(jié)核的關(guān)鍵之一在于鑒別潛伏性結(jié)核感染。因此，探索一種特異性強(qiáng)、靈敏度高的診斷潛伏性結(jié)核感染的檢測(cè)方法至關(guān)重要。實(shí)時(shí)熒光定量pcr(fq-pcr)是近年在普通pcr基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的核酸檢測(cè)方法，它將熒光值的積累與pcr產(chǎn)物的擴(kuò)增過(guò)程相結(jié)合，通過(guò)測(cè)量指數(shù)擴(kuò)增期的熒光值來(lái)計(jì)算待測(cè)樣本中核酸的原始量。其具有操作簡(jiǎn)便、耗時(shí)短、可定量等傳統(tǒng)方法無(wú)可比擬的優(yōu)點(diǎn)。另外，趨化因子是一類結(jié)構(gòu)功能相似，具有趨化吸引性的小分子量蛋白，其一級(jí)結(jié)構(gòu)十分相似，當(dāng)趨化因子與其相應(yīng)受體相結(jié)合后，通過(guò)激活g蛋白偶聯(lián)受體，產(chǎn)生級(jí)聯(lián)信號(hào)傳導(dǎo)，對(duì)多種炎性細(xì)胞趨化和激活，在呼吸系統(tǒng)、心血管和肝腎等疾病中起重要作用。比如，由活化的淋巴細(xì)胞分泌的下游趨化因子γ-干擾素在結(jié)核感染檢測(cè)中敏感度達(dá)80％。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是為克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的針對(duì)結(jié)核感染的檢測(cè)方法不能鑒別潛伏性結(jié)核感染以及現(xiàn)有檢測(cè)方法特異性或敏感度不強(qiáng)等缺陷，提供一種檢測(cè)包含潛伏期在內(nèi)的全病程結(jié)核感染的試劑盒、特別是熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(fq-pcr)試劑盒及其引物對(duì)和探針。該試劑盒具有操作簡(jiǎn)便、特異性強(qiáng)、靈敏度高、耗時(shí)短以及可定量等優(yōu)點(diǎn)，特別能夠檢測(cè)潛伏期和/或早期的結(jié)核感染。本發(fā)明人首先選擇結(jié)核感染、特別是潛伏結(jié)核感染時(shí)，活化的t細(xì)胞被激活時(shí)，特異的靶分子會(huì)發(fā)生上調(diào)，意外發(fā)現(xiàn)趨化因子cxcl9、cxcl11和cxcl13中的一種或兩種以上的組合均對(duì)于潛伏結(jié)核感染有較好的靈敏度和特異性。然后進(jìn)一步針對(duì)上述趨化因子挑選合適的檢測(cè)方法。由于與基于擴(kuò)增反應(yīng)完成后進(jìn)行單一終點(diǎn)檢測(cè)的傳統(tǒng)pcr方法不同，fq-pcr方法可以在擴(kuò)增反應(yīng)進(jìn)行的過(guò)程中隨時(shí)監(jiān)測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的產(chǎn)生，從而極大的提高了定量檢測(cè)的準(zhǔn)確性和精密度，故本發(fā)明優(yōu)選fq-pcr方法。實(shí)時(shí)熒光定量pcr(taqman探針?lè)?在pcr的擴(kuò)增中，同時(shí)加入了引物和在5’末端和3’末端分別標(biāo)記有熒光發(fā)生基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)的特異性寡核苷酸探針。如果探針沒(méi)有與靶序列互補(bǔ)結(jié)合，探針序列保持完整，熒光發(fā)生基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收，故沒(méi)有熒光信號(hào)的產(chǎn)生，而當(dāng)探針與靶序列能夠互補(bǔ)結(jié)合時(shí)，在pcr擴(kuò)增進(jìn)行的過(guò)程中，dna聚合酶在引導(dǎo)dna序列復(fù)制的同時(shí)其5’-3’端外切酶活性將切斷熒光探針，導(dǎo)致熒光發(fā)生基團(tuán)與熒光淬滅基團(tuán)的分離，從而熒光檢測(cè)系統(tǒng)可以接收并記錄熒光信號(hào)。每擴(kuò)增一條dna鏈即有一個(gè)熒光信號(hào)的產(chǎn)生，熒光信號(hào)的積累與pcr產(chǎn)物的形成完全同步，故可以實(shí)時(shí)地監(jiān)測(cè)整個(gè)pcr反應(yīng)過(guò)程，并可借助標(biāo)準(zhǔn)曲線或表達(dá)量恒定的內(nèi)對(duì)照產(chǎn)物對(duì)未知的靶多核苷酸進(jìn)行絕對(duì)或相對(duì)的定量分析。