一種催化效率提高的n-乙酰谷氨酸激酶突變體的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種催化效率提高的N?乙酰谷氨酸激酶突變體，屬于生物工程領(lǐng)域。將來(lái)源于鈍齒棒桿菌(Corynebacterium crenatum SYPA5?5)的N?乙酰谷氨酸激酶的基因進(jìn)行定點(diǎn)突變，使其編碼的氨基酸序列在第74位由異亮氨酸I突變?yōu)槔i氨酸V。本發(fā)明所述的N?乙酰谷氨酸激酶突變體的催化效率(Kcat/Km)由野生型的513mM?1min?1提高到843mM?1min?1，是突變之前的1.64倍，并且此突變體的熱穩(wěn)定性也有所提高。本發(fā)明所得N?乙酰谷氨酸激酶突變體更有利于精氨酸的生產(chǎn)需求，為高效合成L?精氨酸奠定了基礎(chǔ)。
【專利說(shuō)明】
-種催化效率提高的N-乙醜谷氨酸激酶突變體
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種催化效率提高的N-乙酷谷氨酸激酶突變體，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng) 域。
【背景技術(shù)】
[0002] k精氨酸是一種堿性半必須氨基酸，它具有多種生理功能。它是合成胞漿蛋白和 核蛋白的必需氨基酸;作為唯一的氨來(lái)源參與肌酸的合成;作為尿素循環(huán)的重要中間體，在 肝臟中扮演著排除多余氨的角色，防止氨過量積累而引起中毒；它還具有調(diào)節(jié)人體免疫力 的功能，可抑制腫瘤生長(zhǎng)、促進(jìn)受傷組織愈合等。并且，精氨酸是一氧化氮、尿素、鳥氨酸及 肌下胺的直接前體，是合成肌肉素的重要原素，且被用作聚胺、瓜氨酸及谷氨酷胺的合成。 因此，k精氨酸在醫(yī)藥、食品及化工領(lǐng)域方面具有重要而廣泛的應(yīng)用。
[0003] N-乙酷谷氨酸激酶(N-acetyl glutamate kinase)簡(jiǎn)稱熱61(，是心精氨酸合成途 徑的第二個(gè)酶和關(guān)鍵限速酶，同時(shí)它受終產(chǎn)物k精氨酸的反饋抑制。在ATP的作用下，它催 化N-乙酷谷氨酸的A-COO-憐酸化從而生成心精氨酸合成的中間體N-乙酷谷氨酸憐酸。
[0004] k精氨酸生產(chǎn)方法有水解法和發(fā)酵法。水解法存在操作費(fèi)時(shí)，收率和產(chǎn)量低，成本 高等問題，并且存在嚴(yán)重的污染而不適合大規(guī)模的生產(chǎn)。因此，實(shí)現(xiàn)發(fā)酵法生產(chǎn)心精氨酸成 為國(guó)內(nèi)外氨基酸工業(yè)的一個(gè)十分迫切的問題。目前，用來(lái)產(chǎn)心精氨酸的微生物菌株主要是 谷氨酸棒桿菌與純齒棒桿菌，為提高精氨酸產(chǎn)量，研究者們利用DNA重組技術(shù)結(jié)合代謝工程 技術(shù)調(diào)控合成精氨酸的代謝途徑，運(yùn)使得精氨酸的產(chǎn)量大有提高。為進(jìn)一步提高生產(chǎn)量研 究者漸漸開始將研究重點(diǎn)轉(zhuǎn)向心精氨酸限速酶一一N-乙酷谷氨酸激酶(NAGK)，通過克隆N-乙酷谷氨酸激酶基因并導(dǎo)入其它菌株來(lái)表達(dá)，W及運(yùn)用定點(diǎn)突變技術(shù)獲得解除精氨酸對(duì)其 的反饋抑制，從而來(lái)提高發(fā)酵產(chǎn)k精氨酸的能力。然而，雖然通過克隆N-乙酷谷氨酸激酶基 因（a巧B)并導(dǎo)入其它菌株獲得了NAGK的過量表達(dá)，但是NAGK的比酶活并不高即NAGK的催化 活性較弱，且熱穩(wěn)定性不好即在37°C下NAGK的半衰期為3611，而心精氨酸的發(fā)酵周期是96h。 因此，在保持N-乙酷谷氨酸激酶過量表達(dá)的基礎(chǔ)上，提高其催化效率與熱穩(wěn)定性成為工業(yè) 生產(chǎn)的迫切需要。
