本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域，涉及植物FER基因及其編碼蛋白和應(yīng)用，特別涉及大豆bHLH轉(zhuǎn)錄因子基因GmFER，其編碼蛋白，及其在提高酵母及煙草對(duì)鎘的耐受性中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

隨著社會(huì)的日益發(fā)展，非農(nóng)業(yè)建設(shè)用地迅速擴(kuò)張，廢棄物排放量以及農(nóng)業(yè)化肥使用量增加，土壤重金屬污染逐漸成為世界性環(huán)境問(wèn)題。鎘(Cd)是一種生物毒性很強(qiáng)的重金屬，半衰期非常長(zhǎng)，攝入過(guò)量會(huì)導(dǎo)致腎臟和骨骼的病變(參見(jiàn)Nawrot T.,Plusquin M.,Hogervorst J.,et al.,Environmental exposure to cadmium and risk of cancer:a prospective population-based study[J],Lancet Oncology,2006,7(2):119-126)。

大豆是在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上具有較高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的農(nóng)作物，含有豐富的蛋白質(zhì)和油脂，與人類的生活息息相關(guān)。但是，大豆極易積累重金屬(參見(jiàn)Wolnik K.A.,Fricke F.L.,Capar S.G.,et al.,Elements in major raw agricultural crops in the United States.1.Cadmium and lead in lettuce,peanuts,potatoes,soybeans,sweet corn,and wheat[J],J.Agric.Food Chem.,1983,31(6):1240-1244)，重金屬在植物體內(nèi)的大量積累，不僅嚴(yán)重影響植物的生長(zhǎng)和發(fā)育，而且會(huì)通過(guò)食物鏈危及人類的健康。

bHLH(basic/Helix-Loop-Helix，堿性/螺旋-環(huán)-螺旋)轉(zhuǎn)錄因子是植物轉(zhuǎn)錄因子中最大的家族之一。同一bHLH轉(zhuǎn)錄因子中的兩個(gè)α-螺旋之間或者不同bHLH轉(zhuǎn)錄因子的α-螺旋之間可以相互作用，形成同源或異源二聚體，與靶基因啟動(dòng)子結(jié)合，調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄(參見(jiàn)Ma P.C.M.,Rould M.A.,Weintraub H.,et al.,Crystal structure of MyoDbHLH domain-DNA complex:Perspectives on DNA recognition and implications for transcriptional activation[J],Cell,1994,77(3):451-459)。bHLH廣泛存在于植物的不同組織中，在植物的生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控過(guò)程中發(fā)揮極為重要的作用。擬南芥bHLH基因(FIT、AtbHLH38和AtbHLH39)參與了植物對(duì)Cd脅迫的響應(yīng)，組成性地啟動(dòng)了一些參與重金屬區(qū)隔化的基因(如HMA3、MTP3、IREG2和IRT2)的表達(dá)，從而將吸收的Cd大部分區(qū)隔化在根部，減少了向地上部的轉(zhuǎn)運(yùn)(參見(jiàn)Wu HL,Chen CL,Du J,et al.,Co-Overexpression FIT with AtbHLH38 or AtbHLH39 inArabidopsis-Enhanced Cadmium Tolerance via IncreasedCadmium Sequestration in Roots and Improved Iron Homeostasis of Shoots[J],Plant Physiology,2012,158:790-800)，但至今尚未有報(bào)道披露大豆bHLH轉(zhuǎn)錄因子基因的相關(guān)應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)上述情況，本發(fā)明根據(jù)同源克隆的方法，從栽培大豆的根系中克隆出一種bHLH轉(zhuǎn)錄因子基因GmFER，該基因?qū)d脅迫有響應(yīng)。分離與克隆大豆GmFER基因不僅有利于揭示大豆的抗Cd機(jī)制，還可以通過(guò)基因操作的手段進(jìn)行微生物或植物的抗Cd分子育種，以便提高抗Cd性。

具體而言，本發(fā)明提供了大豆bHLH轉(zhuǎn)錄因子基因GmFER，全長(zhǎng)972bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本發(fā)明還提供了由上述大豆bHLH轉(zhuǎn)錄因子基因GmFER編碼的蛋白，包含323個(gè)氨基酸(其中從N端第129位到第185位的氨基酸序列為bHLH轉(zhuǎn)錄因子的保守結(jié)構(gòu)域)，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