因此，探針和引物的設(shè)計(jì)對(duì)于實(shí)現(xiàn)靶多核苷酸的定量檢測(cè)至關(guān)重要。本發(fā)明人為此反復(fù)試驗(yàn)和研究，在特異性和敏感度等方面進(jìn)行平衡，篩選出了測(cè)定趨化因子cxcl9、cxcl11和cxcl13的相關(guān)引物對(duì)和探針。本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題的技術(shù)方案之一是：一種檢測(cè)包含潛伏期結(jié)核感染的試劑盒，其包括至少一種反應(yīng)液，所述反應(yīng)液包括目的基因的一引物對(duì)和一探針，所述的引物對(duì)和探針針對(duì)結(jié)核分枝桿菌特異性t細(xì)胞分泌的下游趨化因子cxcl9、cxcl11或cxcl13的基因序列設(shè)計(jì)；其中，針對(duì)趨化因子cxcl9設(shè)計(jì)的所述引物對(duì)的正向引物(引物1)是如seqidno.1所示序列的核酸，反向引物(引物2)是如seqidno.2所示序列的核酸，所述探針(探針1)的核苷酸序列如seqidno.9所示；針對(duì)趨化因子cxcl11設(shè)計(jì)的所述引物對(duì)的正向引物(引物3)是如seqidno.3所示序列的核酸，反向引物(引物4)是如seqidno.4所示序列的核酸，所述探針(探針2)的核苷酸序列如seqidno.10所示；或者針對(duì)趨化因子cxcl13設(shè)計(jì)的所述引物對(duì)的正向引物(引物5)是如seqidno.5所示序列的核酸，反向引物(引物6)是如seqidno.6所示序列的核酸，所述探針(探針3)的核苷酸序列如seqidno.11所示。其中，引物1位于人的cxcl9基因序列的197-221位，引物2位于289-265位，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為93bp，所對(duì)應(yīng)的探針位于234-260位；引物3位于人的cxcl11基因序列的113-136位，引物4位于255-230位，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為143bp，所對(duì)應(yīng)的探針位于184-211位；引物5位于人的cxcl13基因序列的199-224位，引物6位于314-293位，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為116bp，所對(duì)應(yīng)的探針位于226-249位。較佳地，使結(jié)果可靠，抗干擾能力更強(qiáng)，作為表達(dá)量參照，本發(fā)明選用管家基因作為內(nèi)部參照，優(yōu)選人β-globin(β-球蛋白)基因，所述的反應(yīng)液均還包括針對(duì)人β-globin基因設(shè)計(jì)的管家基因的一引物對(duì)和一探針；所述引物對(duì)中，正向引物(引物7)是如seqidno.7所示序列的核酸，反向引物(引物8)是如seqidno.8所示序列的核酸，所述探針(探針4)的核苷酸序列如seqidno.12所示。其中，引物7位于人β-globin基因組序列的hbb基因(62137-63742)的62627-62647位，引物8位于62756-62775位，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為149bp，所對(duì)應(yīng)的探針位于β-globin基因序列反向序列的62731-62755位。較佳地，所述的反應(yīng)液均還包括pcr反應(yīng)緩沖液和2’-脫氧核苷三磷酸；較佳地，所述2’-脫氧核苷三磷酸的濃度為100mm。本發(fā)明所述的試劑盒優(yōu)選為實(shí)時(shí)熒光定量pcr(fq-pcr)試劑盒。較佳地，上述試劑盒還可以包括普通pcr、熒光pcr、尤其fq-pcr的其他常規(guī)試劑：eztaq混合液和陰性質(zhì)控品等；所述eztaq混合液包括熱啟動(dòng)taq酶，濃度優(yōu)選1-5u/μl。更佳地，為提高血液樣本中趨化因子的含量，相應(yīng)地提高試劑盒檢測(cè)的靈敏度和特異性，所述試劑盒還可以包括結(jié)核抗原管和本底對(duì)照管，所述結(jié)合抗原管中包含抗原刺激物或其組合物；所述抗原刺激物或其組合物優(yōu)選抗原cfp10衍生肽、抗原esat6衍生肽、抗原ppe衍生肽以及抗原ag85a衍生肽中的至少一種。