[0005] 因此，本發(fā)明公開了一種催化效率提高的N-乙酷谷氨酸激酶突變體，將來(lái)源于純 齒棒桿菌（Corynebacterium crenatum SYPA5-5)的N-乙酷谷氨酸激酶的基因進(jìn)行定點(diǎn)突 變，使其編碼的氨基酸序列在第74位由異亮氨酸I突變?yōu)猷l(xiāng)氨酸V。本發(fā)明所述的N-乙酷谷 氨酸激酶突變體口 4VNAGK的催化效率(843mM-imin-i)相對(duì)于突變之前(513mM-imin-i)提高了 1.64倍，并且此突變體的熱穩(wěn)定性也有所提高。本發(fā)明所得N-乙酷谷氨酸激酶突變體更有 利于精氨酸的生產(chǎn)需求，為高效合成k精氨酸奠定了基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明要解決的問題是提供一種催化效率提高的N-乙酷谷氨酸激酶突變體 (NAGK)。將來(lái)源于純齒棒桿菌(Corynebacterium crenatum SYPA5-5)的N-乙酷谷氨酸激酶 第74位的異亮氨酸I進(jìn)行定點(diǎn)突變，將含突變后基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)入E.COli化21進(jìn)行 表達(dá)，蛋白純化后得到催化效率提高的N-乙酷谷氨酸激酶突變體。
[0007] 編碼所述突變后N-乙酷谷氨酸激酶的核巧酸序列如SEQ ID NO. 1所示所示。
[0008] 所述突變是將第74位的異亮氨酸突變?yōu)猷l(xiāng)氨酸V。
[0009] 獲得所述突變體的方法，是W祀T28a-argB質(zhì)粒(一種高產(chǎn)k精氨酸的純齒棒桿菌 SYPA5-5)為模版，設(shè)計(jì)引物，通過重疊延伸PCR進(jìn)行定點(diǎn)突變得到含有突變后基因的重組質(zhì) 粒祀T28a-a巧Bmv,將其分別轉(zhuǎn)化至E. COl i化21進(jìn)行表達(dá)，獲得突變體口4VNAGK獲得所述突 變體的方法，具體地是：
[0010] (1)突變表達(dá)載體的構(gòu)建
[0011] 通過分析N-乙酷谷氨酸激酶的3D結(jié)構(gòu)W及同源序列的比對(duì)，確定74位的異亮氨酸 I為目的突變?yōu)辄c(diǎn)，設(shè)計(jì)突變實(shí)驗(yàn)，將該位點(diǎn)的異亮氨酸突變?yōu)猷l(xiāng)氨酸VdW祀T28a-argB質(zhì) 粒為模版，設(shè)計(jì)引物，通過重疊延伸PCR進(jìn)行定點(diǎn)突變得到的突變基因 argBmvW及載體 祀T28a分別用EcoRI與Sail核酸內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切后于16°C連接;然后將連接產(chǎn)物直接轉(zhuǎn) 化到E. COl i JM109菌株，提取重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序。
[0012] (2)含突變體的基因工程菌的獲得
[OOU] 制備E.coli化2UDE3)感受態(tài)，將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒祀T28a-argBi74v轉(zhuǎn)化到感 受態(tài)E.COIi化21細(xì)胞中，篩選轉(zhuǎn)化子。
[0014] (3)N-乙酷谷氨酸激酶活力測(cè)定
