本發(fā)明涉及一種腈水解酶突變體，特別涉及一種腈水解酶突變體及其編碼基因，以及其在制備光學活性2-芳基丙酸中的應用。
背景技術：
：在有機合成中，氰基易作為“水穩(wěn)定負碳離子”引入有機化合物，而腈類化合物則是一種多用途的中間體，能轉化為胺、酰胺、羧酸和羧基化合物等。用微生物酶水解腈為酰胺和羧酸時，由于反應條件溫和以及高純度的產物使之成為一種備受關注的方法，迄今在工業(yè)生產上已有許多成功的例子。近年來，頗有意義的是研究用微生物酶立體選擇性水解腈類制備光學活性2-芳基丙酸(2-APA)，光學活性2-APA可作為藥物活性基質，特別是作為非甾體抗炎藥(NSAID)應用。由于藥理臨床的研究表明2-APA類的NSAID的對映體中只有右旋的構型顯示高的藥理活性，左旋構型活性低或無作用。鑒于一般化學反應所產生的手性中心總是得到等量的一對對映體混合物，稱之為外消旋體。欲得到光學純右旋2-APA，拆分外消旋體是主要方法之一。一般來說采用化學拆分需用手性衍生試劑，價格昂貴，且過程冗長，較難得到滿意的結果。而用微生物酶法拆分則可提供一個經濟的選擇。酮洛芬(Ketoprofen，KP)又名酮基布洛芬、苯酮苯丙酸、優(yōu)布芬、優(yōu)洛芬或Profenid，化學名為α-甲基-3-苯甲?；揭宜?，是由法國化學家Farge、Messer和Moutounier于1967年開發(fā)的優(yōu)良的2-芳基丙酸類非甾體抗炎鎮(zhèn)痛藥物。其作用機制主要是通過抑制體內環(huán)氧合酶(COXs)、脂氧化酶(LOXs)的生物活性，從而抑制致炎物質前列腺素(PGs)、白三烯(LTs)的合成，具有對抗緩激肽釋放、清除羥自由基以及穩(wěn)定溶酶體膜活性，從而產生良好的解熱、鎮(zhèn)痛和抗炎作用，并增強其外周止痛效果。臨床研究表明，酮洛芬作為重要的非甾體抗炎藥物，與同類藥物相比，具有劑量小、療效高、耐受性好和毒副作用輕微等顯著優(yōu)點，成為治療類風濕性關節(jié)炎、風濕性關節(jié)炎、骨關節(jié)炎、強硬性脊椎炎以及痛風的理想藥物，廣泛適用于治療痛經、牙痛、術后疼痛、癌性疼痛和神經炎、紅斑狼瘡、咽喉及支氣管炎等疾病，對軟組織受傷的治療效果更好。酮洛芬是2-芳基丙酸類非甾體抗炎藥(NSAIDs)，只有右旋體才具有抗炎抗風濕和鎮(zhèn)痛作用，左旋體幾乎沒有藥理活性。酮洛芬的主要生產企業(yè)，國外除法國Rhone-Poulenc公司外，還有德國Sanofi-Aventis、意大利SIMS、Cosma和BidaChem、印度BECChemicals等公司；國內西南合成制藥股份有限公司(原西南合成制藥廠)、中國科學院上海藥物研究所實驗藥廠較早開展了酮洛芬的產品研制和工藝開發(fā)工作。目前化學合成酮洛芬的工藝路線已非常成熟，但是合成的酮洛芬缺乏手型選擇性。由于左旋酮洛芬沒有藥理活性，并且有很大副作用。因此，直接合成右旋酮洛芬或者將左旋酮洛芬轉變成右旋酮洛芬都具有巨大的經濟效益。定點突變是指通過聚合酶鏈式反應(PCR)等方法向目的DNA片段(可以是基因組，也可以是質粒)中引入所需變化(通常是表征有利方向的變化)，包括堿基的添加、刪除、點突變等。定點突變能迅速、高效的提高DNA所表達的目的蛋白的性狀及表征，是基因研究工作中一種非常有用的手段。體外定點突變技術是當前生物、醫(yī)學各領域研究中的一種重要實驗手段，是改造、優(yōu)化基因的便捷方案，是探索啟動子調節(jié)位點的有效手段，也是研究蛋白質結構和功能之間的復雜關系的有力工具。定點突變改造糞產堿菌腈水解酶的研究具有極佳的理論和應用價值。技術實現要素：本發(fā)明的目的是通過定點突變的方法對糞產堿菌腈水解酶基因進行改造，使改造后的基因工程腈水解酶在酶活和手性選擇性方面有所提高，使其符合在催化生產右旋2-芳基丙酸工業(yè)化應用的需求。本發(fā)明采用的技術方案是：本發(fā)明提供一種腈水解酶突變體，所述突變體包含SEQIDNO：1所示氨基酸序列中下述任何一個或多個氨基酸位點上的氨基酸取代，所述位點為135、41、192、120；其中，第135位的纈氨酸被突變?yōu)楸彼峄蚶野彼幔坏?1位的天冬氨酸被突變?yōu)楸彼?；?92位亮氨酸被突變?yōu)槔i氨酸；第120位的賴氨酸被突變?yōu)楫惲涟彼?。?yōu)選地，在一些實施例中，所述腈水解酶突變體包含SEQIDNO：1所示氨基酸序列中第135位的纈氨酸被突變?yōu)楸彼峄蚶野彼?。還包含下述任何一個或多個氨基酸位點上的氨基酸取代，所述位點選自41、134、120、82、192、319。優(yōu)選的第41位的天冬氨酸被突變?yōu)楸彼幔?34位的組氨酸被突變?yōu)槔i氨酸，第120位的賴氨酸被突變?yōu)楫惲涟彼?，?2位的丙氨酸被突變?yōu)樯彼?，?92位亮氨酸被突變?yōu)槔i氨酸，第319位的絲氨酸被突變?yōu)楫惲涟彼帷?yōu)選地，在一些實施例中，所述腈水解酶突變體包含SEQIDNO：1所示氨基酸序列中第135位的纈氨酸被突變?yōu)楸彼峄蚶野彼?。還包含下述任何一個或多個氨基酸位點上的氨基酸取代，所述位點選自41、192、120。優(yōu)選的第41位的天冬氨酸被突變?yōu)楸彼?，?92位亮氨酸被突變?yōu)槔i氨酸，第120位的賴氨酸被突變?yōu)楫惲涟彼?。?yōu)選地，在一些實施例中，所述腈水解酶突變體包含SEQIDNO：1所示氨基酸序列中第134位的組氨酸被突變?yōu)槔i氨酸，第135位的纈氨酸被突變?yōu)楸彼峄蚶野彼?。?yōu)選地，在一些實施例中，所述腈水解酶突變體包含SEQIDNO：1所示氨基酸序列中第134位的組氨酸被突變?yōu)槔i氨酸，第135位的纈氨酸被突變?yōu)楸彼峄蚶野彼?。還包含下述任何一個或多個氨基酸位點上的氨基酸取代，所述位點選自41、82、192、120、319，優(yōu)選的第41位的天冬氨酸被突變?yōu)楸彼幔?2位的丙氨酸被突變?yōu)樯彼?，?92位亮氨酸被突變?yōu)槔i氨酸，第120位的賴氨酸被突變?yōu)楫惲涟彼?，?19位的絲氨酸被突變?yōu)楫惲涟彼?。?yōu)選地，在一些實施例中，所述腈水解酶突變體包含SEQIDNO：1所示氨基酸序列中第134位的組氨酸被突變?yōu)槔i氨酸，第135位的纈氨酸被突變?yōu)楸彼峄蚶野彼帷＿€包含下述任何一個或多個氨基酸位點上的氨基酸取代，所述位點選自41、192、120，優(yōu)選的第41位的天冬氨酸被突變?yōu)楸彼?，?92位亮氨酸被突變?yōu)槔i氨酸，第120位的賴氨酸被突變?yōu)楫惲涟彼?。更?yōu)選地，在一些實施例中，所述腈水解酶突變體，包含SEQIDNO：1所示氨基酸序列中選自以下氨基酸突變組成的組：1)V135A+D41A；2)V135A+K120I；3)V135A+L192V；4)H134V+V135A；5)H134V+V135A+L192V；6)H134V+V135A+L192V+D41A；7)H134V+V135A+L192V+K120I。本發(fā)明還涉及一種多核苷酸，其編碼以上所述的腈水解酶突變體。本發(fā)明還涉及一種包含上述多核苷酸的重組載體。本發(fā)明還提供一種由所述重組載體轉化制備的重組基因工程菌。此外，本發(fā)明還提供一種所述腈水解酶突變體在制備光學活性2-APA中的應用。本發(fā)明通過定點突變的方式提供了一種腈水解酶突變體，該突變體與野生型腈水解酶相比具有更高的酶活和/或立體選擇性，該腈水解酶突變體在制備光學活性2-APA中的應用，較化學合成法，能夠降低生產成本，提高生產效率，適應工業(yè)化生產的需求。附圖說明附圖1實施例1野生型腈水解酶瓊脂糖凝膠電泳圖；附圖2實施例5腈水解酶突變體立體選擇性催化水解氰基酮洛芬；附圖3實施例5腈水解酶突變體瓊脂糖凝膠電泳圖；附圖4野生型腈水解酶三維結構模擬圖。具體實施方式本發(fā)明的其他特點和優(yōu)越性可通過以下詳細的描述體現。但是，應該理解的是，僅以示例性的方式給出詳細描述和具體實施例以表明本發(fā)明的實施方案，這是因為對于本領域熟練技術人員從所述的詳細描述中，在本發(fā)明的實質和范圍內多種改變和改良是顯而易見的。術語定義本發(fā)明所述“2-芳基丙酸(2-APA)”是指具有式Ⅰ結構的化合物，也被稱為芳基-2-丙酸。術語“芳基”可以是單環(huán)，雙環(huán)，和三環(huán)的碳環(huán)體系，其中，至少一個環(huán)體系是芳香族的，其中每一個環(huán)體系包含3-7個原子。具體來說，本文所述具有消炎作用的2-芳基丙酸類藥物包括但不限于如下舉例，例如酮洛芬(Ketoprofen)，甲氧基甲基萘乙酸(naproxene)、異丁苯丙酸(Ibrufen)、舒洛芬(Sutoprofen)、非諾洛芬(Fenoprofen)、苯惡洛芬(Bennoxaprofen)、卡布洛芬(Carprofen)、環(huán)洛芬(Cicloprofen)、氟比洛芬(Flurbiprofen)和氟洛芬(Fluprofen)等。本文所述“腈水解酶的活性”是指，腈水解酶催化水解腈為酰胺和羧酸，本文中優(yōu)選水解為羧酸。本文所述“酶活”或“轉化率”是指腈水解酶催化水解腈為羧酸的能力，或腈水解酶催化水解腈轉化為羧酸的比例。腈被催化水解為羧酸的比例越高，酶活越高，即轉化率越高，酶活越高。本文所述“光學活性2-芳基丙酸”，是指具有藥理活性的2-芳基丙酸，更進一步的，為S(+)-2-APA。