所述抗原cfp10衍生肽的氨基酸序列更優(yōu)選如seqidno.13所示，所述抗原esat6衍生肽的氨基酸序列更優(yōu)選如seqidno.14所示，所述抗原ppe衍生肽的氨基酸序列更優(yōu)選如seqidno.15所示，所述抗原ag85a衍生肽的氨基酸序列更優(yōu)選如seqidno.16所示。本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題的技術(shù)方案之二是：一種檢測(cè)包含潛伏期結(jié)核感染的探針，所述探針的核苷酸序列如seqidno.9、seqidno.10、seqidno.11或者seqidno.12所示。較佳地，上述探針為適用fq-pcr檢測(cè)的熒光探針，其上述序列的兩端連接的均為常規(guī)的熒光報(bào)告基團(tuán)和淬滅基團(tuán)。其中，目的基因(seqidno.9-11)報(bào)告基團(tuán)：fam；管家基因報(bào)告基團(tuán)(seqidno.12)：vic；目的基因和管家基因的淬滅基團(tuán)：bhqmgb)。本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題的技術(shù)方案之三是：一種檢測(cè)包含潛伏期結(jié)核感染的引物對(duì)，所述引物對(duì)的一條是如seqidno.1所示序列的核酸，另一條是如seqidno.2所示序列的核酸；所述引物對(duì)的一條是如seqidno.3所示序列的核酸，另一條是如seqidno.4所示序列的核酸；所述引物對(duì)的一條是如seqidno.5所示序列的核酸，另一條是如seqidno.6所示序列的核酸；或者所述引物對(duì)的一條是如seqidno.7所示序列的核酸，另一條是如seqidno.8所示序列的核酸。本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題的技術(shù)方案之四是：一種反應(yīng)液，其包括一引物對(duì)和一探針，所述的引物對(duì)和探針針對(duì)結(jié)核分枝桿菌特異性t細(xì)胞分泌的下游趨化因子cxcl9、cxcl11或cxcl13的基因序列設(shè)計(jì)；其中，針對(duì)趨化因子cxcl9設(shè)計(jì)的所述引物對(duì)的正向引物是如seqidno.1所示序列的核酸，反向引物是如seqidno.2所示序列的核酸，所述探針的核苷酸序列如seqidno.9所示；針對(duì)趨化因子cxcl11設(shè)計(jì)的所述引物對(duì)的正向引物是如seqidno.3所示序列的核酸，反向引物是如seqidno.4所示序列的核酸，所述探針的核苷酸序列如seqidno.10所示；或者針對(duì)趨化因子cxcl13設(shè)計(jì)的所述引物對(duì)的正向引物是如seqidno.5所示序列的核酸，反向引物是如seqidno.6所示序列的核酸，所述探針的核苷酸序列如seqidno.11所示。較佳地，所述反應(yīng)液均還包括作為表達(dá)量參照檢測(cè)管家基因人β-globin基因的管家基因的一引物對(duì)和一探針；所述引物對(duì)中，正向引物是如seqidno.7所示序列的核酸，反向引物是如seqidno.8所示序列的核酸，所述探針的核苷酸序列如seqidno.12所示。本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題的技術(shù)方案之四是：所述的探針、所述的引物對(duì)或者所述的反應(yīng)液在制備檢測(cè)包括潛伏期結(jié)核感染的試劑盒、優(yōu)選fq-pcr試劑盒中的應(yīng)用。較佳地，所述應(yīng)用為將上述試劑盒用于血液樣本的檢測(cè)。在符合本領(lǐng)域常識(shí)的基礎(chǔ)上，上述各優(yōu)選條件，可任意組合，即得本發(fā)明各較佳實(shí)例。本發(fā)明所用試劑和原料均市售可得。本發(fā)明的積極進(jìn)步效果在于：如上所述，為了檢測(cè)出臨床血液樣本是否為潛伏結(jié)核感染樣本，本發(fā)明將趨化因子cxcl9、cxcl11、cxcl13的核苷酸序列進(jìn)行分析，特別設(shè)計(jì)適用本發(fā)明檢測(cè)試劑盒的寡核苷酸引物和探針。使用這些引物和探針完成的實(shí)時(shí)定量檢測(cè)，不僅操作簡(jiǎn)便、耗時(shí)短、特異性強(qiáng)，而且極大地提高了結(jié)核檢測(cè)靈敏度，避免卡介苗或陳舊感染等的干擾導(dǎo)致假陽(yáng)性而結(jié)果不準(zhǔn)確，降低了模板使用量。