此外，包含如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列并且編碼如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的多核苷酸序列以及將如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列中的一個(gè)或多個(gè)(不多于十個(gè))氨基酸殘基進(jìn)行取代和/或缺失和/或添加并且具有轉(zhuǎn)錄激活功能、調(diào)控植物抗逆性的氨基酸序列也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

本發(fā)明還提供了包含上述大豆bHLH轉(zhuǎn)錄因子基因GmFER的表達(dá)載體，所述表達(dá)載體通過(guò)將上述大豆bHLH轉(zhuǎn)錄因子基因GmFER插入載體而得，所述載體選自p424GPD、pBI121、pCXSN、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pAHC25中的任意一種。

當(dāng)使用上述大豆bHLH轉(zhuǎn)錄因子基因GmFER構(gòu)建表達(dá)載體時(shí)，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種組成型、組織特異型、誘導(dǎo)型或增強(qiáng)型啟動(dòng)子。為了便于對(duì)轉(zhuǎn)基因微生物或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對(duì)所用表達(dá)載體進(jìn)行加工，如加入具有抗性的抗生素標(biāo)記物(如卡那霉素標(biāo)記物、潮霉素標(biāo)記物等)、抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因(如抗除草劑bar基因等)或可產(chǎn)生顏色變化的酶或蛋白(如GUS基因、GFP基因等)等。

本發(fā)明還提供了包含上述大豆bHLH轉(zhuǎn)錄因子基因GmFER的工程菌，所述工程菌中的宿主為大腸桿菌或酵母菌，通過(guò)PEG/LiAc介導(dǎo)的方法將上述大豆bHLH轉(zhuǎn)錄因子基因GmFER轉(zhuǎn)入。

本發(fā)明還提供了包含上述大豆bHLH轉(zhuǎn)錄因子基因GmFER的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系，所述植物為煙草，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法將上述大豆bHLH轉(zhuǎn)錄因子基因GmFER轉(zhuǎn)入。

本發(fā)明還提供了一對(duì)用于擴(kuò)增上述大豆bHLH轉(zhuǎn)錄因子基因GmFER的引物，其中正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

本發(fā)明還提供了上述大豆bHLH轉(zhuǎn)錄因子基因GmFER及其編碼蛋白和包含其的表達(dá)載體在提高酵母對(duì)Cd的耐受性中的應(yīng)用。通過(guò)將大豆bHLH轉(zhuǎn)錄因子基因GmFER導(dǎo)入酵母中，提高了酵母的抗Cd性。此外，上述大豆bHLH轉(zhuǎn)錄因子基因GmFER及其編碼蛋白和包含其的表達(dá)載體在提高植物(優(yōu)選單子葉和雙子葉植物)對(duì)Cd的耐受性中的應(yīng)用也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

本發(fā)明提供的大豆bHLH轉(zhuǎn)錄因子基因GmFER來(lái)自大豆(Williams 82品種)，半定量PCR檢測(cè)結(jié)果表明GmFER基因主要在大豆的根中表達(dá)。在Cd脅迫后，其表達(dá)量明顯提高，說(shuō)明該基因受Cd誘導(dǎo)。在酵母中過(guò)表達(dá)GmFER基因能夠提高酵母對(duì)Cd的耐受性，并能提高轉(zhuǎn)GmFER基因煙草對(duì)Cd的耐受性。因此，GmFER基因可以作為目的基因?qū)胫参?包括單子葉和雙子葉植物)，從而提高植物對(duì)Cd的耐受性，具有較高的應(yīng)用價(jià)值。

附圖說(shuō)明

圖1為大豆bHLH轉(zhuǎn)錄因子基因GmFER編碼蛋白與其他植物bHLH結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列多重比對(duì)結(jié)果，其中：GmFER-like來(lái)自大豆，LjbHLH21來(lái)自百脈根，MtbHLH來(lái)自蒺藜苜蓿，AtFER來(lái)自擬南芥，AtbHLH來(lái)自擬南芥。

