一種meso-2,3-丁二醇脫氫酶編碼基因、重組酶及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種來源于地衣芽抱桿菌度acillus licheniformis)CICIMB0109的mes〇-2,3-下二醇脫氨酶及其基因，W及含有該基因的重 組表達(dá)載體和重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體，其重組酶和該重組酶的制備方法，W及該還原酶或其重組 酶作為催化劑在不對(duì)稱還原前手性雙幾基化合物W制備光學(xué)活性手性醇中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 手性二醇因具有兩個(gè)手性中屯、成為一種非常重要的手性化合物，它是合成精細(xì)化 學(xué)品、手性藥物、手性試劑等的手性擱塊。其中，（2S，3巧-2, 3-下二醇在不對(duì)稱合成含兩個(gè) 鄰位手性中屯、的手性化合物中起重要作用。
[0003] meso-2, 3-下二醇脫氨酶屬于短鏈脫氨酶（Sho;rt-chaindehy化ogenase/ re化ctase)家族，其催化的不對(duì)稱還原反應(yīng)需要依賴于輔酶NAD(P)\許多微生物中 含有meso-2, 3-下二醇脫氨酶，如粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratiamarcescens)、紅平紅球菌 巧hodococcuser}ftbopolis)、克雷伯氏肺炎菌化lebsiellapneumonia)、陰溝腸桿菌 巧nterobactercloacae)等。運(yùn)類meso-2,3-下二醇脫氨酶具有將雙乙酷還原生成單 一構(gòu)型（2S，3S)-2, 3-下二醇的功能。采用發(fā)酵法生產(chǎn)2, 3-下二醇可達(dá)到較高水平（約 為150g?L1)，然而由于微生物野生菌中酶系復(fù)雜，運(yùn)種方法生產(chǎn)的2, 3-下二醇一般至少 為兩種構(gòu)型的混合物，不是單一構(gòu)型，達(dá)不到合成精細(xì)化學(xué)品或者藥物的要求（Celinska E.,GrajekW.'Biotechnol.Adv. ,2009, 27, 715-725;QinJ.,etal.,畑in.J.Chem. 化g.，2006, 14, 132-136)。
[0004] 2001 年，Ui等將解糖短桿菌度revibacteriumsaccharol^ixum)中 (2S，3S)-2, 3-下二醇脫氨酶編碼基因在E.coli中表達(dá)，W外消旋的乙偶因?yàn)榈孜?，可生產(chǎn) 3. 7g/L(2S，3S)-2, 3-下二醇扣ietal.，Lett.Appl.Microbiol. ,2001，32, 93-98)。2004 年，化等將克雷伯氏肺炎菌化lebsiellapneumonia)中的meso-2,3-下二醇脫氨酶和 B.saccha;rol5fticum中的（2S, 3S)-2, 3-下二醇脫氨酶編碼基因在E.coli中共表達(dá)，W雙乙 酷為底物，可生產(chǎn) 2. 2g/L的（2S，3S)-2,3-下二醇（ee值為 96%)扣ietal.，Lett.Appl. Microbiol.，2004, 39, 533-537)。2010 年，Xiao等將枯草芽抱桿菌度acillussubtilis) 中的（2R, 3R)-2, 3-下二醇脫氨酶和短乳桿菌（Xactobacillusbrevis)中的NADH氧化酶 編碼基因在6.(：〇11中表達(dá)，拆分2,3-下二醇混旋體，可生產(chǎn)（25,3巧-2,3-下二醇（66值 為99%)狂iaoZ.，etal.，PLoS0NE，2010,5，e8860)。2011年馬翠卿等將來源于陰溝腸 桿菌巧nterobactercloacae)的（2S,3S)-2, 3-下二醇脫氨酶基因在大腸桿菌中表達(dá)， ^雙乙酷和葡萄糖為底物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)（25,35)-2,3-下二醇，最高產(chǎn)量為26邑/1化11乂.，6* al.，Bioresour.Technol.，2012, 115, 111-116)。因此，利用立體選擇性 2, 3-下二醇脫氨 酶，還原雙乙酷為（2S，3S)-2, 3-下二醇，是合成單一構(gòu)型（2S，3S)-2, 3-下二醇的一種重要 方法。然而目前的反應(yīng)體系，脫氨酶催化活性不高，產(chǎn)物濃度較低，使上述方法具有一定局 限性，因此有必要尋找新的微生物來源立體選擇性meso-2, 3-下二醇脫氨酶，W實(shí)現(xiàn)高純 度（2S，3S)-2, 3-下二醇的高效合成。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是針對(duì)W野生地衣芽抱桿菌度acillus licheni化rmis)CICIMB0109整細(xì)胞作為雙乙酷不對(duì)稱還原催化劑時(shí)酶產(chǎn)量較低使總體催 化活性不高，不對(duì)稱還原底物譜較窄的缺陷，而提供一種具有優(yōu)異的不對(duì)稱催化活性、底物 適用性廣、對(duì)環(huán)境友好的的meso-2, 3-下二醇脫氨酶及其編碼基因，W及含有該基因的重 組表達(dá)載體和重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體，重組酶的制備方法，W及該在制備（2S，3S)-2, 3-下二醇的 應(yīng)用。 W06] 本發(fā)明的meso-2, 3-下二醇脫氨酶基因來源于地衣芽抱桿菌度aci1lus licheni化rmis)CICIMB0109,命名為B化化，其編碼序列如沈QIDNO. 1所示；或編碼由序 列表SEQIDNO. 2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；W及任何對(duì)SEQIDNO. 1所示核巧酸序 列進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)核巧酸的取代、插入或缺失處理獲得的核巧酸序列。基因全長(zhǎng)為783bp， 其編碼序列（CD巧從第1個(gè)堿基起至第780個(gè)堿基止，起始密碼子為ATG，終止密碼子為 TAA，序列內(nèi)無內(nèi)含子。
