一種脂肪酶LIPDa6及其編碼基因和應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬生物化工和生物技術領域，具體涉及一種脂肪酶Liroa6及其編碼基因 和應用。
【背景技術】
[0002] 手性化合物雖然原子組成是一樣的，但它們的立體結構卻互為鏡像，在生物學和 藥學性質(zhì)上卻相差甚遠。比如L-薄荷醇具有清涼味，而D-薄荷醇則發(fā)霉味；S-天冬酰胺 是甜的，R-天冬酰胺是苦的；R型的"反應停"是孕婦用鎮(zhèn)痛藥和止痛藥，而S型的"反應停" 對胎兒則有致畸作用，歷史上曾出現(xiàn)使用反應停導致大規(guī)模新生兒畸形的事件?？梢姾铣?手性藥物過程中，前體原料的光學純度是重要環(huán)節(jié)。
[0003] 手性化合物的合成主要有：（1)化學法，即利用對映體的物理和化學性質(zhì)的差異 進行分離。通常有鹽析法、包結法、以及組合拆分。其缺點是要求對映體之間的性質(zhì)差異要 大，適用的化合物不多；（2)合成法，通過設計反應來進行手性化合物的化學合成。這種方 法缺點在于反應過程通常比較劇烈，耗費能量，而且反應中使用大量有毒的有機溶劑；(3) 色譜拆分，這種方法是利用填料對手性對映體吸附性質(zhì)的差異來實現(xiàn)，其缺點是設備昂貴， 普及性較差。
[0004] 脂肪酶（Lipase，EC3. 1. 1. 3)，又叫作三酰甘油水解酶，是一類能夠將三酰甘油水 解為甘油和脂肪酸的酶，其來源非常廣泛，微生物、植物和動物中都有存在。脂肪酶作為生 物催化劑多數(shù)可作用非天然底物，而且可拆分的底物多，立體選擇性高，不需要輔助因子， 是一種重要的手性催化劑。
[0005] R-扁桃酸和其衍生物是重要的手性前體，不僅是半合成盤尼西林、頭孢菌素、抗腫 瘤藥物Goniothalamusstyryllactones和減肥藥物Phenethanolamines的合成前體，而且 還是重要的手性拆分試劑。因此R-扁桃酸和其衍生物有十分廣泛的市場需求和應用前景。
[0006] 但是，大多數(shù)在工業(yè)中應用的脂肪酶都是源于進口，比如NovoNordisk公司的 月旨肪酉每Novozym435 (來自Candidaantarctica)，AmanoPharmaceutical公司的Lipase PS(來自Burkholderiacepacia)，F(xiàn)luka公司的LipaseA(來自Candidaantarctica)等。 這些脂肪酶價格昂貴，生產(chǎn)技術受到制約，因此開發(fā)具有自主產(chǎn)權的脂肪酶十分必要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術中脂肪酶價格昂貴、生產(chǎn)技術受到制約的不足，提 供一種新的脂肪酶LIH)a6及其編碼基因和應用。
[0008]本發(fā)明從囊胞菌（Dactylosporangiumaurantiacumsubsp.Hamdenensis)NRRL 18085中開發(fā)了一種新的脂肪酶LIH)a6及其編碼基因脂肪酶基因lipDa6,構建了含有脂肪 酶基因lipDa6的重組表達載體和基因工程菌，培養(yǎng)基因工程菌后獲得脂肪酶LIPDa6,其可 應用于手性拆分（R，S)_扁桃酸甲酯制備（R)-扁桃酸甲酯。
[0009] 本發(fā)明的第一個目的是提供一種脂肪酶LIH)a6,其氨基酸序列如SEQIDN0. 2所 不。
[0010] 本發(fā)明的第二個目的是提供一種編碼所述的脂肪酶Liroa6的脂肪酶基因 lipDa6〇
[0011] 優(yōu)選，所述的脂肪酶基因lipDa6的核苷酸序列如SEQIDNO. 1所示。
[0012] 本發(fā)明還提供一種含有所述的脂肪酶基因lipDa6的重組表達載體。所述的表達 載體，優(yōu)選pET28a(+)載體。
[0013] 本發(fā)明還提供一種含有所述的脂肪酶基因lipDa6的基因工程菌。所述的基因工 程菌，優(yōu)選大腸桿菌BL21 (DE3)。
[0014] 本發(fā)明的第三個目的是提供所述的脂肪酶Liroa6在制備（R)-l-扁桃酸甲酯中的 應用。
[0015] 優(yōu)選，其步驟為：取脂肪酶Liroa6于pH為5. 0-9. 0的緩沖液中，再加入（R，S)-扁 桃酸甲酯進行反應，得到（R) -1-扁桃酸甲酯。