圖2為GmFER的進(jìn)化樹(shù)分析圖，其中：GmFER-like(Glycine max,XP_003541980.1)；LjbHLH21(Lotus japonicus,ACN21647.1)；MtbHLH(Medicago truncatula,XP_003606331.1)；AtFER-like(Arabidopsis thaliana,NP_850114.1)；AtbHLH(Arabidopsis thaliana,AAM10938.1)；VvFER-like(Vitis vinifera,XP_002272647.1)；SlbHLH(Solanum lycopersicum,NP_001234654.1)；ZmbHLH(Zea mays,DAA38198.1)；BnbHLH(Brassica napus,CAD54298.1)；VvbHLH35(Vitis vinifera,XP_002263999.1)。

圖3為GmFERmRNA在葉、莖和根中表達(dá)豐度的半定量PCR檢測(cè)結(jié)果。

圖4為采用100μM的CdCl₂處理不同時(shí)間后對(duì)GmFERmRNA表達(dá)影響的半定量PCR檢測(cè)結(jié)果。

圖5為酵母表達(dá)載體的構(gòu)建示意圖，其中：A為p424GPD空載體物理圖譜；B為p424GPD::GmFER植物表達(dá)載體物理圖譜。

圖6為GmFER基因?qū)τ诮湍笇?duì)Cd的耐受性的影響的檢測(cè)結(jié)果。

圖7為pCXSN::GmFER植物表達(dá)載體示意圖。

圖8為轉(zhuǎn)基因煙草在CdCl₂脅迫下的根長(zhǎng)生長(zhǎng)情況，其中：WT表示野生型煙草，T表示轉(zhuǎn)基因煙草。

具體實(shí)施方式

以下將結(jié)合附圖和具體實(shí)施例來(lái)說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案。應(yīng)當(dāng)理解的是，這些實(shí)施例僅用于舉例說(shuō)明本發(fā)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。除非另有說(shuō)明，下列實(shí)施例中所使用的術(shù)語(yǔ)具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的含義，未注明的實(shí)驗(yàn)方法均可按照常規(guī)方法進(jìn)行，例如參照J(rèn).薩姆布魯克(Sambrook J.)和D.W.拉塞爾(Russell D.W.)著《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(科學(xué)出版社，2005)或者按照生物試劑生產(chǎn)廠商的使用說(shuō)明中記載的條件。另外，下列實(shí)施例中所使用的儀器、材料、試劑均可通過(guò)常規(guī)商業(yè)手段獲得。

實(shí)施例1：大豆bHLH轉(zhuǎn)錄因子基因GmFER的克隆。

利用生物信息學(xué)和常規(guī)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)相結(jié)合的方法克隆大豆GmFER基因的DNA序列，具體方法如下所述：

以Williams 82品種大豆的根系作為實(shí)驗(yàn)材料，采用SV Total RNAlysis試劑盒(Promega公司，美國(guó))提取總RNA。按照TaKaRa公司提供的方法，采用PrimeScript^TM逆轉(zhuǎn)錄酶合成出cDNA，并以其作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增過(guò)程中使用的一對(duì)引物P1(如SEQ ID NO:3所示，由上海生物工程公司合成)和P2(如SEQ ID NO:4所示，由上海生物工程公司合成)則根據(jù)NCBI中已知的GmFER序列進(jìn)行設(shè)計(jì)與合成：

P1：5’-ATGGATGTTCACGAAGACACACTCA-3’；

P2：5’-TCAAGCAGGAAAAGATGCCACGAAT-3’。

通過(guò)RT-PCR方法擴(kuò)增，獲得GmFER基因完整的開(kāi)放閱讀框(ORF)片段。25μlPCR反應(yīng)體系如下：含MgCl₂的10×PCR緩沖液2.5μl，正向、反向引物各1.0μl(10μM)，dNTP(10mM)1.0μl，cDNA樣品2.0μl，Ex-Taq酶(寶生物工程(大連)有限公司)0.25μl，雙蒸水17.5μl。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，58℃復(fù)性45s，72℃延伸1min，30個(gè)循環(huán)后，72℃延伸10min。將擴(kuò)增得到的大約800bp的DNA片段進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分離，采用凝膠回收試劑盒(杭州愛(ài)思進(jìn)生物技術(shù)有限公司)并按照試劑盒中提供的方案進(jìn)行回收，并克隆到pEASY-T1(Clontech)載體上，進(jìn)行測(cè)序分析(由上海invitrogen公司完成)，測(cè)序結(jié)果和NCBI中的GmFER基因序列完全相同。