[0007] 本發(fā)明的meso-2, 3-下二醇脫氨酶，命名為B1抓H，氨基酸序列為SEQIDNO. 2所 示；及任何對(duì)SEQIDNO. 2所示氨基酸序列中氨基酸進(jìn)行插入、缺失或替換的處理獲得的多 膚片段或其突變體。
[0008] 本發(fā)明進(jìn)一步設(shè)及產(chǎn)所述meso-2, 3-下二醇脫氨酶的基因工程菌或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞 系，具體制備方法如下：
[0009] 1)采用化學(xué)合成或PCR方法克隆編碼所述mes〇-2,3-下二醇脫氨酶的基因 B化化；
[0010] 2)將步驟1)獲得的B化化基因與質(zhì)粒祀T28a同時(shí)用限制性核酸內(nèi)切酶BamHI 和EcoRI雙酶切，然后使用T4DNA連接酶進(jìn)行連接，獲得重組表達(dá)載體祀T28a-B化化；
[0011] 3)將步驟2)獲得重組表達(dá)載體祀T28a-B化化轉(zhuǎn)化入大腸桿菌化21 0E3)中，獲 得重組基因工程菌化21 0E3) /祀T28a-B化化。
[0012] 本發(fā)明還進(jìn)一步設(shè)及一種meso-2, 3-下二醇脫氨酶生產(chǎn)制備方法，其包括如下步 驟：培養(yǎng)本發(fā)明的重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體，獲得重組還原酶。其中所述的重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體同前述介 紹，可通過將本發(fā)明的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至宿主微生物得到。
[0013] 其中，所述的培養(yǎng)重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體所用的培養(yǎng)基可本領(lǐng)域任何可使轉(zhuǎn)化體生長(zhǎng)并 產(chǎn)生本發(fā)明的脫氨酶的培養(yǎng)基，優(yōu)選LB培養(yǎng)基：蛋白腺lOg/l，酵母膏5g/l，化C1 10旨/1，抑 7. 0。培養(yǎng)方法和培養(yǎng)條件沒有特殊的限制，可W根君宿主細(xì)胞的類型和培養(yǎng)方法等因素的 不同按本領(lǐng)域普通知識(shí)進(jìn)行適當(dāng)?shù)倪x擇，只要使轉(zhuǎn)化體能夠生長(zhǎng)并產(chǎn)生脫氨酶即可。其他 培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體具體操作均可按本領(lǐng)域常規(guī)操作進(jìn)行。優(yōu)選下述方法：將表達(dá)本發(fā)明的脫氨酶 基因的重組大腸桿菌（優(yōu)選本發(fā)明的大腸桿菌化21 0E3))接種至含卡那霉素的LB培養(yǎng)基 中培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)液的光密度0D600達(dá)到0. 5-0. 7 (優(yōu)選0. 6)時(shí)，在終濃度為0. 1-1.Ommol/L (優(yōu)選0. 2mmol/L)的異丙基-P-D-硫代化喃半乳糖巧（IPTG)的誘導(dǎo)下，30°C誘導(dǎo)培養(yǎng)化 后，即可高效表達(dá)本發(fā)明的重組還原酶。離屯、收集菌體并細(xì)胞破碎獲得粗酶液，再用儀柱進(jìn) 行純化，獲得重組meso-2, 3-下二醇脫氨酶。
[0014] 所述的meso-2, 3-下二醇脫氨酶是NADH依賴的，分子量大小為120~130kDa，是 同源四聚體。該酶可W催化還原含兩個(gè)鄰位幾基的二酬底物及乙偶姻，且可W氧化2, 3-下 二醇。該酶還原雙乙酷的最適反應(yīng)抑為4. 5~5. 5,對(duì)底物乙偶姻有較寬的抑適用范圍 巧.0~8. 0)，而氧化2, 3-下二醇最適反應(yīng)pH為9. 0~11. 0。因此在酸性緩沖液中，該酶 主要發(fā)揮還原功能。無論是氧化還是還原，最適反應(yīng)溫度均為35~40°C。該酶對(duì)乙偶姻親 和力最大，Km為0. 47mmol?L1，且kcat/Km值最大，為432. 41L?mmol1 ?S1，說明乙偶姻是該 酶的最適底物。50°C下，保溫40min酶活下降至50%，說明該酶在50°C下的穩(wěn)定性并不突 出。該酶不依賴于金屬離子發(fā)揮催化功能。
[0015] 本發(fā)明更進(jìn)一步設(shè)及本發(fā)明的重組脫氨酶作為催化劑在不對(duì)稱還原雙乙酷W制 備（2S，3S) -2, 3-下二醇中的應(yīng)用。
[0016] 較佳的：所述的應(yīng)用按下述方法進(jìn)行：雙乙酷的濃度為10-500mmol/L;所述的重 組脫氨酶的用量為1-lOkU/L(酶活定義見實(shí)施例1);葡萄糖脫氨酶的用量為1-lOkU/L;所 述的葡萄糖的用量為20-1000mmol/L;所述的NAD+的用量為0. 1-1.Ommol/L;所述的憐酸鹽 緩沖液的濃度為0.lmol/1，抑6-8 ;所述的不對(duì)稱還原反應(yīng)的溫度為25-35°C;所述的不對(duì) 稱還原反應(yīng)的時(shí)間W反應(yīng)完全為準(zhǔn)，一般為1-12小時(shí)。不對(duì)稱還原反應(yīng)結(jié)束后，可按本領(lǐng)