(一)技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種重組腈水解酶、載體及應(yīng)用，以及利用表達(dá)該腈水解酶的重組大腸桿菌進(jìn)行生物催化亞氨基二乙腈(iminodiacetonitrile，idan)制備亞氨基二乙酸(iminodiaceticacid，ida)的方法。

(二)

背景技術(shù)：

腈水解酶是一類(lèi)功能多樣的生物催化劑，可在溫和的條件下，通過(guò)一步反應(yīng)催化有機(jī)腈類(lèi)化合物水解得到相應(yīng)的羧酸和氨。腈水解酶是一類(lèi)具有廣泛底物譜的生物催化劑，具有獨(dú)特的催化特性，在有機(jī)合成中表現(xiàn)出巨大的工業(yè)應(yīng)用潛力。

亞氨基二乙酸，分子式為hn(ch2cooh)2，易溶于水，難溶于乙醇、丙酮和乙醚等有機(jī)溶劑，是一種重要的化工中間體，廣泛用于螯合劑、表面活性劑、農(nóng)藥等的合成，特別是全球性的除草劑草甘膦的中間體的制備。目前，一般采用化學(xué)方法進(jìn)行亞氨基二乙酸的制備，主要包括：氯乙酸法、氯乙酸-氨基乙酸法、氮川三乙酸法、氯乙酸-甘氨酸法、二乙醇胺法和氫氰酸法等。以上化學(xué)方法存在生產(chǎn)成本高、污染嚴(yán)重、對(duì)設(shè)備要求高等不足。生物酶法催化亞氨基二乙腈生產(chǎn)亞氨基二乙酸，具有高效、高選擇、反應(yīng)條件溫和、環(huán)境污染少、成本低、產(chǎn)物光學(xué)純度高等的優(yōu)點(diǎn)，符合原子經(jīng)濟(jì)學(xué)和綠色化學(xué)的發(fā)展方向，具有化學(xué)法無(wú)可比擬的優(yōu)勢(shì)。

有關(guān)以亞氨基二乙腈為底物通過(guò)生物酶法生產(chǎn)亞氨基二乙酸的方法已經(jīng)得到研究，相關(guān)的技術(shù)得到開(kāi)發(fā)已經(jīng)有所報(bào)道，包括菌株篩選(cn101629192a)、生物酶法(cn101392276a、cn102286409a、cn102277320a、cn102277322a)和產(chǎn)物亞氨基二乙酸的檢測(cè)方法(cn101398413a)。生物催化亞氨基二乙腈生產(chǎn)亞氨基二乙酸的過(guò)程如下：

在菌株篩選專利cn101629192a中報(bào)道：取1g濕菌體，置于500ml三角瓶中，加入50ml2％(w/w)的反應(yīng)底物亞氨基二乙腈水溶液，30℃搖床150r/min條件下反應(yīng)60min，篩選到具有催化活性的15株菌，其中糞產(chǎn)堿桿菌(alcaligenesfaecaliszjb09138)的轉(zhuǎn)化率達(dá)54.8％。在生物酶法合成亞氨基二乙酸的專利(cn101392276a、cn102286409a、cn102277320a、cn102277322a)中，分別介紹了四種菌株為糞產(chǎn)堿桿菌(alcaligenesfaecaliszjutb10)、紫紅紅球菌(rhodococcusrhodochrouszjb09125)、藤黃微球菌(micrococcusluteuszjb09131)和節(jié)桿菌(arthrobacternitroguajacolicuszjutb0699)。alcaligenesfaecaliszjutb10濕細(xì)胞為30g/l，在100ml0.2m亞氨基二乙腈的水溶液中，30℃200rpm條件下反應(yīng)24h后，可得亞氨基二乙酸105.5mm，即產(chǎn)率可達(dá)52.8％；rhodococcusrhodochrouszjb09125、micrococcusluteuszjb09131和arthrobacternitroguajacolicuszjutb0699濕細(xì)胞分別為50g/l，在100ml3％(w/w)亞氨基二乙腈的水溶液(ph7.0)中，30℃200rpm條件下反應(yīng)10h后，轉(zhuǎn)化率分別可達(dá)26.2％、24.8％和26.5％。在產(chǎn)物亞氨基二乙酸的檢測(cè)方法(cn101398413a)專利報(bào)道了其色譜條件：elitec18色譜柱，流動(dòng)相：甲醇：0.05mol/l乙酸-乙酸鈉溶液(甲醇與乙酸-乙酸鈉溶液體積比55:45)，流速：1.2ml/min。