實(shí)施例2：GmFER轉(zhuǎn)錄本的時(shí)空分布以及Cd脅迫對(duì)GmFER基因表達(dá)的影響。

利用半定量PCR的方法，檢測(cè)GmFER在大豆植株中的組織分布情況，并采取以下措施保證檢測(cè)結(jié)果的可靠性：利用擴(kuò)增級(jí)別DNase I消化提取的總RNA中可能存在的少量的基因組DNA的污染，為了檢測(cè)基因組DNA是否消除干凈，可以取出一部分用DNase I消化的總RNA樣品進(jìn)行常規(guī)PCR反應(yīng)。當(dāng)發(fā)現(xiàn)沒(méi)有擴(kuò)增條帶產(chǎn)生時(shí)，再進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄步驟，同時(shí)為了進(jìn)一步驗(yàn)證實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增的條帶是否就是GmFER，將PCR產(chǎn)物切膠回收進(jìn)行測(cè)序。具體方法為：取大豆不同生長(zhǎng)時(shí)期根、莖、葉、花和莢等材料提取總RNA為模板，半定量PCR的引物為P1和P2。

以大豆激動(dòng)蛋白(GmActin)cDNA作為內(nèi)參，半定量PCR引物P3(如SEQ ID NO:5所示，由上海生物工程公司合成)和P4(如SEQ ID NO:6所示，由上海生物工程公司合成)的核苷酸序列如下：

P3(actin-F)：5’-CGGTGGTTCTATCTTGGCATC-3’；

P4(actin-R)：5’-GTCTTTCGCTTCAATAACCCTA-3’。

先取1μg總RNA，加入擴(kuò)增級(jí)別DNase I(Sigma公司，美國(guó))，于室溫放置30min以除去基因組DNA的污染，然后加入停止緩沖液(50mM EDTA)，于70℃加熱10min變性DNase I和RNA，然后采用寶生物工程(大連)有限公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒并按照試劑盒中說(shuō)明書(shū)記載的方法進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，每個(gè)樣品取1μg總RNA，于42℃反應(yīng)1h，于70℃加熱10min后取出，置于冰上，以使反轉(zhuǎn)錄酶失活，最后取1μl反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行半定量PCR擴(kuò)增，檢測(cè)結(jié)果如圖3所示，從中可以看出GmFER基因主要在大豆根系中表達(dá)。

為了研究GmFER基因?qū)d脅迫的響應(yīng)，采用半定量PCR的方法檢測(cè)GmFER基因在Cd脅迫下的表達(dá)模式。將三葉期大豆以100μM的CdCl₂處理0h、1h、3h和24h，以未做任何處理的三葉期大豆作為對(duì)照，然后采用與上述相同的方法檢測(cè)大豆根系中GmFER基因的表達(dá)情況，同樣以大豆的actin(激動(dòng)蛋白)cDNA作為內(nèi)參，以P1和P2作為引物，檢測(cè)結(jié)果如圖4所示，從中可以看出，在Cd脅迫后，大豆根系中GmFER的表達(dá)量表現(xiàn)出先下降后上升的趨勢(shì)。

實(shí)施例3：包含GmFER基因的酵母表達(dá)載體的構(gòu)建以及轉(zhuǎn)基因酵母對(duì)Cd的耐受性檢測(cè)。

(1)酵母表達(dá)載體的構(gòu)建：

以GmFERcDNA全長(zhǎng)序列為模板，在含有酶切位點(diǎn)的正向引物P5(如SEQ ID NO:7所示，由上海生物工程公司合成)和反向引物P6(如SEQ ID NO:8所示，由上海生物工程公司合成)的引導(dǎo)下，PCR擴(kuò)增5’端添加BamHI識(shí)別位點(diǎn)、3’端添加SmaI識(shí)別位點(diǎn)的GmFERcDNA全長(zhǎng)序列，引物的核苷酸序列如下：

P5：5′-CGCGGATCCATGGATGTTCACGAAGACACACTCA-3′(帶下劃線的堿基為限制內(nèi)切酶BamHI識(shí)別位點(diǎn))；

P6：5′-TCCCCCGGGTCAAGCAGGAAAAGATGCCACGAAT-3′(帶下劃線的堿基為限制內(nèi)切酶SmaI識(shí)別位點(diǎn))。