[0015] 酶活測(cè)定方法:3血反應(yīng)液中含595mmol/L Tris-肥Kp冊(cè).0)，20mmol/L N-乙酷谷 氨酸，20mmol/L MgCl2,20mmol/L ATP二鋼鹽，149mmol/L NH20H ?肥I及適量粗酶液。于37°C 反應(yīng)化后，加入ImL反應(yīng)終止液（l.Omol/L肥I含5%化CI3 ?細(xì)20,4%S氯乙酸）終止反應(yīng)。 離屯、，取上清測(cè)定N-乙酷谷氨酸氧目虧酸的光吸收值A(chǔ)540。
[0016] 酶活力單位定義為1個(gè)國(guó)際單位化)等于每分鐘內(nèi)生成Uimol產(chǎn)物N-乙酷谷氨酸氧 月虧酸所需要的酶量。
[0017] (4)野生型和突變體的酶活與動(dòng)力學(xué)常熟的測(cè)定
[0018] 將重組E. COli化21培養(yǎng)后破細(xì)胞，取上清即為粗酶液，將野生酶和突變酶經(jīng)Ni柱 純化后測(cè)定酶活力與蛋白濃度得到比酶活，通過改變底物N-乙酷谷氨酸(NAG)的濃度W及 運(yùn)用雙倒數(shù)法測(cè)得Km，Vm與Kcat的值。
【具體實(shí)施方式】
[0019] 實(shí)施例1突變表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及重組E.COli化21菌株的獲得
[0020] 根據(jù)Coirnebacterium crenatum SYPA5-5的ar濁基因序列，設(shè)計(jì)N-乙酷谷氨酸激 酶編碼基因的兩頭引物，再根據(jù)待突變的氨基酸位點(diǎn)來(lái)設(shè)計(jì)PCR點(diǎn)突變中間引物：
[0021 ]利用重疊延伸PCR體外擴(kuò)增獲得突變基因。
[0022] 用于定點(diǎn)突變的引物為：
[0023] Par濁 F:5'-CGCGAATTCATGAATGACTTGATCAAAG-3'（EcoRI)
[0024] Par濁 R:5 '-CGCGTCGACTTACAGTTCCCCATCCTTG-3 '（SalI)
[00巧]Par濁I74V Fm: 5，-CGGTGGTGGACCTCAGGTTTCTGAGATGC-3 '
[00%] Par濁I74V Rm: 5 '-GCATCTCAGAAACCTGAGGTCCACCACCG-3 '
[0027]提取純齒棒桿菌桿菌SYPA5-5基因組為模板；
[002引 PCR反應(yīng)條件:95 °C預(yù)變性5min，95 °C變性30s，58°C退火30s，72°C延伸60s，30個(gè)循 環(huán);72°C延伸5min，。將所得突變基因片段與克隆載體祀T-2&1分別用EcoRI與Sail核酸內(nèi)切 酶進(jìn)行雙酶切，膠回收后將兩者混合，加入T4連接酶，于16°C過夜連接，轉(zhuǎn)化至E. COli JM109，經(jīng)過氨節(jié)青霉素抗性平板篩選，挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，將重組質(zhì)粒命名 為祀T28a-a巧Bmv并送至上海生物工程公司測(cè)序。
[00巧]將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒再轉(zhuǎn)化至E.COli BL2UDE3)感受態(tài)細(xì)胞，獲得重組E.COli 化21菌株
[0030] 實(shí)施例2突變體N-乙酷谷氨酸激酶的表達(dá)及Ni-NTA純化