然而，目前報(bào)道的生物酶法生產(chǎn)亞氨基二乙酸技術(shù)尚存在產(chǎn)率不高、底物耐受性低等問(wèn)題，不能達(dá)到規(guī)模化工業(yè)生產(chǎn)的要求。

(三)

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的是提供一種重組腈水解酶及該酶在催化水解亞氨基二乙腈制備亞氨基二乙酸中的應(yīng)用。本發(fā)明獲得的重組腈水解酶具有較高的底物耐受性和催化活力，催化過(guò)程對(duì)環(huán)境友好。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

本發(fā)明涉及一種重組腈水解酶，所述重組腈水解酶的氨基酸序列為seqidno.1所示。

由于氨基酸序列的特殊性，任何含有seqidno.1所示氨基酸序列的肽蛋白的片段或其變體，如其保守性變體、生物活性片段或衍生物，只要該肽蛋白的片段或肽蛋白變體與前述氨基酸序列同源性在90％以上，均屬于本發(fā)明保護(hù)范圍之列。具體的所述改變可包括氨基酸序列中氨基酸的缺失、插入或替換；其中，對(duì)于變體的保守性改變，所替換的氨基酸具有與原氨基酸相似的結(jié)構(gòu)或化學(xué)性質(zhì)，如用亮氨酸替換異亮氨酸，變體也可具有非保守性改變，如用色氨酸替換甘氨酸。

本發(fā)明還提供一種所述重組腈水解酶的編碼基因，所述編碼基因的核苷酸序列為seqidno.2所示。

由于核苷酸序列的特殊性，任何seqidno.2所示多核苷酸的變體，只要其與該多核苷酸具有90％以上同源性，均屬于本發(fā)明保護(hù)范圍之列。所述多核苷酸的變體是指一種具有一個(gè)或多個(gè)核苷酸改變的多核苷酸序列。此多核苷酸的變體可以使生的變位變異體或非生的變異體，包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領(lǐng)域所知的，等位變異體是一個(gè)多核苷酸的替換形式，它可能是一個(gè)多核苷酸的取代、缺失或插入，但不會(huì)從實(shí)質(zhì)上改變其編碼的肽蛋白的功能。

本發(fā)明還提供一種由所述重組腈水解酶編碼基因構(gòu)建的重組載體。

本發(fā)明提供一種由所述重組載體轉(zhuǎn)化得到的重組基因工程菌。

本發(fā)明所述重組腈水解酶編碼基因在構(gòu)建能夠催化亞氨基二乙腈制備亞氨基二乙酸的重組腈水解酶中的應(yīng)用，所述的應(yīng)用為：構(gòu)建含有重組腈水解酶編碼基因的重組載體，將所述重組載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中，獲得的重組基因工程菌進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，培養(yǎng)液分離純化獲得含重組腈水解酶的菌體細(xì)胞。

本發(fā)明涉及一種所述重組腈水解酶在制備亞氨基二乙酸中的應(yīng)用，所述的應(yīng)用為：將含有重組腈水解酶編碼基因的重組基因工程菌經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)后的發(fā)酵液離心，以濕菌體或濕菌體破碎分離純化后的純酶作為催化劑，以亞氨基二乙腈為底物，以ph值為3.0～10.0(優(yōu)選7.0～7.5)的50mm磷酸鹽緩沖液為反應(yīng)介質(zhì)構(gòu)成反應(yīng)體系，在25～70℃(優(yōu)選30～35℃)轉(zhuǎn)化反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液分離純化，獲得亞氨基二乙酸。

所述底物初始濃度為0.02～0.63mol/l，優(yōu)選0.315～0.63mol/l，所述濕菌體的用量為10～100g/l，優(yōu)選50～100g/l，所述酶的用量為0.3～1g/l(即50～200u/l，優(yōu)選127～200u/l)。

本發(fā)明所述催化劑的制備方法為：(1)斜面培養(yǎng)：將含有重組腈水解酶編碼基因的重組基因工程菌接種至斜面培養(yǎng)基，在28～37℃培養(yǎng)12～24小時(shí)，獲得斜面菌體；所述斜面培養(yǎng)基終濃度組成為：10g/l蛋白胨，5g/l酵母提取物，10g/l氯化鈉，20g/l瓊脂，溶劑為水，ph值為7.0；