[0016] 所述的緩沖液，優(yōu)選為醋酸-醋酸鈉、Na2HP04/NaH2P〇dPTris-HCl緩沖液中的一 種。
[0017] 本發(fā)明的第四個目的是提供所述的脂肪酶LIH)a6在耐受Ca2+、Li2+、Fe2+、Mg'甲 醇或乙醇環(huán)境下進行催化的應用。
[0018]本發(fā)明的脂肪酶LIFOae來源于囊胞菌（D.aurantiacumsubsp.Hamdenensis) NRRL18085,保存在中國科學院南海海洋研究所。本發(fā)明利用生物信息學分析的方法，從基 因組測序的囊胞菌（D.aurantiacumsubsp.Hamdenensis)NRRL18085中克隆得到脂肪酶基 因lipDa6,全長為795bp(從起始密碼子到終止密碼子），其編碼的脂肪酶LIH)a6,共包含 264個氨基酸；該基因是一個全新的脂肪酶基因。通過克隆脂肪酶基因lipDa6并將其連接 表達載體pET-28a(+)后轉化大腸桿菌BL21 (DE3)，培養(yǎng)并誘導表達后，得到了重組表達的 脂肪酶LIH)a6。脂肪酶LIH)a6可催化拆分（R，S)_扁桃酸甲酯，在優(yōu)化的條件下，制備得 到光學純度達99%的（R)-l-扁桃酸甲酯。脂肪酶LIH)a6具有穩(wěn)定性高、催化效率高的優(yōu) 點，在生物化工和生物醫(yī)藥領域具有非常大應用價值。
[0019]本發(fā)明的囊胞菌（Dactylosporangiumaurantiacumsubsp.Hamdenensis)NRRL 18085已在本申請以前公開記載于美國專利，其專利號為US4918174的專利中，該專利的 申請日為1986年9月26日；根據(jù)該專利文獻的記載，Dactylosporangiumaurantiacum subsp.hamdenensisNRRL18085保藏于美國農(nóng)業(yè)研究菌種保藏中心（Agricultural ResearchServiceCultureCollection，簡寫：NRRL)，其登錄號為NRRL18085。
【附圖說明】
[0020] 圖1是不同側鏈長度的對硝基苯酚酯對脂肪酶LIH)a6酶活的影響。
[0021] 圖2是脂肪酶LIH)a6的最適pH及pH穩(wěn)定性，A為最適pH曲線，B為pH穩(wěn)定性曲 線。
[0022] 圖3是脂肪酶LIH)a6的最適反應溫度和溫度穩(wěn)定性，A為最適反應溫度曲線，B為 溫度穩(wěn)定性曲線。
[0023] 圖4是脂肪酶LIH)a6拆分（R，S)-l_扁桃酸甲酯的GC圖，A是脂肪酶LIH)a6水 解（R，S)-扁桃酸甲酯，反應3h后的GC圖；B是脂肪酶LIH)a6水解（R，S)-扁桃酸甲酯，反 應5h后的GC圖；C是扁桃酸甲酯和等摩爾（R)-扁桃酸甲酯混合后的GC圖。
[0024] 圖5是脂肪酶LIH)a6的蛋白表達純化情況，1為IPTG誘導后的含pET_28a(+) 質(zhì)粒的大腸桿菌BL21 (DE3)全細胞蛋白；2為蛋白Marker;3為未經(jīng)IPTG誘導的 含pET-28a(+)-LipDa6的大腸桿菌BL21 (DE3)全細胞蛋白；4為IPTG誘導后的含 pET-28a(+)-LipDa6的大腸桿菌BL21(DE3)全細胞蛋白；5為Ni柱純化后的重組脂肪酶 LIPDa6〇
【具體實施方式】
[0025] 以下實施例是對本發(fā)明的進一步說明，而不是對本發(fā)明的限制。
[0026] 實施例1 :LipDa6引物設計及開放閱讀框邊界確定
[0027]提取囊胞菌（D.aurantiacumsubsp.Hamdenensis)NRRL18085 的基因組DNA，經(jīng) 16SrRNA驗證無誤后，交至上海美吉生物科技有限公司測序。利用生物信息學手段對基因 組進行注釋，分析其中的脂肪酶基因，確定了其中脂肪酶基因lipDa6的開放閱讀框，通過 信號分析工具http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/，分析發(fā)現(xiàn)其中沒有信號肽。 該脂肪酶基因lipDa6是一個全新的脂肪酶基因，其核苷酸序列如SEQIDNO. 1所示，全長 為795bp(從起始密碼子到終止密碼子），其編碼的脂肪酶LIH)a6的氨基酸序列如SEQID NO. 2所示，共264個氨基酸。