[0031] 取凍管保藏的重組子接種至含卡那霉素 (終濃度為50iig/mL)的LB培養(yǎng)基中，37°C 振蕩培養(yǎng)過夜，按1 %接種量轉(zhuǎn)接，37 °C培養(yǎng)至OD約0.6-0.8，加人IPTG至終濃度為1mmol/L， 16°C過夜誘導(dǎo)表達(dá)。將過夜誘導(dǎo)表達(dá)的菌液于1000化/min，4°C離屯、15min，收集菌體，用 TriS-肥I (抑8.0)緩沖液懸浮菌體，超聲波破碎細(xì)胞，然后經(jīng)0.45皿濾膜過濾，選用表達(dá)載 體祀T-2姑中含有細(xì)i S-Tag，過Ni-NTA純化NAGK，將獲得純的NAGK酶蛋白經(jīng)SDS-PAGE分析， 檢測(cè)到一條分子量約為36kDa的特異性條帶，純的NAGK酶用于蛋白濃度與酶活的測(cè)定，得到 比酶活。
[0032] 實(shí)施例3野生酶和突變酶的催化常數(shù)比較
[0033] 將上一步得到的純酶液進(jìn)行酶促反應(yīng)：酶促反應(yīng)總體積為3mL，含595mmol/L Tris-HCUp 服.0)，20mmol/L N-乙酷谷氨酸，20mmol/L MgCl2,20mmol/L ATP 二鋼鹽， 149mmol/L N出OH ? HCI及適量粗酶液；于37°C反應(yīng)化后，加入ImL反應(yīng)終止液（l.Omol/L 肥I含5%化Cl3 ?細(xì)20,4%S氯乙酸)終止反應(yīng);離屯、，取上清測(cè)定N-乙酷谷氨酸氧目虧酸的光 吸收值A(chǔ)540。通過改變底物N-乙酷谷氨酸(NAG)的濃度W及運(yùn)用雙倒數(shù)法測(cè)得Km，Vm與Kcat 的值。得到的結(jié)果如表1所示:N-乙酷谷氨酸激酶突變體I74VNAGK催化效率化cat/Km)由野生 型的513mM-Vin-i提高到843mM-Vin-i，因此突變體酶的催化效率更高，更利于精氨酸的合 成。
[0034] 實(shí)施例4野生型和突變體的熱穩(wěn)定性比較
[0035] 為了測(cè)定野生酶和突變酶對(duì)溫度的耐受性，將已經(jīng)純化的酶于37°C水浴不同的時(shí) 間后按上述方法測(cè)殘余酶活力，考察其熱穩(wěn)定性。將未經(jīng)37°C水浴的酶活設(shè)為100%，得到 酶的熱穩(wěn)定性曲線。結(jié)果如表1所示:N-乙酷谷氨酸激酶突變體口 4VNAGK的熱穩(wěn)定性比野生 型(CgNAGK)的也有所提高。野生酶的半衰期是36h，突變體口 4VNAGK的半衰期是52h。
[0036] 本發(fā)明所述的突變突變體口 4VNAGK的催化效率相比突變之前有了明顯的提高，提 高了 1.64倍，結(jié)果表明，在關(guān)鍵位點(diǎn)突變氨基酸，可W獲得優(yōu)于野生型的突變體，運(yùn)種策略 可W廣泛應(yīng)用于酶學(xué)性質(zhì)的改進(jìn)。
[0037] 表1野生型和突變體的動(dòng)力學(xué)參數(shù)及其半衰期 [00；3 引
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種催化效率提高的N-乙酰谷氨酸激酶突變體，其特征在于，將鈍齒棒桿菌來(lái)源的 N-乙酰谷氨酸激酶第74位的異亮氨酸I突變?yōu)槔i氨酸V。2. 權(quán)利要求1所述突變體的編碼基因，其特征在于:其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。3. 權(quán)利要求1所述突變體的應(yīng)用，其特征在于，將權(quán)利要求2所述的基因?qū)脞g齒棒桿 菌中，用于改善精氨酸的合成效率;但不限于應(yīng)用于改善精氨酸的合成。
【文檔編號(hào)】C12N15/54GK105838689SQ201610285765
【公開日】2016年8月10日
【申請(qǐng)日】2016年5月3日
【發(fā)明人】饒志明, 徐美娟, 張景景, 楊套偉, 張顯, 葛小勛
【申請(qǐng)人】江南大學(xué)