(2)種子培養(yǎng)：從斜面菌體挑取一接種環(huán)菌體接種至含終濃度50mg/l卡那霉素(kan)的lysogeny-broth(lb)液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)10-12小時(shí)，獲得種子液；lb液體培養(yǎng)基終濃度組成：10g/l蛋白胨，5g/l酵母提取物，10g/l氯化鈉，溶劑為水，ph值為7.0；

(3)發(fā)酵培養(yǎng)：以體積濃度2％的接種量將種子液接種至含有終濃度50mg/l的kan的lb液體培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)至培養(yǎng)液的od600為0.6-0.8之間，加入異丙基-β-d-硫代吡喃半乳糖苷(iptg)至終濃度為0.1mm，28℃誘導(dǎo)培養(yǎng)10小時(shí)，4℃、5000rpm離心10min，棄去上清液，收集濕菌體；

(4)分離純化：將收集的濕菌體在超純水(100g/l(w/v))中重懸，進(jìn)行超聲波破碎(400w，15min)，取破碎后的上清液經(jīng)nickel-nta柱純化，上柱之前先用緩沖液(終濃度300mmnacl，溶劑為20mmnah2po4(ph8.0)進(jìn)行平衡；接著用洗脫緩沖液(終濃度300mmnacl、終濃度50mm咪唑，溶劑為20mmnah2po4(ph8.0))洗脫不具有吸附性的蛋白；最后，用蛋白洗脫液(終濃度300mmnacl和終濃度500mm咪唑，溶劑為20mmnah2po4(ph8.0)解吸目的蛋白，收集蛋白洗脫液洗脫產(chǎn)生的流出液，獲得重組腈水解酶純酶。

能夠提供本發(fā)明所述重組腈水解酶及其編碼基因的原始菌株為敏捷食酸菌(acidovoraxfacilis)zjb09122，該菌種保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為cctccno.m209044，已在先前申請(qǐng)的專利cn101629192b中披露，同時(shí)編碼基因的克隆內(nèi)容已在專利cn104212784a中披露。

本發(fā)明的要點(diǎn)在于提供了seqidno.1所示的氨基酸序列和seqidno.2所示的核苷酸序列，在已知該氨基酸序列和核苷酸序列的情況下，該氨基酸序列和核苷酸序列的獲得，以及相關(guān)載體、宿主細(xì)胞的獲得，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)均是顯而易見(jiàn)的。

以專利cn104212784a披露的e.colibl21(de3)/pet-28b(+)-acn1為基礎(chǔ)進(jìn)行點(diǎn)飽和突變，以6％(w/v)亞氨基二乙腈為底物，應(yīng)用突變后的菌株為催化劑生產(chǎn)亞氨基二乙酸，最終，將此菌株應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在：本發(fā)明提供一種水解亞氨基二乙酸的重組腈水解酶，在催化上述反應(yīng)時(shí)，可以耐受630mm亞氨基二乙腈，比酶活可達(dá)159.90u/g，具有良好的底物耐受性和催化活力，生產(chǎn)過(guò)程對(duì)環(huán)境友好；可有效解決傳統(tǒng)的化學(xué)法水解亞氨基二乙腈制備亞氨基二乙酸工藝中，存在的反應(yīng)條件苛刻，需要消耗大量的有機(jī)溶劑，成本較高，收率較低，環(huán)境污染較為嚴(yán)重等問(wèn)題。

(四)附圖說(shuō)明

圖1腈水解酶sds-page圖，maker(kda):130、95、72、55、43、34、26和17；條帶1：純化后的acnmut6；

圖2acnmut6腈水解酶的最適溫度分析；

圖3acnmut6腈水解酶的最適ph分析；

圖4acnmut6腈水解酶的動(dòng)力學(xué)分析；

圖5acnmut6細(xì)胞催化的反應(yīng)進(jìn)程曲線。

(五)具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此：

實(shí)施例1

含有表達(dá)載體pet-28b(+)-acn1的e.colibl21(de3)/pet28b(+)-acn1的構(gòu)建已經(jīng)在專利cn104212784a中披露，以此為基礎(chǔ)，為提高底物亞氨基二乙腈的耐受性和產(chǎn)物亞氨基二乙酸的產(chǎn)率，對(duì)其進(jìn)行點(diǎn)飽和突變，設(shè)計(jì)突變引物如下：

tyr(y)54：

上游引物1：5’-gttttcatccctggtnnnccgtattg-3’,

下游引物2：5’-caatacggnnnaccagggatgaaaac-3’

thr(t)134:

上游引物3：5’-aaaccannncacgttgaacgtacg-3’,

下游引物4：5’-cgtacgttcaacgtgnnntggttt-3’,

trp(w)165：

上游引物:5：5’-tctgaactgcnnngagcacgttc-3’

下游引物6：5’-tgaacgtgctcnnngcagttcagacc-3’

phe(f)168：

上游引物7：5’-gagcacnnncagccgctgtccaaattc-3’

下游引物8：5’-cggctgnnngtgctcccagcagttc-3’

met(m)191：

上游引物9：5’-ccggctnnntccccgctgcaac-3’

下游引物10：5’-gttgcagcggggannnagccgg-3’

ser(s)192：

上游引物11：5’-ttcttggccggctatgnnnccgctgc-3’

下游引物12：5’-cagcggnnncatagccggccaagaag-3’

leu(l)201：

上游引物13：5’-tgtttcaannntccatcgaggctaatgcg-3’

下游引物14：5’-cgcattagcctcgatggannnttgaaac-3’

以acn1的基因序列為模板進(jìn)行pcr擴(kuò)增(pcr反應(yīng)參數(shù)為：94℃4min；98℃10s，55℃15s，72℃6min，重復(fù)30個(gè)循環(huán)；72℃繼續(xù)延伸10min)。將擴(kuò)增后回收的pcr產(chǎn)物用dpni酶切3h，應(yīng)用純化試劑盒將酶切產(chǎn)物純化后轉(zhuǎn)化至e.colijm109受體菌，涂布于含終濃度50mg/lkan的lb固體平板上，37℃培養(yǎng)過(guò)夜后，平板上長(zhǎng)出許多白色菌落。隨機(jī)挑取白色克隆提取質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序后對(duì)突變后的陽(yáng)性菌落進(jìn)行純培養(yǎng)，提取質(zhì)粒后轉(zhuǎn)入e.colibl21(de3)中表達(dá)，獲得含有重組腈水解酶基因(該核苷酸序列如seqidno：2所示)的e.colibl21(de3)。

實(shí)施例2

依據(jù)在實(shí)施例1的方法，經(jīng)過(guò)六輪突變，最終得到最優(yōu)突變體acnmut6(y54f/t134s/f168v/l201n/m191t/f192s)，對(duì)其進(jìn)行培養(yǎng)：

(1)誘導(dǎo)培養(yǎng)：將含有表達(dá)載體pet28b(+)-acnmut6的e.colibl21(de3)，接種至含終濃度50mg/lkan的lysogeny-broth(lb)液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)10-12小時(shí)，隨即以體積濃度2％的接種量接種至含有終濃度50mg/lkan的lb液體培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)至培養(yǎng)液的od600為0.6-0.8之間，加入終濃度為0.1mm的iptg，28℃誘導(dǎo)培養(yǎng)10小時(shí)，4℃、5000rpm離心10min，收集經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)后的濕菌體(即催化劑)，進(jìn)行sds-page檢測(cè)。

(2)分離純化：同時(shí)，進(jìn)行ni柱分離純化，純化步驟如下：將收集的濕菌體1g進(jìn)行超聲波破碎(400w，15min)，4℃、8000rpm離心10min，取10ml的上清液作為粗酶液，進(jìn)行nickel-nta柱純化，上柱之前先用緩沖液(終濃度300mmnacl，溶劑為20mmnah2po4(ph8.0))進(jìn)行平衡；接著用洗脫緩沖液(終濃度300mmnacl、終濃度50mm咪唑，溶劑為20mmnah2po4(ph8.0))洗脫不具有吸附性的蛋白；最后，用蛋白洗脫液(終濃度300mmnacl和終濃度500mm咪唑，溶劑為20mmnah2po4(ph8.0)解吸目的蛋白，收集蛋白洗脫液洗脫產(chǎn)生的流出液，獲得重組腈水解酶acnmut6純酶液，濃度為1.0mg/ml，將純酶液稀釋10倍后，用sds-page凝膠電泳對(duì)重組腈水解酶的表達(dá)進(jìn)行驗(yàn)證(見(jiàn)圖1)。