本文所述“ee％”意為對映體超量，即在手性合成中，生成目標產物(某一種特定的立體異構體)的百分含量減去副產物(另一種異構體)的百分含量。例如，ee％為98％，即表示生成的目標產物的含量為99％。本文所述“右旋ee％”＝(右旋％-左旋％)/(右旋％+左旋％)本文中所述的腈水解酶突變體，除文中提到的氨基酸取代，還包含普通意義上的保守氨基酸取代，所述“保守氨基酸取代”可包括天然氨基酸殘基被非天然殘基取代，使得對該位置上的氨基酸殘基的極性或電荷幾乎沒有或沒有影響。保守氨基酸取代還包括通常通過化學上的肽合成而不是通過在生物系統中的合成而摻入的非天然存在的氨基酸殘基。這些包括肽模擬物(peptidomimetics)和氨基酸部分的其它反轉形式或反向形式。常見的保守氨基酸取代見表A。表A氨基酸氨基酸取代AlanincD-Ala，Gly，Aib，β-Ala，L-Cys，D-CysArginincD-Arg，Lys，D-Lys，OrnD-OmAsparagineD-Asn.Asp，D-Asp，Glu，D-GluGln，D-GlnAsparticAcidD-Asp，D-Asn.Asn.Glu.D-Glu，Gln，D-GlnCysteineD-Cys，S-Me-Cys，Met，D-Met，Thr，D-Thr，L-Ser，D-SerGlutamincD-Gln，Asn，D-Asn，Glu，D-Glu，Asp，D-AspGlutamicAcidD-Glu，D-Asp，Asp，Asn，D-Asn，Gln，D-GlnGlycincAla，D-Ala，Pro，D-Pro，Aib，β-AlaIsoleucineD-Ile，Val，D-Val，leu，D-Leu，Met，D-MetLeucineVal，D-Val，Met，D-Met，D-Ile，D-Leu，lleLysincD-Lys，Arg，D-Arg，Orn，D-OmMethionineD-Met，S-Me-Cys，lle，D-Ile，Leu，D-Leu，Val，D-ValPhcnylalanincD-Phc，Tyr，D-Tyr，His，D-His，Trp，D-Trp腈水解酶突變體、制備方法及應用NagasawaT等發(fā)現玫瑰色紅球菌(Rhodococcusrhodochrous)J1產生的腈水解酶既可以用作脂肪族腈，也可以作用于芳香族水解為相應羧酸，此后，MaugerJ等分離出糞產堿桿菌(Alcaligenesfaecalis)JM3能夠將芳基乙腈水解為相應羧酸。發(fā)明人在土壤中分離出一株糞產堿桿菌，并提取出野生型腈水解酶，發(fā)現其在制備光學活性2-APA中具有較低的轉化率且立體選擇性不佳。發(fā)明人通過對該腈水解酶的三維結構進行模擬(見圖4)，篩選出可能對催化水解起關鍵作用的25個位點：R127、V135、L167、V57、W164、S189、L192、K203、M206、S106、K131、P169、M314、L322、P330、I344、V12、D41、A82、K120、H134、V139、S319、W58、H134，這些位點所在的區(qū)域被稱為催化口袋，在與底物結合或立體選擇性方面可能存在較大影響，發(fā)明人對它們分別進行定點突變，意外獲得7個有益的突變位點V135、L192、D41、A82、K120、S319、H134，其中包含這些位點突變的腈水解酶突變體，在催化轉化率和/或立體選擇性方面有所增強。在一些實施例中，本發(fā)明提供一種腈水解酶突變體，所述突變體包含SEQIDNO：1所示氨基酸序列中下述任何一個或多個氨基酸位點上的氨基酸取代，所述位點為135、41、192、120。其中第135位的纈氨酸被突變?yōu)楸彼峄蚶野彼幔坏?1位的天冬氨酸被突變?yōu)楸彼?；?92位亮氨酸被突變?yōu)槔i氨酸；第120位的賴氨酸被突變?yōu)楫惲涟彼帷Ｔ谝恍嵤├?，所述腈水解酶突變體包含SEQIDNO：1所示氨基酸序列中第135位的纈氨酸被突變?yōu)楸彼峄蚶野彼?。還包含下述任何一個或多個氨基酸位點上的氨基酸取代，所述位點選自41、134、120、82、192、319。優(yōu)選的第41位的天冬氨酸被突變?yōu)楸彼?，?34位的組氨酸被突變?yōu)槔i氨酸，第120位的賴氨酸被突變?yōu)楫惲涟彼?，?2位的丙氨酸被突變?yōu)樯彼幔?92位亮氨酸被突變?yōu)槔i氨酸，第319位的絲氨酸被突變?yōu)楫惲涟彼?。在一些實施例中，所述腈水解酶突變體包含SEQIDNO：1所示氨基酸序列中第135位的纈氨酸被突變?yōu)楸彼峄蚶野彼?。還包含下述任何一個或多個氨基酸位點上的氨基酸取代，所述位點選自41、192、120。優(yōu)選的第41位的天冬氨酸被突變?yōu)楸彼幔?92位亮氨酸被突變?yōu)槔i氨酸，第120位的賴氨酸被突變?yōu)楫惲涟彼?。在一些實施例中，所述腈水解酶突變體包含SEQIDNO：1所示氨基酸序列中第134位的組氨酸被突變?yōu)槔i氨酸，第135位的纈氨酸被突變?yōu)楸彼峄蚶野彼帷Ｔ谝恍嵤├?，所述腈水解酶突變體包含SEQIDNO：1所示氨基酸序列中第134位的組氨酸被突變?yōu)槔i氨酸，第135位的纈氨酸被突變?yōu)楸彼峄蚶野彼?。還包含下述任何一個或多個氨基酸位點上的氨基酸取代，所述位點選自41、82、192、120、319，優(yōu)選的第41位的天冬氨酸被突變?yōu)楸彼?，?2位的丙氨酸被突變?yōu)樯彼?，?92位亮氨酸被突變?yōu)槔i氨酸，第120位的賴氨酸被突變?yōu)楫惲涟彼?，?19位的絲氨酸被突變?yōu)楫惲涟彼?。在一些實施例中，所述腈水解酶突變體包含SEQIDNO：1所示氨基酸序列中第134位的組氨酸被突變?yōu)槔i氨酸，第135位的纈氨酸被突變?yōu)楸彼峄蚶野彼?。還包含下述任何一個或多個氨基酸位點上的氨基酸取代，所述位點選自41、192、120，優(yōu)選的第41位的天冬氨酸被突變?yōu)楸彼?，?92位亮氨酸被突變?yōu)槔i氨酸，第120位的賴氨酸被突變?yōu)楫惲涟彼?。在一些?yōu)選實施例中，所述腈水解酶突變體，包含SEQIDNO：1所示氨基酸序列中選自以下氨基酸突變組成的組：1)V135A+D41A；2)V135A+K120I；3)V135A+L192V；4)H134V+V135A；5)H134V+V135A+L192V；6)H134V+V135A+L192V+D41A；7)H134V+V135A+L192V+K120I；本發(fā)明還涉及一種多核苷酸，其編碼以上所述的腈水解酶突變體。本發(fā)明還涉及一種包含上述多核苷酸的重組載體。本發(fā)明還提供一種由所述重組載體轉化制備的重組基因工程菌。此外，本發(fā)明還提供一種所述腈水解酶突變體制備光學活性2-APA中的應用。本文中所用到的試劑均可通過市售得到。實施例實施例1野生型腈水解酶基因的克隆(1)野生型腈水解酶基因的獲得從工業(yè)廢水附近土壤中篩選出一株糞產堿桿菌HEC-AF001使用OMEGA細菌基因組試劑盒進行總基因組DNA的提取，使用下述引物擴增長約1.1kb大小的基因片段。HEC-AF001-F：CCCATATGCAGACAAGAAAAATC(SEQIDNO：17)HEC-AF001-R：CCAAGCTTTCAGGACGGTTCTTG(SEQIDNO：18)PCR反應體系見表1表1成分體系(μl)5×PrimeSTARPCRHSBuffer10引物11引物21模板(<0.2μg)1dNTPs(2.5mM)4PrimeSTARPCRHSPolymerase0.5ddH2O50PCR擴增程序：98℃，預變性20s；98℃，變性10s；60℃退火10s；72℃延伸60s；重復30個循環(huán)；72℃繼續(xù)延伸10min。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳純化，利用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收1100bp左右的目標條帶(見圖1)。送廣州艾基生物公司測序，確認是目的條帶，如此獲得一條完整的腈水解酶全長基因序列，命名為NIT1，全長1071bp，堿基序列如序列表中SEQIDNo：2所示，利用軟件對該基因序列進行分析，得到如SEQIDNo.2所示的野生型腈水解酶氨基酸序列SEQIDNo：1。實施例2重組表達質粒和重組表達轉化體的制備將實施例1所得的PCR產物在37℃用限制性內切酶NdeI和HindⅢ雙酶切4h，經瓊脂糖凝膠電泳純化，利用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收目標片段，其中含有正確的插入片段。將目標片段與同樣經NdeI和HindⅢ酶切后的質粒pET28a混合，在T4DNA連接酶的作用下，16℃連接4h得到重組表達質粒pET28a-NIT1。將上述重組表達質粒轉化到E.coliTop10感受態(tài)細胞中。在含有卡那霉素的抗性平板(培養(yǎng)基成分LB培養(yǎng)基，蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，氯化鈉10g/L和瓊脂2％，抗生素含量50mg/L)上對陽性重組體進行篩選，挑取單克隆，培養(yǎng)重組菌株，待質粒擴增后提取質粒，經測序驗證正確后，重新轉化至E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細胞中。