實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明對(duì)潛伏結(jié)核檢測(cè)的靈敏度在97％以上。利用本發(fā)明的試劑盒能夠及早發(fā)現(xiàn)潛伏的結(jié)核感染并采取應(yīng)對(duì)措施，以減輕患者痛苦，提高結(jié)核治愈率。附圖說(shuō)明圖1為擴(kuò)增曲線不呈現(xiàn)“s”型或ct值＞35的樣本。圖2為ct值空白樣本。圖3為擴(kuò)增曲線呈現(xiàn)“s”型且結(jié)核刺激樣本ct值<本底對(duì)照樣本ct值；其中，圖1-3中的“a”和“b”分別指的是“目的基因”和“管家基因”。具體實(shí)施方式下面通過(guò)實(shí)施例的方式進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但并不因此將本發(fā)明限制在所述的實(shí)施例范圍之中。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，按照常規(guī)方法和條件，或按照商品說(shuō)明書(shū)選擇。實(shí)施例1試劑盒各組成成分的制備以及試劑盒的組裝表1.各組分名稱、濃度以及含量上述反應(yīng)緩沖液選用市售商品(購(gòu)自上海多澤生物科技有限公司)，dntp(購(gòu)自上海兆維科技發(fā)展有限公司)，eztaq酶或混合液(購(gòu)自上海多澤生物科技有限公司)，引物和探針(商業(yè)合成，英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司(abi))。(1)制備包括下列組成成份的試劑盒：反應(yīng)液1(650μl/管)1管：pcr反應(yīng)緩沖液、2’-脫氧核苷三磷酸、用于擴(kuò)增cxcl9的正向引物(引物1)和反向引物(引物2)，寡核苷酸探針為探針1；用于管家基因人β-globin基因靶多核苷酸擴(kuò)增的引物7和引物8，寡核苷酸探針為探針4。反應(yīng)液2(650μl/管)1管：反應(yīng)液2由如下組分組成：pcr反應(yīng)緩沖液、2’-脫氧核苷三磷酸、用于cxcl11靶多核苷酸擴(kuò)增的正向引物(引物3)和反向引物(引物4)，寡核苷酸探針為探針2；用于管家基因人β-globin基因靶多核苷酸擴(kuò)增的引物7和引物8，寡核苷酸探針為探針4。反應(yīng)液3(650μl/管)1管：反應(yīng)液3由如下組分組成：pcr反應(yīng)緩沖液、2’-脫氧核苷三磷酸、用于cxcl13靶多核苷酸擴(kuò)增的正向引物(引物5)和反向引物(引物6)，寡核苷酸探針為探針3；用于管家基因人β-globin基因靶多核苷酸擴(kuò)增的正向引物(引物7)和反向引物(引物8)，寡核苷酸探針為探針4。eztaq酶混合液(150μl/管)1管：taq酶。表2eztaq酶混合液組成標(biāo)準(zhǔn)液：陰性質(zhì)控品(80μl/管)：純化水。結(jié)核抗原管(采血管1)：抗原刺激物放到采血管中，每支采血管含有抗原刺激物20μg(0.5mg/ml)和肝素鈉干粉30iu(900iu/ml)。本底對(duì)照管(采血管2)：采血管中只含有肝素鈉干粉30iu(900iu/ml)。反應(yīng)液1與eztaq酶混合液、標(biāo)準(zhǔn)液以及結(jié)核抗原管和本底對(duì)照管作為體系i；反應(yīng)液2與eztaq酶混合液、標(biāo)準(zhǔn)液以及結(jié)核抗原管和本底對(duì)照管作為體系ii；反應(yīng)液3與eztaq酶混合液、標(biāo)準(zhǔn)液以及結(jié)核抗原管和本底對(duì)照管作為體系iii。其中，引物1-8構(gòu)成了各體系中的核酸擴(kuò)增體系，探針1-4構(gòu)成了各體系中的熒光檢測(cè)體系；各引物和探針具體組成如下：表3各引物和探針具體組成引物名稱核苷酸組成序列號(hào)引物15’-ccacctacaatccttgaaagacctt-3’seqidno.1引物25’-tgaactccattcttcagtgtagcaa-3’seqidno.2引物35’-tcaatttcctttcatgttcagcat-3’seqidno.3引物45’-acacaatatcacagccaaggctatag-3’seqidno.4引物55’-gtctttatccctagacgcttcattga-3’seqidno.5引物65’-gggtccacacacacaattgact-3’seqidno.6引物75’-ttcctcctcctgagcagt-3’seqidno.7引物85’-aaggtcataacctggttcatc-3’seqidno.8探針15’-ccaagcccttcctgcgagaaaattgaa-3’seqidno.9探針25’-caccagcagcaacagcaaaaaacaaaca-3’seqidno.10探針35’-cgaattcaaatcttgccccgtggg-3’seqidno.11探針45’-ccctggcgtcgtgattagtgatgatgaac-3’seqidno.12上述探針1～3的5’端連接有報(bào)告基團(tuán)fam，3’端連接有淬滅基團(tuán)bhqmgb；探針4的5’端連接有報(bào)告基團(tuán)vic，3’端連接有淬滅基團(tuán)bhqmgb。(2)試劑盒的組裝根據(jù)需求，可將eztaq酶混合液、標(biāo)準(zhǔn)液等試劑管以及結(jié)核抗原管和本底對(duì)照管分別與裝有上述反應(yīng)液1～3的單個(gè)離心管分隔包裝組成分別測(cè)定趨化因子cxcl9、cxcl11、cxcl13的試劑盒；也可以將上述各試劑管以及采血管和2個(gè)以上分別裝有不同的上述反應(yīng)液1～3的離心管包裝成雙靶點(diǎn)或三靶點(diǎn)的試劑盒。實(shí)施例2試劑盒的使用方法1)抽取樣本血液至本底對(duì)照管和結(jié)核抗原管中樣本采集、運(yùn)送和保存：用一次性真空采血器，無(wú)菌操作，取待檢個(gè)體血液樣本，做好標(biāo)示后將獲取的血液樣本置于低溫冰箱(-70℃或-20℃)中冷凍保存。如集中檢驗(yàn)，標(biāo)本需在0℃以下環(huán)境中運(yùn)送并于24小時(shí)內(nèi)送達(dá)實(shí)驗(yàn)室。臨床抽取2ml樣本血液加入本底對(duì)照管中，標(biāo)記為本底對(duì)照樣本；另抽取同一個(gè)體樣本血液2ml，加入含有20μg抗原刺激物(包含cfp10、esat6、ppe4和ag85a的衍生肽段(摩爾比為1:1:1:1)，由金斯康科技(南京)有限公司合成)的結(jié)核抗原管中于35℃下刺激6h后，標(biāo)記為結(jié)核抗原樣本。其中，4種抗原衍生肽的序列為：cfp10衍生肽：qgqwrgaagtaa(如seqidno.13所示)；esat6衍生肽：elnnal(如seqidno.14所示)；ppe衍生肽：agwqtlsaaldaqaveltar(seqidno.15所示)；ag85a衍生肽：rhvkptgsavvgl(如seqidno.16所示)。2)提取本底對(duì)照管和結(jié)核抗原管血液樣本中的rna取兩管中待測(cè)血樣各300μl(所述待測(cè)血液是指需要檢測(cè)是否為潛伏結(jié)核感染的臨床血液樣本)，用磁珠法同批次提取(提取試劑購(gòu)自深圳市安必勝科技有限公司)血液樣本mrna，使用rna逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司)逆轉(zhuǎn)錄為cdna，用分光光度計(jì)或類似的儀器確認(rèn)cdna的質(zhì)量(od260/280在1.8-2.0之間)。3)將所述cdna加入到反應(yīng)液中，通過(guò)核酸擴(kuò)增體系、用實(shí)時(shí)熒光pcr儀進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，循環(huán)擴(kuò)增待測(cè)樣品中的靶多核苷酸；使所述熒光檢測(cè)體系中的熒光發(fā)生基團(tuán)與被擴(kuò)增的靶多核苷酸序列間接結(jié)合。將逆轉(zhuǎn)錄的每份結(jié)核抗原管cdna和本底對(duì)照管cdna分別置于3個(gè)pcr反應(yīng)管或pcr板的3個(gè)孔中，每孔2μl。然后，在加入同一dna樣本的3個(gè)孔中各加入一種pcr反應(yīng)液(反應(yīng)液1、反應(yīng)液2、反應(yīng)液3)15μl，再在每個(gè)孔中加入3μl的eztaq酶混合液?；靹螂x心后，將pcr反應(yīng)體系置于自動(dòng)熒光檢測(cè)熱循環(huán)儀(abi7500)上，選擇fam通道(reporter:fam,quencher:none)收集特異擴(kuò)增信號(hào)；選擇vic通道(reporter:vic,quencher:none)檢測(cè)內(nèi)標(biāo)；參比熒光(passivereference)設(shè)置為none；設(shè)置samplevolume為20。按照儀器操作說(shuō)明做好相應(yīng)設(shè)置后開(kāi)始試驗(yàn)。具體pcr擴(kuò)增反應(yīng)體系、反應(yīng)條件見(jiàn)表4和表5。