背景技術：
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通過對擬南芥的研究發(fā)現(xiàn)，在花發(fā)育相關基因中大多數(shù)基因均屬于MADs-box家族的基因，唯獨AP2基因具有獨特的AP2結構域，該結構域是一個DNA結合結構域，由60到70個左右保守的氨基酸殘基組成的3個反向平行的β-折疊和一個兩親性的α-螺旋構成。AP2/EREBP轉錄因子家族根據(jù)其所含AP2結構域數(shù)量的不同可分為三類：含有2個AP2結構域的AP2亞家族、含有一個AP2結構域的EREBP亞家族以及含有一個AP2結構域和一個B3結構域的RAV1和RAV2。1994年Jofuku等在擬南芥中發(fā)現(xiàn)了AP2(APETALA2)轉錄因子，同時首次鑒定出了AP2基因的AP2/EREBP結構域。1995年Ohme-Talagi等成功從煙草中分離出4個乙烯反應結合蛋白EREBPs。相關報道表明AP2亞家族在生殖器官和營養(yǎng)器官的發(fā)育中具有關鍵的調節(jié)作用。在擬南芥的花器官發(fā)育過程中，A類功能基因AP2可以抑制C類功能基因AG(AGAMOUS)在外輪花器官萼片和花瓣中的表達，對萼片和花瓣的發(fā)育起著重要的作用，AP2基因不僅在花器官中有表達，在莖、葉和種子等非花組織中也有表達。金魚草中的LIP1和LIP2均屬于AP2轉錄因子家族，作為A類基因的它們在金魚草萼片、花瓣和胚珠的發(fā)育過程中都具有決定性的作用。但與AP2基因不同的是，LIP基因并不抑制C類基因的表達。AP2基因在種子的發(fā)育過程中也起著重要作用，它可以決定種子的大小、重量以及油類物質和蛋白質的積累。蘋果的MAP2A基因在花芽、萼片、花瓣、雌雄蕊、子房等花器官以及非花器官葉片中均有表達，說明MAP2A可以調控花器官和營養(yǎng)器官的發(fā)育。葡萄的Vv-AP2基因對葡萄的營養(yǎng)器官和生殖器官的發(fā)育具有不同的作用。植物的分生組織既有不斷的分化出新的組織器官的能力，又要維持自身的分生能力。AP2基因可以維持植物分生組織的分生能力。水稻SNB(SUPERNUMERARY BRACT)是AP2亞族轉錄因子，它可以調控穗分生組織向花分生組織轉變以及花器官發(fā)育。玉米IDS1(INDETERMINATE SPIKELET1)是擬南芥AP2基因的同源基因，可以通過調控小穗分生組織特性來調控花序的發(fā)育。目前，對于白樺的AP2基因的功能尚不清楚，也沒有涉及白樺AP2基因序列及其功能的相關專利報道。

技術實現(xiàn)要素：
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本發(fā)明提供一種從白樺中克隆白樺花發(fā)育相關基因AP2的方法：

(1)先采用改良的CTAB法提取白樺雌花RNA，用ThermoScriptTM RT-PCR System反轉錄試劑盒，合成cDNA第一鏈；

(2)設計含有酶切位點(XbaI和SmaI)克隆白樺AP2編碼區(qū)全長的PCR引物；引物序列為：正向引物：AP2-F：5′-GCGCTTCTAGAATGTGGGATCTCAATGACTCG-3′；反向引物：AP2-R：5′-GTATCCCGGGATAGAGGGTCTCATGAGAGAAT-3′

(3)利用引物AP2-F和AP2-R對合成的cDNA進行PCR擴增，獲得一個AP2轉錄因子基因的全長cDNA，命名為白樺AP2；

PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)測序，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示；其編碼蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示；