轉化液涂布到含有卡那霉素(50mg/L)的LB平板上，37℃倒置培養(yǎng)過夜，獲得陽性重組大腸桿菌E.coliBL21(DE3)/pET28a-NIT1，命名為HEC-NIT1。實施例3重組腈水解酶的表達將實施例2所得的重組大腸桿菌，接種至含卡那霉素(50mg/L)的LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。按2‰(v/v)的接種量接入裝有50mlLB培養(yǎng)基的250ml三角燒瓶中，置37℃、180rpm搖床震蕩培養(yǎng)。當培養(yǎng)液的OD600達到0.8時，加入終濃度為0.5mmol/L的IPTG進行誘導。30℃誘導8h后，將培養(yǎng)液離心，收集細胞，得0.3g濕細胞。實施例4利用NIT1重組腈水解酶催化水解氰基酮洛芬酶催化反應：分別將實施例4得到的腈水解酶濕菌體加入至含25ml底物溶液(工作濃度為1mM，稱取0.235g氰基酮洛芬，使用甲醇90ml、1M磷酸鉀緩沖液(pH7.8)90ml、H2O720ml進行溶解)的三角瓶中，于30℃、250rpm條件下反應48h，取出三角瓶，分別加入10ml甲醇溶液使氰基酮洛芬底物完全溶解，8000rpm、10min離心，棄除菌渣，收集上清。反應體系后處理：將得到的上清液分別用旋轉蒸發(fā)儀于40℃條件下揮除甲醇，用1MHCl調溶液pH至2～3左右；加入等體積的乙酸乙酯、混合均勻，收集乙酸乙酯相；取乙酸乙酯層吹干，取200μl90％正己烷(異丙醇)復溶，過0.45um濾膜，待用。HPLC檢測轉化率：色譜柱，WatersXBridgeC18；柱溫，30℃；流動相，0.02MNaClO4-乙腈，結果見表5。HPLC檢測手性：：色譜柱，ChiralND柱；柱溫，30℃；流動相，正己烷(0.15％TFA)：異丙醇＝93:7，檢測結果見表5。實施例5：野生型腈水解酶定向改造參考野生型腈水解酶基因序列(SEQIDNO：2)，設計并合成兩條寡核苷酸引物，并采用未突變的重組質粒，通過PCR擴增的方法獲得表2中腈水解酶突變體：表2涉及到的引物見表3表3PCR反應體系見表4表4成分體系(μl)PrimeSTARMaxPremix25引物12引物22模板(約300ng)3滅菌水Upto50PCR程序條件設定為：98℃預變性5min；98℃變性20s，60℃退火20s，72℃延伸2min，30個循環(huán)；72℃終延伸5min。1％核酸電泳檢測結果見圖3。對擴增獲得的PCR產物進行醇沉處理，再使用DpnⅠ對模板進行消化處理，最后使用DNA膠回收試劑盒進行割膠回收。將回收處理得到的產物電轉化至電感受態(tài)細胞E.coliBL21(DE3)中，轉移細胞至含kana抗性(終濃度為50μg/ml)平板在37℃條件下培養(yǎng)過夜獲得大量轉化子。擴培后進行測序驗證，驗證正確的轉化子即為基因工程腈水解酶產生菌。將基因工程腈水解酶產生菌接入50ml/250ml的液體LB培養(yǎng)基中(含kana抗性，終濃度為50μg/ml)，37℃培養(yǎng)OD600至0.8左右時，使用IPTG在30℃條件下進行誘導培養(yǎng)6h，收菌。菌體在離心機最大轉速中4℃離心10min收集蛋白。測定蛋白的酶轉化率及手性選擇性(方法與實施例4)相同，測定結果見表5。表5突變情況轉化率(酶活)右旋ee％值野生型18％8.9％D41A90％86％A82W84％77％K120I89％85％V135A90％90％L192V96％67％S319I82％70％V135A、D41A93％91％V135A、K120I92％92％V135A、L192V98％80％V135Y65％70％H134V、V135A93％98％H134V、V135A、L192V96％99％H134V、V135A、L192V、D41A99％99％H134V、V135A、L192V、K120I98％99％結果分析：在單一位點突變中，D41A、A82W、K120I、V135A、V135Y、L192V、S319I顯示出優(yōu)于野生型腈水解酶的酶活或立體選擇性，L192V在提高酶活方面最優(yōu)，V135A在立體選擇性方面最優(yōu)，在多位點突變中，135、192、41、120也表現出有益的效果。在三位點突變組合中加入第四個突變位點H134，可以使效果進一步提高，根據三維立體結構推測H134V、V135A位點的突變，破壞有利于R型底物結合的因素，降低對R型催化活力。His134可能在R型底物優(yōu)勢構象的定位中具有重要作用，His134的咪唑基與底物苯環(huán)間可能存在π-π相互作用或陽離子-π相互作用，不利于左旋產物的形成。SEQUENCELISTING<110>東莞東陽光藥物研發(fā)有限公司;黃石世星藥業(yè)有限責任公司<120>腈水解酶突變體及其編碼基因和應用<130>2017<160>34<170>PatentInversion3.5<210>1<211>356<212>PRT<213>Alcaligenesfaecalis<400>1MetGlnThrArgLysIleValArgAlaAlaAlaValGlnAlaAlaSer151015ProAsnTyrAspLeuAlaAlaGlyValAspLysThrIleGluLeuAla202530ArgGlnAlaArgAspGluGlyCysAspLeuIleValPheGlyGluThr354045TrpLeuProGlyTyrProPheHisValTrpLeuGlyAlaProAlaTrp505560SerLeuLysTyrSerAlaArgTyrTyrAlaAsnSerLeuSerLeuAsp65707580SerAlaGluPheGlnArgIleAlaGlnAlaAlaArgThrLeuGlyIle859095PheIleAlaLeuGlyTyrSerGluArgSerGlyGlySerLeuTyrLeu100105110GlyGlnCysLeuIleAspAspLysGlyGluMetLeuTrpSerArgArg115120125LysLeuLysProThrHisValGluArgThrValPheGlyGluGlyTyr130135140AlaArgAspLeuIleValSerAspThrGluLeuGlyArgValGlyAla145150155160LeuCysCysTrpGluHisLeuSerProLeuSerLysTyrAlaLeuTyr165170175SerGlnHisGluAlaIleHisIleAlaAlaTrpProSerPheSerLeu180185190TyrSerGluGlnAlaHisAlaLeuSerAlaLysValAsnMetAlaAla195200205SerGlnIleTyrSerValGluGlyGlnCysPheThrIleAlaAlaSer210215220SerValValThrGlnGluThrLeuAspMetLeuGluValGlyGluHis225230235240AsnAlaSerLeuLeuThrValGlyGlyGlySerSerMetIlePheAla245250255ProAspGlyArgThrLeuAlaProTyrLeuProHisAspAlaGluGly260265270LeuIleIleAlaAspLeuAsnMetGluGluIleAlaPheAlaLysAla275280285IleAsnAspProAlaGlyHisTyrSerLysProGluAlaThrArgLeu290295300ValLeuAspLeuGlyHisArgGluProMetThrArgValHisSerGln305310315320SerLeuIleLysGluGluAlaCysGluProLeuThrProSerThrIle325330335AlaProValAlaIleSerGlnIleGlnGluSerAspThrLeuLeuVal340345350GlnGluProSer355<210>2<211>1071<212>DNA<213>Alcaligenesfaecalis<400>2atgcagacaagaaaaatcgtccgggcagccgccgtacaggccgcctctcccaactacgat60ctggcagcaggggttgataaaaccattgagctggctcgtcaggcccgcgatgagggctgc120gacctgatcgtgtttggtgaaacctggctaccaggctaccccttccacgtctggttgggc180gcaccggcctggtcgctgaaatacagtgcccgctactatgccaactcgctctcgctggac240agtgcggaatttcaacgcattgcccaggccgcacggaccttgggcattttcattgccttg300ggctatagcgagcgcagtggtggcagcctgtatctgggccaatgcctgattgacgacaaa360ggcgagatgctgtggtcgcgccgcaaacttaaacccacacatgtcgagcgcaccgtgttt420ggtgaaggctatgcccgtgatctgattgtgtccgacaccgagctgggccgcgtcggtgcg480ctgtgctgctgggagcacctgtctcccttgagcaagtacgcgctgtactcccagcacgaa540gccattcacattgccgcctggccgtctttttcgctgtacagtgaacaggcccatgctctc600agcgccaaagtaaacatggctgcctcgcaaatctattcggtcgaaggccaatgctttacc660atcgccgccagcagtgtggtcactcaagagacgctggacatgctggaagtgggagagcac720aacgcctccttattgaccgtgggcggtggcagttccatgatttttgcgccagacggacgc780acactggccccctacctgccgcacgatgccgaaggcctgatcattgccgacctgaacatg840gaagaaattgccttcgccaaggcaatcaacgaccccgcaggtcactattccaaacctgag900gctacccgtttggtactggatttggggcaccgtgagcccatgacacgggttcactcccaa960agcctgatcaaggaagaggcctgcgaaccactcacacccagtacgattgcaccagttgcc1020atcagccagatccaggaatcggacacactgctggtgcaagaaccgtcctga1071<210>3<211>356<212>PRT<213>人工序列<400>3MetGlnThrArgLysIleValArgAlaAlaAlaValGlnAlaAlaSer151015ProAsnTyrAspLeuAlaAlaGlyValAspLysThrIleGluLeuAla202530ArgGlnAlaArgAspGluGlyCysAlaLeuIleValPheGlyGluThr354045TrpLeuProGlyTyrProPheHisValTrpLeuGlyAlaProAlaTrp505560SerLeuLysTyrSerAlaArgTyrTyrAlaAsnSerLeuSerLeuAsp65707580SerAlaGluPheGlnArgIleAlaGlnAlaAlaArgThrLeuGlyIle859095PheIleAlaLeuGlyTyrSerGluArgSerGlyGlySerLeuTyrLeu100105110GlyGlnCysLeuIleAspAspLysGlyGluMetLeuTrpSerArgArg115120125LysLeuLysProThrHisValGluArgThrValPheGlyGluGlyTyr130135140AlaArgAspLeuIleValSerAspThrGluLeuGlyArgValGlyAla145150155160LeuCysCysTrpGluHisLeuSerProLeuSerLysTyrAlaLeuTyr165170175SerGlnHisGluAlaIleHisIleAlaAlaTrpProSerPheSerLeu180185190TyrSerGluGlnAlaHisAlaLeuSerAlaLysValAsnMetAlaAla195200205SerGlnIleTyrSerValGluGlyGlnCysPheThrIleAlaAlaSer210215220SerValValThrGlnGluThrLeuAspMetLeuGluValGlyGluHis225230235240AsnAlaSerLeuLeuThrValGlyGlyGlySerSerMetIlePheAla245250255ProAspGlyArgThrLeuAlaProTyrLeuProHisAspAlaGluGly260265270LeuIleIleAlaAspLeuAsnMetGluGluIleAlaPheAlaLysAla275280285IleAsnAspProAlaGlyHisTyrSerLysProGluAlaThrArgLeu290295300ValLeuAspLeuGlyHisArgGluProMetThrArgValHisSerGln305310315320SerLeuIleLysGluGluAlaCysGluProLeuThrProSerThrIle325330335AlaProValAlaIleSerGlnIleGlnGluSerAspThrLeuLeuVal340345350GlnGluProSer355<210>4<211>356<212>PRT<213>人工序列<400>4MetGlnThrArgLysIleValArgAlaAlaAlaValGlnAlaAlaSer151015ProAsnTyrAspLeuAlaAlaGlyValAspLysThrIleGluLeuAla202530ArgGlnAlaArgAspGluGlyCysAspLeuIleValPheGlyGluThr354045TrpLeuProGlyTyrProPheHisValTrpLeuGlyAlaProAlaTrp505560SerLeuLysTyrSerAlaArgTyrTyrAlaAsnSerLeuSerLeuAsp65707580SerTrpGluPheGlnArgIleAlaGlnAlaAlaArgThrLeuGlyIle859095PheIleAlaLeuGlyTyrSerGluArgSerGlyGlySerLeuTyrLeu100105110GlyGlnCysLeuIleAspAspLysGlyGluMetLeuTrpSerArgArg115120125LysLeuLysProThrHisValGluArgThrValPheGlyGluGlyTyr130135140AlaArgAspLeuIleValSerAspThrGluLeuGlyArgValGlyAla145150155160LeuCysCysTrpGluHisLeuSerProLeuSerLysTyrAlaLeuTyr165170175SerGlnHisGluAlaIleHisIleAlaAlaTrpProSerPheSerLeu180185190TyrSerGluGlnAlaHisAlaLeuSerAlaLysValAsnMetAlaAla195200205SerGlnIleTyrSerValGluGlyGlnCysPheThrIleAlaAlaSer210215220SerValValThrGlnGluThrLeuAspMetLeuGluValGlyGluHis225230235240AsnAlaSerLeuLeuThrValGlyGlyGlySerSerMetIlePheAla245250255ProAspGlyArgThrLeuAlaProTyrLeuProHisAspAlaGluGly260265270LeuIleIleAlaAspLeuAsnMetGluGluIleAlaPheAlaLysAla275280285IleAsnAspProAlaGlyHisTyrSerLysProGluAlaThrArgLeu290295300ValLeuAspLeuGlyHisArgGluProMetThrArgValHisSerGln305310315320SerLeuIleLysGluGluAlaCysGluProLeuThrProSerThrIle325330335AlaProValAlaIleSerGlnIleGlnGluSerAspThrLeuLeuVal340345350GlnGluProSer355<210>5<211>356<212>PRT<213>人工序列<400>5MetGlnThrArgLysIleValArgAlaAlaAlaValGlnAlaAlaSer151015ProAsnTyrAspLeuAlaAlaGlyValAspLysThrIleGluLeuAla202530ArgGlnAlaArgAspGluGlyCysAspLeuIleValPheGlyGluThr354045TrpLeuProGlyTyrProPheHisValTrpLeuGlyAlaProAlaTrp505560SerLeuLysTyrSerAlaArgTyrTyrAlaAsnSerLeuSerLeuAsp65707580SerAlaGluPheGlnArgIleAlaGlnAlaAlaArgThrLeuGlyIle859095PheIleAlaLeuGlyTyrSerGluArgSerGlyGlySerLeuTyrLeu100105110GlyGlnCysLeuIleAspAspIleGlyGluMetLeuTrpSerArgArg115120125LysLeuLysProThrHisValGluArgThrValPheGlyGluGlyTyr130135140AlaArgAspLeuIleValSerAspThrGluLeuGlyArgValGlyAla145150155160LeuCysCysTrpGluHisLeuSerProLeuSerLysTyrAlaLeuTyr165170175SerGlnHisGluAlaIleHisIleAlaAlaTrpProSerPheSerLeu180185190TyrSerGluGlnAlaHisAlaLeuSerAlaLysValAsnMetAlaAla195200205SerGlnIleTyrSerValGluGlyGlnCysPheThrIleAlaAlaSer210215220SerValValThrGlnGluThrLeuAspMetLeuGluValGlyGluHis225230235240AsnAlaSerLeuLeuThrValGlyGlyGlySerSerMetIlePheAla245250255ProAspGlyArgThrLeuAlaProTyrLeuProHisAspAlaGluGly260265270LeuIleIleAlaAspLeuAsnMetGluGluIleAlaPheAlaLysAla275280285IleAsnAspProAlaGlyHisTyrSerLysProGluAlaThrArgLeu290295300ValLeuAspLeuGlyHisArgGluProMetThrArgValHisSerGln305310315320SerLeuIleLysGluGluAlaCysGluProLeuThrProSerThrIle325330335AlaProValAlaIleSerGlnIleGlnGluSerAspThrLeuLeuVal340345350GlnGluProSer355<210>6<211>356<212>PRT<213>人工序列<400>6MetGlnThrArgLysIleValArgAlaAlaAlaValGlnAlaAlaSer151015ProAsnTyrAspLeuAlaAlaGlyValAspLysThrIleGluLeuAla202530ArgGlnAlaArgAspGluGlyCysAspLeuIleValPheGlyGluThr354045TrpLeuProGlyTyrProPheHisValTrpLeuGlyAlaProAlaTrp505560SerLeuLysTyrSerAlaArgTyrTyrAlaAsnSerLeuSerLeuAsp65707580SerAlaGluPheGlnArgIleAlaGlnAlaAlaArgThrLeuGlyIle859095PheIleAlaLeuGlyTyrSerGluArgSerGlyGlySerLeuTyrLeu100105110GlyGlnCysLeuIleAspAspLysGlyGluMetLeuTrpSerArgArg115120125LysLeuLysProThrHisAlaGluArgThrValPheGlyGluGlyTyr130135140AlaArgAspLeuIleValSerAspThrGluLeuGlyArgValGlyAla145150155160LeuCysCysTrpGluHisLeuSerProLeuSerLysTyrAlaLeuTyr165170175SerGlnHisGluAlaIleHisIleAlaAlaTrpProSerPheSerLeu180185190TyrSerGluGlnAlaHisAlaLeuSerAlaLysValAsnMetAlaAla195200205SerGlnIleTyrSerValGluGlyGlnCysPheThrIleAlaAlaSer210215220SerValValThrGlnGluThrLeuAspMetLeuGluValGlyGluHis225230235240AsnAlaSerLeuLeuThrValGlyGlyGlySerSerMetIlePheAla245250255ProAspGlyArgThrLeuAlaProTyrLeuProHisAspAlaGluGly260265270LeuIleIleAlaAspLeuAsnMetGluGluIleAlaPheAlaLysAla275280285IleAsnAspProAlaGlyHisTyrSerLysProGluAlaThrArgLeu290295300ValLeuAspLeuGlyHisArgGluProMetThrArgValHisSerGln305310315320SerLeuIleLysGluGluAlaCysGluProLeuThrProSerThrIle325330335AlaProValAlaIleSerGlnIleGlnGluSerAspThrLeuLeuVal340345350GlnGluProSer355<210>7<211>356<212>PRT<213>人工序列<400>7MetGlnThrArgLysIleValArgAlaAlaAlaValGlnAlaAlaSer151015ProAsnTyrAspLeuAlaAlaGlyValAspLysThrIleGluLeuAla202530ArgGlnAlaArgAspGluGlyCysAspLeuIleValPheGlyGluThr354045TrpLeuProGlyTyrProPheHisValTrpLeuGlyAlaProAlaTrp505560SerLeuLysTyrSerAlaArgTyrTyrAlaAsnSerLeuSerLeuAsp65707580SerAlaGluPheGlnArgIleAlaGlnAlaAlaArgThrLeuGlyIle859095PheIleAlaLeuGlyTyrSerGluArgSerGlyGlySerLeuTyrLeu100105110GlyGlnCysLeuIleAspAspLysGlyGluMetLeuTrpSerArgArg115120125LysLeuLysProThrHisValGluArgThrValPheGlyGluGlyTyr130135140AlaArgAspLeuIleValSerAspThrGluLeuGlyArgValGlyAla145150155160LeuCysCysTrpGluHisLeuSerProLeuSerLysTyrAlaLeuTyr165170175SerGlnHisGluAlaIleHisIleAlaAlaTrpProSerPheSerVal180185190TyrSerGluGlnAlaHisAlaLeuSerAlaLysValAsnMetAlaAla195200205SerGlnIleTyrSerValGluGlyGlnCysPheThrIleAlaAlaSer210215220SerValValThrGlnGluThrLeuAspMetLeuGluValGlyGluHis225230235240AsnAlaSerLeuLeuThrValGlyGlyGlySerSerMetIlePheAla245250255ProAspGlyArgThrLeuAlaProTyrLeuProHisAspAlaGluGly260265270LeuIleIleAlaAspLeuAsnMetGluGluIleAlaPheAlaLysAla275280285IleAsnAspProAlaGlyHisTyrSerLysProGluAlaThrArgLeu290295300ValLeuAspLeuGlyHisArgGluProMetThrArgValHisSerGln305310315320SerLeuIleLysGluGluAlaCysGluProLeuThrProSerThrIle325330335AlaProValAlaIleSerGlnIleGlnGluSerAspThrLeuLeuVal340345350GlnGluProSer355<210>8<211>356<212>PRT<213>人工序列<400>8MetGlnThrArgLysIleValArgAlaAlaAlaValGlnAlaAlaSer151015ProAsnTyrAspLeuAlaAlaGlyValAspLysThrIleGluLeuAla202530ArgGlnAlaArgAspGluGlyCysAspLeuIleValPheGlyGluThr354045TrpLeuProGlyTyrProPheHisValTrpLeuGlyAlaProAlaTrp505560SerLeuLysTyrSerAlaArgTyrTyrAlaAsnSerLeuSerLeuAsp65707580SerAlaGluPheGlnArgIleAlaGlnAlaAlaArgThrLeuGlyIle859095PheIleAlaLeuGlyTyrSerGluArgSerGlyGlySerLeuTyrLeu100105110GlyGlnCysLeuIleAspAspLysGlyGluMetLeuTrpSerArgArg115120125LysLeuLysProThrHisValGluArgThrValPheGlyGluGlyTyr130135140AlaArgAspLeuIleValSerAspThrGluLeuGlyArgValGlyAla145150155160LeuCysCysTrpGluHisLeuSerProLeuSerLysTyrAlaLeuTyr165170175SerGlnHisGluAlaIleHisIleAlaAlaTrpProSerPheSerLeu180185190TyrSerGluGlnAlaHisAlaLeuSerAlaLysValAsnMetAlaAla195200205SerGlnIleTyrSerValGluGlyGlnCysPheThrIleAlaAlaSer210215220SerValValThrGlnGluThrLeuAspMetLeuGluValGlyGluHis225230235240AsnAlaSerLeuLeuThrValGlyGlyGlySerSerMetIlePheAla245250255ProAspGlyArgThrLeuAlaProTyrLeuProHisAspAlaGluGly260265270LeuIleIleAlaAspLeuAsnMetGluGluIleAlaPheAlaLysAla275280285IleAsnAspProAlaGlyHisTyrSerLysProGluAlaThrArgLeu290295300ValLeuAspLeuGlyHisArgGluProMetThrArgValHisIleGln305310315320SerLeuIleLysGluGluAlaCysGluProLeuThrProSerThrIle325330335AlaProValAlaIleSerGlnIleGlnGluSerAspThrLeuLeuVal340345350GlnGluProSer355<210>9<211>356<212>PRT<213>人工序列<400>9MetGlnThrArgLysIleValArgAlaAlaAlaValGlnAlaAlaSer151015ProAsnTyrAspLeuAlaAlaGlyValAspLysThrIleGluLeuAla202530ArgGlnAlaArgAspGluGlyCysAlaLeuIleValPheGlyGluThr354045TrpLeuProGlyTyrProPheHisValTrpLeuGlyAlaProAlaTrp505560SerLeuLysTyrSerAlaArgTyrTyrAlaAsnSerLeuSerLeuAsp65707580SerAlaGluPheGlnArgIleAlaGlnAlaAlaArgThrLeuGlyIle859095PheIleAlaLeuGlyTyrSerGluArgSerGlyGlySerLeuTyrLeu100105110GlyGlnCysLeuIleAspAspLysGlyGluMetLeuTrpSerArgArg115120125LysLeuLysProThrHisAlaGluArgThrValPheGlyGluGlyTyr130135140AlaArgAspLeuIleValSerAspThrGluLeuGlyArgValGlyAla145150155160LeuCysCysTrpGluHisLeuSerProLeuSerLysTyrAlaLeuTyr165170175SerGlnHisGluAlaIleHisIleAlaAlaTrpProSerPheSerLeu180185190TyrSerGluGlnAlaHisAlaLeuSerAlaLysValAsnMetAlaAla195200205SerGlnIleTyrSerValGluGlyGlnCysPheThrIleAlaAlaSer210215220SerValValThrGlnGluThrLeuAspMetLeuGluValGlyGluHis225230235240AsnAlaSerLeuLeuThrValGlyGlyGlySerSerMetIlePheAla245250255ProAspGlyArgThrLeuAlaProTyrLeuProHisAspAlaGluGly260265270LeuIleIleAlaAspLeuAsnMetGluGluIleAlaPheAlaLysAla275280285IleAsnAspProAlaGlyHisTyrSerLysProGluAlaThrArgLeu290295300ValLeuAspLeuGlyHisArgGluProMetThrArgValHisSerGln305310315320SerLeuIleLysGluGluAlaCysGluProLeuThrProSerThrIle325330335AlaProValAlaIleSerGlnIleGlnGluSerAspThrLeuLeuVal340345350GlnGluProSer355<210>10<211>356<212>PRT<213>人工序列<400>10MetGlnThrArgLysIleValArgAlaAlaAlaValGlnAlaAlaSer151015ProAsnTyrAspLeuAlaAlaGlyValAspLysThrIleGluLeuAla202530ArgGlnAlaArgAspGluGlyCysAspLeuIleValPheGlyGluThr354045TrpLeuProGlyTyrProPheHisValTrpLeuGlyAlaProAlaTrp505560SerLeuLysTyrSerAlaArgTyrTyrAlaAsnSerLeuSerLeuAsp65707580SerAlaGluPheGlnArgIleAlaGlnAlaAlaArgThrLeuGlyIle859095PheIleAlaLeuGlyTyrSerGluArgSerGlyGlySerLeuTyrLeu100105110GlyGlnCysLeuIleAspAspIleGlyGluMetLeuTrpSerArgArg115120125LysLeuLysProThrHisAlaGluArgThrValPheGlyGluGlyTyr130135140AlaArgAspLeuIleValSerAspThrGluLeuGlyArgValGlyAla145150155160LeuCysCysTrpGluHisLeuSerProLeuSerLysTyrAlaLeuTyr165170175SerGlnHisGluAlaIleHisIleAlaAlaTrpProSerPheSerLeu180185190TyrSerGluGlnAlaHisAlaLeuSerAlaLysValAsnMetAlaAla195200205SerGlnIleTyrSerValGluGlyGlnCysPheThrIleAlaAlaSer210215220SerValValThrGlnGluThrLeuAspMetLeuGluValGlyGluHis225230235240AsnAlaSerLeuLeuThrValGlyGlyGlySerSerMetIlePheAla245250255ProAspGlyArgThrLeuAlaProTyrLeuProHisAspAlaGluGly260265270LeuIleIleAlaAspLeuAsnMetGluGluIleAlaPheAlaLysAla275280285IleAsnAspProAlaGlyHisTyrSerLysProGluAlaThrArgLeu290295300ValLeuAspLeuGlyHisArgGluProMetThrArgValHisSerGln305310315320SerLeuIleLysGluGluAlaCysGluProLeuThrProSerThrIle325330335AlaProValAlaIleSerGlnIleGlnGluSerAspThrLeuLeuVal340345350GlnGluProSer355<210>11<211>356<212>PRT<213>人工序列<400>11MetGlnThrArgLysIleValArgAlaAlaAlaValGlnAlaAlaSer151015ProAsnTyrAspLeuAlaAlaGlyValAspLysThrIleGluLeuAla202530ArgGlnAlaArgAspGluGlyCysAspLeuIleValPheGlyGluThr354045TrpLeuProGlyTyrProPheHisValTrpLeuGlyAlaProAlaTrp505560SerLeuLysTyrSerAlaArgTyrTyrAlaAsnSerLeuSerLeuAsp65707580SerAlaGluPheGlnArgIleAlaGlnAlaAlaArgThrLeuGlyIle859095PheIleAlaLeuGlyTyrSerGluArgSerGlyGlySerLeuTyrLeu100105110GlyGlnCysLeuIleAspAspLysGlyGluMetLeuTrpSerArgArg115120125LysLeuLysProThrHisAlaGluArgThrValPheGlyGluGlyTyr130135140AlaArgAspLeuIleValSerAspThrGluLeuGlyArgValGlyAla145150155160LeuCysCysTrpGluHisLeuSerProLeuSerLysTyrAlaLeuTyr165170175SerGlnHisGluAlaIleHisIleAlaAlaTrpProSerPheSerVal180185190TyrSerGluGlnAlaHisAlaLeuSerAlaLysValAsnMetAlaAla195200205SerGlnIleTyrSerValGluGlyGlnCysPheThrIleAlaAlaSer210215220SerValValThrGlnGluThrLeuAspMetLeuGluValGlyGluHis225230235240AsnAlaSerLeuLeuThrValGlyGlyGlySerSerMetIlePheAla245250255ProAspGlyArgThrLeuAlaProTyrLeuProHisAspAlaGluGly260265270LeuIleIleAlaAspLeuAsnMetGluGluIleAlaPheAlaLysAla275280285IleAsnAspProAlaGlyHisTyrSerLysProGluAlaThrArgLeu290295300ValLeuAspLeuGlyHisArgGluProMetThrArgValHisSerGln305310315320SerLeuIleLysGluGluAlaCysGluProLeuThrProSerThrIle325330335AlaProValAlaIleSerGlnIleGlnGluSerAspThrLeuLeuVal340345350GlnGluProSer355<210>12<211>356<212>PRT<213>人工序列<400>12MetGlnThrArgLysIleValArgAlaAlaAlaValGlnAlaAlaSer151015ProAsnTyrAspLeuAlaAlaGlyValAspLysThrIleGluLeuAla202530ArgGlnAlaArgAspGluGlyCysAspLeuIleValPheGlyGluThr354045TrpLeuProGlyTyrProPheHisValTrpLeuGlyAlaProAlaTrp505560SerLeuLysTyrSerAlaArgTyrTyrAlaAsnSerLeuSerLeuAsp65707580SerAlaGluPheGlnArgIleAlaGlnAlaAlaArgThrLeuGlyIle859095PheIleAlaLeuGlyTyrSerGluArgSerGlyGlySerLeuTyrLeu100105110GlyGlnCysLeuIleAspAspLysGlyGluMetLeuTrpSerArgArg115120125LysLeuLysProThrHisTyrGluArgThrValPheGlyGluGlyTyr130135140AlaArgAspLeuIleValSerAspThrGluLeuGlyArgValGlyAla145150155160LeuCysCysTrpGluHisLeuSerProLeuSerLysTyrAlaLeuTyr165170175SerGlnHisGluAlaIleHisIleAlaAlaTrpProSerPheSerLeu180185190TyrSerGluGlnAlaHisAlaLeuSerAlaLysValAsnMetAlaAla195200205SerGlnIleTyrSerValGluGlyGlnCysPheThrIleAlaAlaSer210215220SerValValThrGlnGluThrLeuAspMetLeuGluValGlyGluHis225230235240AsnAlaSerLeuLeuThrValGlyGlyGlySerSerMetIlePheAla245250255ProAspGlyArgThrLeuAlaProTyrLeuProHisAspAlaGluGly260265270LeuIleIleAlaAspLeuAsnMetGluGluIleAlaPheAlaLysAla275280285IleAsnAspProAlaGlyHisTyrSerLysProGluAlaThrArgLeu290295300ValLeuAspLeuGlyHisArgGluProMetThrArgValHisSerGln305310315320SerLeuIleLysGluGluAlaCysGluProLeuThrProSerThrIle325330335AlaProValAlaIleSerGlnIleGlnGluSerAspThrLeuLeuVal340345350GlnGluProSer355<210>13<211>356<212>PRT<213>人工序列<400>13MetGlnThrArgLysIleValArgAlaAlaAlaValGlnAlaAlaSer151015ProAsnTyrAspLeuAlaAlaGlyValAspLysThrIleGluLeuAla202530ArgGlnAlaArgAspGluGlyCysAspLeuIleValPheGlyGluThr354045TrpLeuProGlyTyrProPheHisValTrpLeuGlyAlaProAlaTrp505560SerLeuLysTyrSerAlaArgTyrTyrAlaAsnSerLeuSerLeuAsp65707580SerAlaGluPheGlnArgIleAlaGlnAlaAlaArgThrLeuGlyIle859095PheIleAlaLeuGlyTyrSerGluArgSerGlyGlySerLeuTyrLeu100105110GlyGlnCysLeuIleAspAspLysGlyGluMetLeuTrpSerArgArg115120125LysLeuLysProThrValAlaGluArgThrValPheGlyGluGlyTyr130135140AlaArgAspLeuIleValSerAspThrGluLeuGlyArgValGlyAla145150155160LeuCysCysTrpGluHisLeuSerProLeuSerLysTyrAlaLeuTyr165170175SerGlnHisGluAlaIleHisIleAlaAlaTrpProSerPheSerLeu180185190TyrSerGluGlnAlaHisAlaLeuSerAlaLysValAsnMetAlaAla195200205SerGlnIleTyrSerValGluGlyGlnCysPheThrIleAlaAlaSer210215220SerValValThrGlnGluThrLeuAspMetLeuGluValGlyGluHis225230235240AsnAlaSerLeuLeuThrValGlyGlyGlySerSerMetIlePheAla245250255ProAspGlyArgThrLeuAlaProTyrLeuProHisAspAlaGluGly260265270LeuIleIleAlaAspLeuAsnMetGluGluIleAlaPheAlaLysAla275280285IleAsnAspProAlaGlyHisTyrSerLysProGluAlaThrArgLeu290295300ValLeuAspLeuGlyHisArgGluProMetThrArgValHisSerGln305310315320SerLeuIleLysGluGluAlaCysGluProLeuThrProSerThrIle325330335AlaProValAlaIleSerGlnIleGlnGluSerAspThrLeuLeuVal340345350GlnGluProSer355<210>14<211>356<212>PRT<213>人工序列<400>14MetGlnThrArgLysIleValArgAlaAlaAlaValGlnAlaAlaSer151015ProAsnTyrAspLeuAlaAlaGlyValAspLysThrIleGluLeuAla202530ArgGlnAlaArgAspGluGlyCysAspLeuIleValPheGlyGluThr354045TrpLeuProGlyTyrProPheHisValTrpLeuGlyAlaProAlaTrp505560SerLeuLysTyrSerAlaArgTyrTyrAlaAsnSerLeuSerLeuAsp65707580SerAlaGluPheGlnArgIleAlaGlnAlaAlaArgThrLeuGlyIle859095PheIleAlaLeuGlyTyrSerGluArgSerGlyGlySerLeuTyrLeu100105110GlyGlnCysLeuIleAspAspLysGlyGluMetLeuTrpSerArgArg115120125LysLeuLysProThrValAlaGluArgThrValPheGlyGluGlyTyr130135140AlaArgAspLeuIleValSerAspThrGluLeuGlyArgValGlyAla145150155160LeuCysCysTrpGluHisLeuSerProLeuSerLysTyrAlaLeuTyr165170175SerGlnHisGluAlaIleHisIleAlaAlaTrpProSerPheSerVal180185190TyrSerGluGlnAlaHisAlaLeuSerAlaLysValAsnMetAlaAla195200205SerGlnIleTyrSerValGluGlyGlnCysPheThrIleAlaAlaSer210215220SerValValThrGlnGluThrLeuAspMetLeuGluValGlyGluHis225230235240AsnAlaSerLeuLeuThrValGlyGlyGlySerSerMetIlePheAla245250255ProAspGlyArgThrLeuAlaProTyrLeuProHisAspAlaGluGly260265270LeuIleIleAlaAspLeuAsnMetGluGluIleAlaPheAlaLysAla275280285IleAsnAspProAlaGlyHisTyrSerLysProGluAlaThrArgLeu290295300ValLeuAspLeuGlyHisArgGluProMetThrArgValHisSerGln305310315320SerLeuIleLysGluGluAlaCysGluProLeuThrProSerThrIle325330335AlaProValAlaIleSerGlnIleGlnGluSerAspThrLeuLeuVal340345350GlnGluProSer355<210>15<211>356<212>PRT<213>人工序列<400>15MetGlnThrArgLysIleValArgAlaAlaAlaValGlnAlaAlaSer151