表4pcr擴(kuò)增反應(yīng)體系組分含量反應(yīng)液1或2或315μleztaq酶混合液3μl模板2μl總計(jì)20μl表5pcr擴(kuò)增反應(yīng)條件4)通過(guò)比較待檢樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的循環(huán)閾值判定熒光發(fā)生基團(tuán)所產(chǎn)生的熒光量，從而確定靶多核苷酸的存在。反應(yīng)結(jié)束后保存檢測(cè)數(shù)據(jù)文件，點(diǎn)選儀器的數(shù)據(jù)分析選項(xiàng)后可查看各個(gè)pcr反應(yīng)體系的結(jié)果，如pcr擴(kuò)增曲線，待檢樣本和標(biāo)準(zhǔn)樣本的ct值等。計(jì)算方法：以擴(kuò)增過(guò)程前3～15循環(huán)的熒光值的10倍標(biāo)準(zhǔn)差為閾值(threshold)，以熒光值超過(guò)閾值的循環(huán)數(shù)為閾值循環(huán)數(shù)(值)ct值。若管家基因ct值＞35，結(jié)果不可靠，請(qǐng)重新測(cè)定或觀察血液本身是否存在問(wèn)題。若管家基因ct值≦35時(shí)進(jìn)行以下計(jì)算：本底對(duì)照管：△cta＝ct值(目的基因)-ct值(管家基因)結(jié)核抗原管：△ctb＝ct值(目的基因)-ct值(管家基因)結(jié)果判讀：t值＝△ctb–△cta。1.無(wú)效結(jié)果判定：與存在于體系ⅰ、ⅱ、ⅲ中的寡核苷酸熒光探針1、探針2、探針3和探針4相關(guān)的擴(kuò)增曲線不呈現(xiàn)“s”型或ct值空白又或ct值＞35的樣本，報(bào)告為無(wú)效(見(jiàn)圖1、圖2)；2.陽(yáng)性結(jié)果判定：滿足與體系ⅰ或體系ⅱ或體系ⅲ中的寡核苷酸探針1、探針2、探針3和探針4相關(guān)的擴(kuò)增曲線呈現(xiàn)“s”型且t值≤-1.04，報(bào)告為陽(yáng)性(見(jiàn)圖3)；3.陰性結(jié)果判定：屬于無(wú)效結(jié)果判定和陽(yáng)性結(jié)果判定以外的情況且t值＞-1.04。則報(bào)告為陰性(陰性對(duì)照品就是沒(méi)有出現(xiàn)擴(kuò)增，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)體系未受到外界污染)。實(shí)施例3使用本發(fā)明的試劑盒檢測(cè)30例臨床血液樣本的結(jié)果與分析采用單盲實(shí)驗(yàn)法，從來(lái)自(南京胸科醫(yī)院)的500例血液樣本中選擇30例(均為需要檢測(cè)是否為潛伏結(jié)核感染的臨床血液樣本)用本發(fā)明的試劑盒進(jìn)行試驗(yàn)，以臨床診斷對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行復(fù)核。實(shí)驗(yàn)過(guò)程：臨床抽取2ml樣本血液至本底對(duì)照管中，標(biāo)記為本底對(duì)照樣本；另抽取2ml血液樣本，加入到含有20μg抗原刺激物的結(jié)核抗原管中，于35℃刺激6h后，標(biāo)記為結(jié)核抗原樣本。將待檢測(cè)血樣取300μl，用磁珠法同批次提取血液樣本mrna，購(gòu)買(mǎi)市售rna逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cdna，用分光光度計(jì)或類似的儀器確認(rèn)cdna的質(zhì)量(od260/280在1.8-2.0之間)，將逆轉(zhuǎn)錄的每份待檢樣本cdna和標(biāo)準(zhǔn)品cdna分別置于3個(gè)pcr反應(yīng)管或pcr板的3個(gè)孔中，每孔2μl。然后，在加入同一dna樣本的3個(gè)孔中各加入一種pcr反應(yīng)液(反應(yīng)液1、反應(yīng)液2、反應(yīng)液3)15μl，再在每個(gè)孔中加入3μl的eztaq酶混合液。具體pcr擴(kuò)增反應(yīng)體系見(jiàn)表3?；靹螂x心后，將pcr反應(yīng)體系置于自動(dòng)熒光檢測(cè)熱循環(huán)儀上，選擇fam通道(reporter:fam,quencher:none)收集特異擴(kuò)增信號(hào)；選擇vic通道(reporter:vic,quencher:none)檢測(cè)內(nèi)標(biāo)；參比熒光(passivereference)設(shè)置為none；設(shè)置samplevolume為20。