反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.0％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，回收并純化972bp的目的片段，將其用BamHI和SmaI酶切后，與經(jīng)相同酶雙酶切的載體p424GPD采用T₄DNA連接酶于4℃連接過(guò)夜(20μl反應(yīng)體系含1×T₄DNA連接酶緩沖液，p424GPD片段0.03pmol，GmFER片段0.3pmol，T₄DNA連接酶350U)。

將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞(轉(zhuǎn)化方法參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第二版，1992，科學(xué)出版社，第55～56頁(yè))，將轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌DH5α細(xì)胞懸液涂布在含有80mg/L氨芐青霉素的平板上，將對(duì)抗氨芐青霉素的陽(yáng)性克隆進(jìn)行擴(kuò)增并提取質(zhì)粒，采取酶切和測(cè)序的方法驗(yàn)證連接的正確性，得到酵母表達(dá)載體p424GPD::GmFER(如圖5所示)。

(2)PEG/LiAc法介導(dǎo)的酵母轉(zhuǎn)化與篩選鑒定：

采用PEG/LiAc法轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞W303B，涂布在缺色氨酸(-Trp)的SD固體培養(yǎng)基上，于30℃培養(yǎng)3d，從培養(yǎng)平板中挑取單克隆進(jìn)行PCR檢測(cè)，采用引物P1和P2，25μl PCR反應(yīng)體系如下：含MgCl₂的10×PCR緩沖液2.5μl，正向、反向引物各1.0μl(10μM)，dNTP 1.0μl(10mM)，基因組DNA模板1.0μl，雙蒸水18.5μl，以及Ex-Taq酶(寶生物工程(大連)有限公司)0.25μl。擴(kuò)增反應(yīng)條件如下：95℃預(yù)變性4min，95℃變性30s，62℃復(fù)性50s，72℃延伸1min，35次循環(huán)后，72℃延伸min。將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，在鑒定的9個(gè)單克隆中有3個(gè)陽(yáng)性轉(zhuǎn)p424GPD::GmFER的單克隆，得到含有p424GPD::GmFER的酵母菌株。

(3)基因功能分析：

把含有p424GPD::GmFER表達(dá)載體的酵母及帶有空載體p424GPD的酵母分別以1％的接種量接種于100ml缺色氨酸(-Trp)的SD液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜，直至OD600＝1，用SD(-Trp)液體培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋至OD600＝0.1、0.01、0.001，分別滴在含有50μMCdCl₂和不含有CdCl₂的SD(-Trp)固體培養(yǎng)基上，于30℃培養(yǎng)3d，觀察菌落的生長(zhǎng)情況，其結(jié)果如圖6所示。

從圖6中可以看出，在含有50μM CdCl₂的培養(yǎng)基上，含有p424GPD::GmFER表達(dá)載體的酵母明顯比帶有空載體p424GPD的酵母生長(zhǎng)得好，帶空載體p424GPD的酵母菌株在含有50μM CdCl₂的培養(yǎng)基上幾乎不能生長(zhǎng)。由此可見(jiàn)，GmFER基因能夠提高酵母對(duì)Cd的耐受性。將GmFER基因作為目的基因?qū)胫参?包括單子葉和雙子葉植物)也可以提高植物對(duì)Cd的耐受性，具有較高的應(yīng)用價(jià)值。

實(shí)施例4：包含GmFER基因的植物表達(dá)載體的構(gòu)建以及轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)Cd的耐受性檢測(cè)。

(1)植物表達(dá)載體的構(gòu)建：

以GmFERcDNA全長(zhǎng)序列為模板，通過(guò)P和P2進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.0％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，回收并純化972bp的目的片段，通過(guò)TA克隆的方法，把GmFER的ORF連接到植物表達(dá)載體pCXSN。

將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞(轉(zhuǎn)化方法參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第二版，1992，科學(xué)出版社，第55～56頁(yè))，將轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌DH5α細(xì)胞懸液涂布在含有80mg/L卡那霉毒的平板上，將卡那霉毒的陽(yáng)性克隆進(jìn)行擴(kuò)增并提取質(zhì)粒，采取測(cè)序的方法驗(yàn)證連接的正確性，得到植物表達(dá)載體pCXSN::GmFER(如圖7所示)。采用凍融轉(zhuǎn)化法將此載體轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌EH105，得到含有pCXSN::GmFER的農(nóng)桿菌菌株。