[0028] 根據(jù)分析得到的脂肪酶基因lipDa6序列，設計全長擴增引物如下：正向引物：5'_ CACGAATTCGTGACCTTCCATCCCGTGCCAG-3'，下劃線為EcoRI酶切位點；反向引物:5'_CCCAAGC HTTAGCGCAGGACGTCGTCGAG-3'，下劃線為HindIII酶切位點。
[0029] 實施例2:脂肪酶基因lipDa6的克隆及載體構建
[0030] 2. 1PCR擴增
[0031]將實施例 1 設計的引物（正向引物 5 ' -CACGAATTCGTGACCTTCCATCCCGTGCCAG-3 '， 反向引物5' -CCCAAGCTTTTAGCGCAGGACGTCGTCGAG-3'）送至上海生物工程有限公司合成引 物，合成的引物使用TE稀釋到10μM，提取（采用Thermo公司的GeneJetGenomicDNA PurtificationKit進行基因組DNA提取純化）囊胞菌（D.aurantiacumsubsp.Hamden ensis)NRRL18085的總DNA作為DNA模板，建立如表1所示反應體系：
[0032] 表1PCR反應體系
[0033]
[0034] 使用以下PCR擴增程序擴增脂肪酶基因lipDa6 :a. 95°C變性5min;b. 95°C變性 lmin，60°C退火 0. 5min，72°C延伸lmin20s，進行 30 個循環(huán)；c. 72°C延伸lOmin，冷卻到 10 Γ〇
[0035] 將PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠中，120V電壓下電泳20min，置于凝膠成像系統(tǒng)中觀 察?；厥?00bp左右的條帶。PCR產(chǎn)物按照膠回收試劑盒的方法進行回收，使用20μL無菌 水洗脫，得到純化回收的PCR產(chǎn)物。
[0036] 2. 2 酶切
[0037] PCR產(chǎn)物使用以下體系進行雙酶切，酶切時間lh;酶切體系為：EcoRIlyL， HindIII1μL，PCR產(chǎn)物〈0. 3μg，滅菌的雙蒸水加至30μL。酶切后純化回收得到經(jīng)過雙酶 切的PCR產(chǎn)物。
[0038]質(zhì)粒pET_28a(+)的雙酶切：挑取含有該質(zhì)粒的大腸桿菌DH5α單菌落，過夜培養(yǎng)。 使用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，用EcoRI和HindIII按以下體系雙酶切酶切，酶切時間lh; 酶切體系為疋〇〇1?11以1^!1;[11(11111以1^質(zhì)粒0嫩〈1以8，滅菌的雙蒸水加至20以匕酶切后 純化回收得到經(jīng)過雙酶切的pET-28a(+)載體。
[0039] 上述雙酶切使用的限制性內(nèi)切酶為Thermo公司生產(chǎn)的快速內(nèi)切酶，酶切后的純 化回收使用核酸純化回收試劑盒（Magen，HipureGelPureDNAMicroKit)，質(zhì)粒提取試 劑盒為上海捷瑞生物工程有限公司的質(zhì)粒小量制備試劑盒，操作方法按其使用說明書。
[0040] 2. 3 連接
[0041] 經(jīng)過雙酶切PCR產(chǎn)物和pET_28a(+)載體按照3 : 1的摩爾比例進行連接。連接 使用的T4連接酶購自北京全式金生物技術公司，連接使用的酶量為5U/5μL連接體系，連 接溫度為22°C，連接時間20min。
[0042] 2. 4轉化及篩選
[0043] 取5μL連接產(chǎn)物與50μL大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞中，冰浴30min，于42°C水浴 鍋熱激90s，冰浴2min后加入500μLLB液體培養(yǎng)基，37°C200rpm培養(yǎng)lh。培養(yǎng)物4000rpm 離心lmin后，棄上清400μL，余下的100μL涂布于含50μL/mL卡那霉素的LB平板，培養(yǎng) 20h后挑選單菌落。單菌落于5mLLB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，進行雙酶切驗證，酶切 片段與基因大小相同的即為陽性克隆。
[0044] 2. 5基因核苷酸序列測定
[0045] 將