按照儀器操作說(shuō)明做好相應(yīng)設(shè)置后開(kāi)始試驗(yàn)。本試劑盒的所使用的反應(yīng)條件(如表5所示)是：(1)95℃預(yù)變性5分鐘；(2)95℃15秒；(3)58℃35秒；(4)72℃20秒；步驟(2)-(4)循環(huán)40次。試驗(yàn)數(shù)據(jù)以及數(shù)據(jù)分析：表6反應(yīng)液1檢測(cè)結(jié)果表7反應(yīng)液2檢測(cè)結(jié)果表8反應(yīng)液3檢測(cè)結(jié)果表93種反應(yīng)液的檢測(cè)結(jié)果比較表10不同反應(yīng)液組合時(shí)的靈敏度實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，本發(fā)明對(duì)潛伏結(jié)核檢測(cè)的靈敏度最高達(dá)97％以上。<110>蘇州創(chuàng)瀾生物科技有限公司<120>一種檢測(cè)包含潛伏期的結(jié)核感染的試劑盒及其引物對(duì)和探針<130>p1611497c<160>16<170>patentinversion3.5<210>1<211>25<212>dna<213>artificialsequence<220><223>引物1<400>1ccacctacaatccttgaaagacctt25<210>2<211>25<212>dna<213>artificialsequence<220><223>引物2<400>2tgaactccattcttcagtgtagcaa25<210>3<211>24<212>dna<213>artificialsequence<220><223>引物3<400>3tcaatttcctttcatgttcagcat24<210>4<211>26<212>dna<213>artificialsequence<220><223>引物4<400>4acacaatatcacagccaaggctatag26<210>5<211>26<212>dna<213>artificialsequence<220><223>引物5<400>5gtctttatccctagacgcttcattga26<210>6<211>22<212>dna<213>artificialsequence<220><223>引物6<400>6gggtccacacacacaattgact22<210>7<211>18<212>dna<213>artificialsequence<220><223>引物7<400>7ttcctcctcctgagcagt18<210>8<211>21<212>dna<213>artificialsequence<220><223>引物8<400>8aaggtcataacctggttcatc21<210>9<211>27<212>dna<213>artificialsequence<220><223>探針1<400>9ccaagcccttcctgcgagaaaattgaa27<210>10<211>28<212>dna<213>artificialsequence<220><223>探針2<400>10caccagcagcaacagcaaaaaacaaaca28<210>11<211>24<212>dna<213>artificialsequence<220><223>探針3<400>11cgaattcaaatcttgccccgtggg24<210>12<211>29<212>dna<213>artificialsequence<220><223>探針4<400>12ccctggcgtcgtgattagtgatgatgaac29<210>13<211>12<212>prt<213>artificialsequence<220><223>cfp10衍生肽段<400>13glnglyglntrpargglyalaalaglythralaala1510<210>14<211>6<212>prt<213>artificialsequence<220><223>esat6衍生肽段<400>14gluleuasnasnalaleu15<210>15<211>20<212>prt<213>artificialsequence<220><223>ppe衍生肽段<400>15alaglytrpglnthrleuseralaalaleuaspalaglnalavalglu151015leuthralaarg20<210>16<211>13<212>prt<213>artificialsequence<220><223>ag85a衍生肽段<400>16arghisvallysprothrglyseralavalvalglyleu1510當(dāng)前第1頁(yè)12