本發(fā)明構建了白樺AP2基因的植物表達載體，構建的植物表達載體(pBI121-AP2)經(jīng)農桿菌浸染擬南芥植株，獲得轉基因擬南芥植株且轉基因純系植株所結種子中游離脂肪酸含量及可溶性蛋白含量均有所下降，表明該基因具有降低擬南芥種子游離脂肪酸及可溶性蛋白含量的功能并且能夠調控兩種物質的生物合成途徑。

構建白樺AP2基因植物表達載體的技術方案如下：

選擇pBI121載體作為基本植物表達載體，在pBI121上選擇XbaI和SmaI兩個酶切位點，設計帶有酶切位點和保護堿基的白樺AP2引物，并克隆出白樺AP2基因全長。雙酶切質粒和白樺AP2基因，再用T4連接酶進行連接，檢測構建的載體pBI121-AP2。

本發(fā)明提供的白樺AP2基因在調節(jié)擬南芥種子游離脂肪酸含量及可溶性蛋白含量中的應用。將上述植物表達載體pBI121-AP2轉化農桿菌EHA105，經(jīng)農桿菌介導的浸花法浸染，獲得白樺AP2過表達的轉基因擬南芥植株，經(jīng)抗性篩選及PCR檢測最終得到4個轉基因陽性純合株系：line5，line6，line9，line15，白樺AP2可以降低轉基因擬南芥種子游離脂肪酸和可溶性蛋白的含量，與野生型非轉基因植株相比，轉基因純合擬南芥種子游離脂肪酸含量降低28.48％-32.68％；可溶性蛋白含量降低8.42％-40.64％。構建的植物表達載體(pBI121-AP2)能夠降低轉基因擬南芥種子中游離脂肪酸以及可溶性蛋白的含量，為今后利用轉基因技術調節(jié)白樺種子中游離脂肪酸以及可溶性蛋白含量的研究提供了理論基礎與基因資源。

本發(fā)明與現(xiàn)有的技術相比具有如下有益效果：

1、本發(fā)明提供了降低種子游離脂肪酸以及可溶性蛋白含量的白樺AP2蛋白，可用于改進與植物游離脂肪酸以及可溶性蛋白含量，并且可用于搜尋在其他植物中調控游離脂肪酸以及可溶性蛋白合成的相關基因。

2、本發(fā)明提供的含有白樺AP2基因重組載體，可有效控制種子中游離脂肪酸以及可溶性蛋白的含量。

3、本發(fā)明提供的白樺AP2基因具有調控種子中游離脂肪酸以及可溶性蛋白的含量的功能，可用于植株游離脂肪酸以及可溶性蛋白的含量相關的發(fā)育研究中，并為植物游離脂肪酸以及可溶性蛋白合成相關基因的功能研究提供參考資源。

附圖說明

圖1為白樺AP2基因全長cDNA的PCR擴增顯示圖。

圖2為植物表達載體pBI121-AP2構建流程圖。

圖3為植物表達載體pBI121-AP2PCR檢測圖。

圖4為植物表達載體pBI121-AP2質粒提取檢測圖。

圖5為轉基因過表達白樺AP2擬南芥植株PCR驗證圖。

圖6為野生型擬南芥種子于過表達白樺AP2擬南芥種子的重量、種子中游離脂肪酸以及可溶

性蛋白含量統(tǒng)計圖。

具體實施方式：

下面結合具體實施例對本發(fā)明作進一步說明。

下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。

實施例1：白樺AP2基因的克隆

(1)植物材料的獲得

實驗材料白樺雌花，采自東北林業(yè)大學白樺林。采集后立即冷藏到-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?2)白樺RNA的抽提

白樺總RNA使用改良的CTAB法步驟進行，使用瓊脂糖凝膠電泳、紫外分光光度計測總RNA的純度和濃度。用ThermoScript^TM RT-PCR System反轉錄試劑盒合成cDNA第一鏈，然后用AP2-F和AP2-R進行PCR擴增，PCR反應體系：cDNA模板1μl，10×Buffer 5μl，dNTP(2.5mM)4μl，正反向引物各2μl(10μM)，Taq Plus DNA polymerase 1μl，滅菌蒸餾水補足50μl。PCR擴增條件為：94℃預變性5min；94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min30s，35個循環(huán)；72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0％瓊脂糖凝膠電泳分離，回收目的條帶后與pMD19T連接，連接體系如下：目的基因4μl，T easy vector 1μl，Solution I 5μl。連接產(chǎn)物轉化大腸桿菌，提取質粒并測序。