(2)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草轉(zhuǎn)化與篩選鑒定：

從培養(yǎng)平板中挑取單個(gè)農(nóng)桿菌菌落，在2ml YEB培養(yǎng)基(含有50mg/L卡那霉素、30mg/L利福平)中培養(yǎng)過(guò)夜；以1％的接種量接種于100ml YEB培養(yǎng)基(含有50mg/L卡那霉素、30mg/L利福平)中培養(yǎng)過(guò)夜，6000rpm離心收集菌體，用侵染培養(yǎng)基重新懸浮，菌液濃度調(diào)整至OD₆₀₀約為0.5，作為侵染菌液。采用葉圓盤(pán)轉(zhuǎn)化法，用無(wú)菌刀片將無(wú)菌煙草試管苗葉片切成4～6mm的葉盤(pán)，葉盤(pán)外植體在OD₆₀₀約0.5的pCXSN::GmFER農(nóng)桿菌侵染溶液中感染10min，取出后用無(wú)菌濾紙吸干表面液體，放入含有共培養(yǎng)液(MS基本培養(yǎng)基加6-芐氨基嘌呤1.0mg/L、萘乙酸0.1mg/L、蔗糖30g/L，pH＝5.8)的濾紙上黑暗條件下，25℃共培養(yǎng)2天。經(jīng)共培養(yǎng)2天的葉盤(pán)用含有500mg/L的羧芐青霉素水溶液洗滌3次，用無(wú)菌濾紙吸干表面液體轉(zhuǎn)入篩選分化培養(yǎng)基中，25℃光照培養(yǎng)。轉(zhuǎn)化體的篩選在篩選分化培養(yǎng)基(MS基本培養(yǎng)基加6-芐氨基嘌呤1.0mg/L、萘乙酸0.1mg/L、卡那霉素80mg/L、羧芐青霉素400mg/L、蔗糖30g/L，pH＝5.8)中進(jìn)行。待葉片邊緣長(zhǎng)出叢生再生芽至2～3cm時(shí)，用解剖刀將再生芽切下，并轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基(MS基本培養(yǎng)基加卡那霉素50mg/L、蔗糖20g/L，pH＝5.8)中培養(yǎng)25天。轉(zhuǎn)化細(xì)胞再生的植株具有卡那霉素抗性，為正常綠色植株，獲得轉(zhuǎn)基因植株。

提取pCXSN::GmFER轉(zhuǎn)基因煙草基因組DNA，以基因組DNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，并回收PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。為了進(jìn)一步鑒定轉(zhuǎn)基因植株，提取通過(guò)基因組檢測(cè)為陽(yáng)性的轉(zhuǎn)pCXSN::GmFER煙草葉片總RNA，用1μg葉片總RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄試劑盒(寶生物工程(大連)有限公司)按試劑盒的方法反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，PCR引物為實(shí)例4中的引物P1和P2，25μl PCR反應(yīng)體系含2.5μl含MgCl₂的10×PCR緩沖液、正、反向10μM的引物各1.0μl、1.0μl 10mM的dNTP(脫氧核苷酸混合物)、1.0μl cDNA模板和18.5μl雙蒸水，以及0.25μl rTaq酶(寶生物工程(大連)有限公司)。擴(kuò)增反應(yīng)條件如下：95℃預(yù)變性4min，95℃30s，55℃50s，72℃1min，33次循環(huán)，72℃延伸10min。將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，獲得GmFER基因進(jìn)行正常表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株。

(3)基因功能分析：

將轉(zhuǎn)基因煙草T0代種子及野生型種子在濾紙上進(jìn)行萌發(fā)，28℃的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，10天后，取出大小生長(zhǎng)一致的轉(zhuǎn)GmFER基因陽(yáng)性煙草苗與對(duì)照煙草苗，將其分別轉(zhuǎn)移至含有50μM CdCl₂的濾紙上，在28℃的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，處理4天后，測(cè)量根長(zhǎng)，其結(jié)果如圖8所示。結(jié)果顯示，GmFER基因在煙草中的過(guò)量表達(dá)能夠提高煙草轉(zhuǎn)基因植株對(duì)Cd脅迫的抗性。