實(shí)施例3

將實(shí)施例2經(jīng)iptg誘導(dǎo)后所得到的含重組腈水解酶突變體的大腸桿菌工程菌全細(xì)胞進(jìn)行催化反應(yīng)，以e.colibl21(de3)、未誘導(dǎo)的e.colibl21(de3)/pet-28b(+)-acnmut6和經(jīng)誘導(dǎo)的e.colibl21(de3)/pet-28b(+)-acn1作為對(duì)照組，催化反應(yīng)體系為10ml：以終濃度630mm亞氨基二乙腈為底物，以實(shí)施例2步驟(1)制備的濕菌體為催化劑，以ph值為7.0的50mm的磷酸鹽為反應(yīng)介質(zhì)。轉(zhuǎn)化體系中濕菌體的加入量為10g/l，在35℃進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)6h，反應(yīng)結(jié)束后，取1ml樣品，用100μl2m鹽酸終止反應(yīng)，4℃、12,000rpm離心3min取上清進(jìn)行高效液相色譜分析。酶活(u)定義為：在35℃，ph7.0條件下，每小時(shí)催化產(chǎn)生1μmol亞氨基二乙酸所需的濕菌體量(酶量)為一個(gè)活力單位，比酶活(u/g或u/mgprotein)定義為：1g濕菌體或1mg純酶含有的酶活單位。

亞氨基二乙酸的液相色譜shimadzulc-20ad的分析檢測(cè)方法：色譜柱類(lèi)型：anionexchangecolumnhypersilsax；色譜條件：柱溫30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)：210nm，流動(dòng)相：20mm(nh4)2hpo4(用磷酸調(diào)至ph4.0)，流速：1.0ml/min。

從表1可以看出，未經(jīng)iptg誘導(dǎo)的野生型菌株和突變菌株的酶活均為零，經(jīng)iptg誘導(dǎo)后，發(fā)現(xiàn)e.colibl21(de3)/pet28b(+)-acnmut6已成功構(gòu)建，并能夠表達(dá)具有催化活性的腈水解酶，比酶活為159.90u/g，是原始菌株e.colibl21(de3)/pet-28b(+)-acn1的2.46倍。

表1腈水解酶濕菌體的酶活比較

實(shí)施例4

將實(shí)施例2制備的重組腈水解酶acnmut6純酶(158.9u/g(mmol/g/h))在不同溫度25-70℃范圍內(nèi)(25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、70℃)進(jìn)行活力檢測(cè)。反應(yīng)體系為10ml：底物亞氨基二乙腈的終濃度為630mm，純酶加入量為0.8g/l(即127.1u/l)，緩沖體系為ph7.5、50mm磷酸鹽緩沖液，在上述九個(gè)溫度梯度150rpm條件下，各轉(zhuǎn)化反應(yīng)6h，反應(yīng)結(jié)束后，取1ml樣品，用100μl2mhcl以終止反應(yīng)，4℃、12,000rpm離心3min取上清進(jìn)行高效液相色譜分析，檢測(cè)方法見(jiàn)實(shí)施例3。以沒(méi)有加入純酶的反應(yīng)體系作為空白對(duì)照。實(shí)驗(yàn)結(jié)果(見(jiàn)圖2)表明：未加入純酶的反應(yīng)中，沒(méi)有檢測(cè)到有產(chǎn)物亞氨基二乙酸的生成，含有純酶的催化反應(yīng)中，優(yōu)選溫度為40℃時(shí)，腈水解酶mut6的比酶活最高，為174.65u/mg，算法見(jiàn)實(shí)施例3。

實(shí)施例5

將實(shí)施例2制備的重組腈水解酶acnmut6純酶(158.9u/g(mmol/g/h))在不同ph3.0-10.0范圍內(nèi)進(jìn)行活力檢測(cè)，反應(yīng)體系為10ml：底物亞氨基二乙腈的終濃度為630mm，純酶加入量為0.8g/l(即127.1u/l)，以不同ph值的緩沖液為反應(yīng)介質(zhì)，在35℃轉(zhuǎn)化反應(yīng)6h，4℃、12,000rpm離心3min取上清進(jìn)行高效液相色譜分析，檢測(cè)方法在實(shí)施例3。

緩沖體系為：檸檬酸-檸檬酸鈉(ph3.0、4.0、5.0、6.0)，磷酸二氫鉀-磷酸氫二鉀(ph7.0)，tris-hcl(ph8.0、9.0)和甘氨酸-氫氧化鈉(ph10.0)。以沒(méi)有加入純酶的反應(yīng)體系作為空白對(duì)照。實(shí)驗(yàn)結(jié)果(見(jiàn)圖3)：未加入純酶的反應(yīng)中，沒(méi)有檢測(cè)到有產(chǎn)物亞氨基二乙酸的生成，有純酶的催化反應(yīng)中，腈水解酶mut6的最適ph為7.0，對(duì)應(yīng)的比酶活為137.41u/mg。