白樺AP2核苷酸序列分析

白樺AP2基因序列長為1554bp，序列見序列表SEQ ID NO:1，通過BLASTN序列分析結果表明，白樺AP2cDNA與擬南芥(Arabidopsis thaliana)、毛果楊(Populus trichocarpa)相似性高達70％以上。

白樺AP2基因編碼的蛋白質序列分析

白樺AP2基因總共編碼517個氨基酸，序列見序列表SEQ ID NO:2，通過BLASTP進行序列比對，結果表明，與白樺AP2氨基酸序列與毛果楊(Populus trichocarpa)、蓖麻(Ricinus communis)的親緣關系最接近。

實施例2：白樺AP2基因的植物表達載體構建

(1)白樺AP2的雙酶切并進行檢測

植物表達載體雙酶切步驟如下：

克隆載體和植物雙元載體pBI121都用XbaI和SmaI雙酶切，酶切體系如下：DNA 2μg，10×FD buffer 2μl，XbaI 1μl，SmaI 1μl，滅菌蒸餾水補足20μl?；靹蚝?7℃孵育2～3h，65℃孵育5min。雙酶切產(chǎn)物經(jīng)0.8％瓊脂糖凝膠電泳，按OMEGA回收試劑盒步驟回收目的片段。

(2)雙酶切產(chǎn)物的連接

16℃過夜連接，連接體系如下：目的基因10μl，pBI121載體片段4μl，T4連接酶1μl，T4buffer 2μl，滅菌蒸餾水補足20μl

(4)轉化大腸桿菌及檢測

將雙酶切后的連接產(chǎn)物直接轉到大腸桿菌中，使其大量表達，富集表達載體的濃度。接著將轉化產(chǎn)物接種于含有卡那霉素(50μg/mL)的LB固體培養(yǎng)基上，平板倒置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12-18h。擴大培養(yǎng)的菌液進行菌液PCR鑒定。

實施例3：白樺AP2基因在擬南芥中過表達功能分析

(1)擬南芥無菌苗的培養(yǎng)：

a)取適量種子于離心管中，加入適量無菌蒸餾水，充分漩渦震蕩，短時瞬離，將漂浮的種子和無菌水一起吸出。

b)加入1ml 70％的乙醇，漩渦震蕩10s，使種子充分懸浮于乙醇溶液中，吸出乙醇(乙醇消毒時間不宜過長，避免乙醇滲入，降低種子活性)，加入無菌ddH₂O，震蕩清洗2遍。

c)加入1ml 10％次氯酸鈉，漩渦充分震蕩5min，12000rpm離心1min，超凈工作臺中，用1ml無菌ddH₂O，震蕩清洗3-5遍，直至離心管內溶液變?yōu)闊o色，降低殘余次氯酸鈉對種子的影響。

d)將洗好的無菌種子均勻鋪于MS培養(yǎng)基表面，待培養(yǎng)基表面水分稍干后，封好封口膜，并做好標記。

e)將密封好的培養(yǎng)基放入4℃冰箱中春化處理2-3天，目的是打破種子休眠。

f)取出春化后的平板放入培養(yǎng)架上光照培養(yǎng)(16h light/8h dark)

g)待幼苗生長10d左右，長出兩片真葉時即可將其大量移栽至已高溫滅菌并澆過飽和營養(yǎng)液的土壤中培養(yǎng)。

(2)農桿菌介導的浸花法轉化擬南芥

a)農桿菌培養(yǎng)：平板上挑取EHA105菌株的一個單菌落，接種到20m1附加相應抗生素的細菌培養(yǎng)液體培養(yǎng)基(pH7.0)中，在恒溫搖床上，于27℃，180r/min培養(yǎng)至為0.6-1.0。將菌液轉入新配制的無激素相應液體培養(yǎng)基中，稀釋至OD₆₀₀為0.2-0.3時即可用于轉化；