015ProAsnTyrAspLeuAlaAlaGlyValAspLysThrIleGluLeuAla202530ArgGlnAlaArgAspGluGlyCysAlaLeuIleValPheGlyGluThr354045TrpLeuProGlyTyrProPheHisValTrpLeuGlyAlaProAlaTrp505560SerLeuLysTyrSerAlaArgTyrTyrAlaAsnSerLeuSerLeuAsp65707580SerAlaGluPheGlnArgIleAlaGlnAlaAlaArgThrLeuGlyIle859095PheIleAlaLeuGlyTyrSerGluArgSerGlyGlySerLeuTyrLeu100105110GlyGlnCysLeuIleAspAspLysGlyGluMetLeuTrpSerArgArg115120125LysLeuLysProThrValAlaGluArgThrValPheGlyGluGlyTyr130135140AlaArgAspLeuIleValSerAspThrGluLeuGlyArgValGlyAla145150155160LeuCysCysTrpGluHisLeuSerProLeuSerLysTyrAlaLeuTyr165170175SerGlnHisGluAlaIleHisIleAlaAlaTrpProSerPheSerVal180185190TyrSerGluGlnAlaHisAlaLeuSerAlaLysValAsnMetAlaAla195200205SerGlnIleTyrSerValGluGlyGlnCysPheThrIleAlaAlaSer210215220SerValValThrGlnGluThrLeuAspMetLeuGluValGlyGluHis225230235240AsnAlaSerLeuLeuThrValGlyGlyGlySerSerMetIlePheAla245250255ProAspGlyArgThrLeuAlaProTyrLeuProHisAspAlaGluGly260265270LeuIleIleAlaAspLeuAsnMetGluGluIleAlaPheAlaLysAla275280285IleAsnAspProAlaGlyHisTyrSerLysProGluAlaThrArgLeu290295300ValLeuAspLeuGlyHisArgGluProMetThrArgValHisSerGln305310315320SerLeuIleLysGluGluAlaCysGluProLeuThrProSerThrIle325330335AlaProValAlaIleSerGlnIleGlnGluSerAspThrLeuLeuVal340345350GlnGluProSer355<210>16<211>356<212>PRT<213>人工序列<400>16MetGlnThrArgLysIleValArgAlaAlaAlaValGlnAlaAlaSer151015ProAsnTyrAspLeuAlaAlaGlyValAspLysThrIleGluLeuAla202530ArgGlnAlaArgAspGluGlyCysAspLeuIleValPheGlyGluThr354045TrpLeuProGlyTyrProPheHisValTrpLeuGlyAlaProAlaTrp505560SerLeuLysTyrSerAlaArgTyrTyrAlaAsnSerLeuSerLeuAsp65707580SerAlaGluPheGlnArgIleAlaGlnAlaAlaArgThrLeuGlyIle859095PheIleAlaLeuGlyTyrSerGluArgSerGlyGlySerLeuTyrLeu100105110GlyGlnCysLeuIleAspAspIleGlyGluMetLeuTrpSerArgArg115120125LysLeuLysProThrValAlaGluArgThrValPheGlyGluGlyTyr130135140AlaArgAspLeuIleValSerAspThrGluLeuGlyArgValGlyAla145150155160LeuCysCysTrpGluHisLeuSerProLeuSerLysTyrAlaLeuTyr165170175SerGlnHisGluAlaIleHisIleAlaAlaTrpProSerPheSerVal180185190TyrSerGluGlnAlaHisAlaLeuSerAlaLysValAsnMetAlaAla195200205SerGlnIleTyrSerValGluGlyGlnCysPheThrIleAlaAlaSer210215220SerValValThrGlnGluThrLeuAspMetLeuGluValGlyGluHis225230235240AsnAlaSerLeuLeuThrValGlyGlyGlySerSerMetIlePheAla245250255ProAspGlyArgThrLeuAlaProTyrLeuProHisAspAlaGluGly260265270LeuIleIleAlaAspLeuAsnMetGluGluIleAlaPheAlaLysAla275280285IleAsnAspProAlaGlyHisTyrSerLysProGluAlaThrArgLeu290295300ValLeuAspLeuGlyHisArgGluProMetThrArgValHisSerGln305310315320SerLeuIleLysGluGluAlaCysGluProLeuThrProSerThrIle325330335AlaProValAlaIleSerGlnIleGlnGluSerAspThrLeuLeuVal340345350GlnGluProSer355<210>17<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>17cccatatgcagacaagaaaaatc23<210>18<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>18ccaagctttcaggacggttcttg23<210>19<211>46<212>DNA<213>人工序列<400>19cgcaaacttaaacccacacatgcggagcgcaccgtgtttggtgaag46<210>20<211>46<212>DNA<213>人工序列<400>20cttcaccaaacacggtgcgctccgcatgtgtgggtttaagtttgcg46<210>21<211>46<212>DNA<213>人工序列<400>21cgcaaacttaaacccacacattatgagcgcaccgtgtttggtgaag46<210>22<211>46<212>DNA<213>人工序列<400>22cttcaccaaacacggtgcgctcataatgtgtgggtttaagtttgcg46<210>23<211>44<212>DNA<213>人工序列<400>23ccgcaaacttaaacccacagtggcggagcgcaccgtgtttggtg44<210>24<211>44<212>DNA<213>人工序列<400>24caccaaacacggtgcgctccgccactgtgggtttaagtttgcgg44<210>25<211>41<212>DNA<213>人工序列<400>25cgcctggccgtctttttcggtgtacagtgaacaggcccatg41<210>26<211>41<212>DNA<213>人工序列<400>26catgggcctgttcactgtacaccgaaaaagacggccaggcg41<210>27<211>45<212>DNA<213>人工序列<400>27caggcccgcgatgagggctgcgcactgatcgtgtttggtgaaacc45<210>28<211>46<212>DNA<213>人工序列<400>28ggtttcaccaaacacgatcagttgcgcagccctcatcgcgggcctg46<210>29<211>45<212>DNA<213>人工序列<400>29aactcgctctcgctggacagttgggaatttcaacgcattgcccag45<210>30<211>45<212>DNA<213>人工序列<400>30ctgggcaatgcgttgaaattcccaactgtccagcgagagcgagtt45<210>31<211>45<212>DNA<213>人工序列<400>31ggccaatgcctgattgacgacatcggcgagatgctgtggtcgcgc45<210>32<211>45<212>DNA<213>人工序列<400>32gcgcgaccacagcatctcgccgatgtcgtcaatcaggcattggcc45<210>33<211>45<212>DNA<213>人工序列<400>33gagcccatgacacgggttcacatccaaagcctgatcaaggaagag45<210>34<211>45<212>DNA<213>人工序列<400>34ctcttccttgatcaggctttggatgtgaacccgtgtcatgggctc45當前第1頁1 2 3