實(shí)施例6

將實(shí)施例2制備的重組腈水解酶acnmut6純酶(158.9u/g(mmol/g/h))在35℃溫浴5min，獲得預(yù)處理的酶液。反應(yīng)體系為10ml：底物亞氨基二乙腈的終濃度為21-315mm(21mm、52.5mm、84mm、105mm、126mm、157.5mm、189mm、210mm、262.5mm、315mm)，以ph7.050mm的磷酸鹽緩沖液為反應(yīng)介質(zhì)，純酶加入量為0.8g/l(即127.1u/l)，在35℃、150rpm水浴轉(zhuǎn)化反應(yīng)，每30min取樣1ml，同時(shí)向樣品中加入200μl2mhcl水溶液終止反應(yīng)制成樣品混合液，20μl樣品混合液進(jìn)行高效液相色譜分析，檢測(cè)方法在實(shí)施例3。以未加入純酶的反應(yīng)體系作為空白對(duì)照。

起始速率用米氏方程vo＝vmax[s]/([s]+km)來(lái)擬合，其中，vo表示初速度，vmax表示最大反應(yīng)速率，[s]表示底物濃度，km表示米氏常數(shù)，通過(guò)origin8.0軟件進(jìn)行作圖，通過(guò)倒數(shù)曲線計(jì)算出動(dòng)力學(xué)常數(shù)vmax和km。實(shí)驗(yàn)結(jié)果(見(jiàn)圖4)表明：未加入純酶的反應(yīng)中，沒(méi)有檢測(cè)到有產(chǎn)物亞氨基二乙酸的生成，有純酶的催化反應(yīng)中，重組腈水解酶acnmut6的km和vmax分別為536.2mm和769.2μmol/mg/h。

實(shí)施例7

將實(shí)施例2制備的重組腈水解酶acnmut6純酶(158.9u/g(mmol/g/h))的活力分別在終濃度5mm金屬離子、edta、表面活性劑中檢測(cè)，并以無(wú)金屬離子、edta和表面活性劑條件下的反應(yīng)作為空白對(duì)照(其酶的活力作為100％)。反應(yīng)體系為10ml：亞氨基二乙腈(630mm)，純酶加入量為0.8g/l(即127.1u/l)，終濃度分別為5mm金屬離子、edta和表面活性劑(sorbitol、sds、tween20、tween80)的ph7.050mm磷酸鹽緩沖液作為反應(yīng)介質(zhì)。在35℃條件下，反應(yīng)6h，反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液4℃、12,000rpm離心3min取上清進(jìn)行高效液相色譜分析，檢測(cè)方法見(jiàn)實(shí)施例3。acnmut6實(shí)驗(yàn)結(jié)果(見(jiàn)表2、表3)表明：co²⁺和edta²⁺可以增強(qiáng)重組腈水解酶acnmut6純酶的活力，而cu²⁺、zn²⁺等會(huì)顯著抑制酶活acnmut6表面活性劑sorbitol、sds、tween20和tween80的加入對(duì)重組腈水解酶acnmut6的活力都存在不同程度的抑制作用。

表2acnmut6腈水解酶的金屬離子分析

表3表面活性劑

實(shí)施例8

將實(shí)施例2得到的濕菌體進(jìn)行生物催化，反應(yīng)體系200ml，包括濕菌體用量100g/l(以沒(méi)有加入濕菌體的反應(yīng)體系作為空白對(duì)照)，亞氨基二乙腈終濃度630mm，反應(yīng)介質(zhì)為ph7.0、50mm磷酸鹽緩沖液，反應(yīng)時(shí)間：0-6h(具體取樣點(diǎn)為0h、0.5h、1h、2h、3h、4h、5h和6h)，反應(yīng)溫度：35℃，反應(yīng)結(jié)束后，取反應(yīng)液進(jìn)行高效液相分析檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果(見(jiàn)圖5)表明：未加入濕菌體的反應(yīng)中，沒(méi)有檢測(cè)到有產(chǎn)物亞氨基二酸的生成，有濕菌體的催化在反應(yīng)5h后，突變體acnmut6的轉(zhuǎn)化率達(dá)90％以上，產(chǎn)率達(dá)80％以上。

sequencelisting

<110>浙江工業(yè)大學(xué)

<120>一種重組腈水解酶、基因、載體、工程菌及應(yīng)用

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