b)可選步驟：當擬南芥長出主花序后，從其底部將花序全部剪掉，4-6d后花序會重新抽出，此步驟能夠保證各個植株的花序生長狀況基本相同并延遲開花。

c)侵染前先將植株澆水至飽和，然后減去已經(jīng)開放的花朵和角果，將花序和蓮座葉一同侵入農桿菌侵染溶液中30s，至植株表面覆蓋一層液體膜。

d)侵染后用吸水紙將植株表面多余的農桿菌侵染溶液吸干，用保鮮膜包裹植株。

e)用牛皮紙將所有侵染過的擬南芥遮蓋起來，放于避光條件下暗培養(yǎng)24h。

f)去除遮蓋的牛皮紙將植株放在16h長日照的條件下正常培養(yǎng)，正常澆水，待植株長高后可插入竹簽將植株綁到竹簽上防止植株倒伏，當長角果變黃即將炸裂開時即可收取種子。

(3)抗性植株的篩選及PCR檢測

將收集到的種子，無菌培養(yǎng)于含有終濃度為50μg/ml Kan的MS培養(yǎng)基上，方法同擬南芥無菌苗的培養(yǎng)，將篩選出的抗性植株進行PCR檢測，轉白樺AP2基因擬南芥的PCR檢測所使用得引物分別為BplAP2特異性引物(AP2-F2：5′-ACTGCCTCTGCTGGTGC-3′和AP2-R2：5′-GAATGCTGTCCCGTTGC-3′)、NPTⅡ引物(NPTⅡ-F：5′-GGGCACAACAGACAATCG-3′和NPTⅡ-R：5′-ATCACGGGTAGCCAACG-3′)，PCR反應體系為20μl，組成成分各體積分別為：Template(DNA模板)，2μl；Primer-F(10μM)，1μl；Primer-R(10μM)，1μl；2×Taq PCR MasterMix，10μl；加ddH₂O補至20μl。PCR擴增條件為：94℃預變性5min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸，45s，30個循環(huán)；72℃延伸10min。利用抗性篩選及PCR檢測的方法篩選出抗性純合株系，進行后續(xù)實驗。

將獲取的轉基因擬南芥植株提取DNA，以無菌水和未進行基因轉化的DNA為模板作陰性對照，以測序確認的pBI121-AP2質粒為模板作陽性對照。擴增后各取5μl PCR產(chǎn)物在1％的凝膠中電泳，進行PCR檢測。對檢測為陽性的純合擬南芥植株和野生型擬南芥植株個24株，進行種子生物量的測量，結果如圖6所示，為具體分析白樺AP2轉基因種子于野生型擬南芥種子生物量差異的顯著性，對白樺AP2轉基因植株和野生型擬南芥植株種子生物量進行量化分析，統(tǒng)計結果如表1所示。與野生型非轉基因植株相比，轉基因純合擬南芥種子重量下降10％-15％；種子中游離脂肪酸含量降低28.48％-32.68％；種子中可溶性蛋白含量降低8.42％-40.64％。

上述結果表明，白樺AP2基因過表達可降低擬南芥種子中游離脂肪酸含量及可溶性蛋白含量，使轉基因擬南芥種子重量降低，說明白樺AP2基因可以通過調控種子中游離脂肪酸及可溶性蛋白的合成來調節(jié)種子的重量，可為后續(xù)研究提高作物種子產(chǎn)量提供一定科學依據(jù)。

表1：白樺AP2轉基因擬南芥與野生型擬南芥種子生物量比較

注：表中重量及兩種物質含量均為Mean±SD，比率值為轉白樺AP2基因植株與野生型植株含量差值。