本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種中性高溫木聚糖酶及其編碼基因和其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：木聚糖(xylan)是自然界中的含量僅次于纖維素的第二豐富植物生物質(zhì)的主要成分(lyndetal.microbiologyandmolecularbiologyreview,2002,66:506–577)，在生物能源方面有潛在的利用價(jià)值?，F(xiàn)有生物技術(shù)可以高效降解植物中的纖維素成分并轉(zhuǎn)化成可發(fā)酵的葡萄糖，后者在酵母作用下生成生物乙醇。高組分的木聚糖不但限制了纖維素酶與纖維素的結(jié)合反應(yīng)，抑制催化反應(yīng)，而且作為副產(chǎn)品排入自然界可引起營養(yǎng)富集化從而破壞生態(tài)系統(tǒng)(polizelietal.appliedmicrobiologyandbiotechnology,2005,67:577-591)。因此在生物質(zhì)生物轉(zhuǎn)化過程中，通常要添加木聚糖酶，一方面去除木聚糖的物理屏障，促進(jìn)纖維素酶與纖維素的結(jié)合(huetal.biotechnologyforbiofuels,2011,4:14；qingandwymanbiotechnologyforbiofuels,2011,4:18)，另一方面生成的木寡糖也可以進(jìn)一步降解成可發(fā)酵的木糖，為生物乙醇的生產(chǎn)提供10-25％的原料物質(zhì)(jinetal.appliedandenvironmentalmicrobiology,2004,70:6816-6825)。基于氨基酸序列和催化域的結(jié)構(gòu)，大部分木聚糖酶(ec3.2.1.8)劃分在糖苷水解酶第10和11家族。與專一降解木聚糖的第11家族木聚糖酶相比，第10家族的木聚糖酶具有寬泛的底物特異性，除了作用于木聚糖外，還可催化纖維素、葡聚糖等多種底物的降解，因此在工業(yè)領(lǐng)域中具有更廣泛的應(yīng)用前景?，F(xiàn)有的生物乙醇加工工藝包括木質(zhì)纖維素的酸堿預(yù)處理、長時(shí)間高溫酶反應(yīng)，從而消耗大量的能量和酸堿化學(xué)試劑，造成成本的大幅度提升和嚴(yán)重的環(huán)境污染。因此開發(fā)中性高溫的木質(zhì)纖維素降解酶系在節(jié)約能源、保護(hù)環(huán)境、易于催化反應(yīng)等方面具有重要的意義(jietal.biotechnologyforbiofuels,2014,7:130)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種蛋白，名稱為ctxyn10a，來源于天山枝孢菌cladosporiumtianshanensesl-14。本發(fā)明所述蛋白為如下1)、2)、或3)所述的蛋白：1)具有序列表中的seqid№.3所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；2)具有序列表中的seqid№.5所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；3)將序列表中的seqid№.3和/或seqid№.5所示的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有木聚糖酶活性的由1)和/或2)衍生的蛋白質(zhì)。序列表中seqid№.3所示的氨基酸序列由352個(gè)氨基酸殘基組成；其中，n端18個(gè)氨基酸為預(yù)測的信號肽序列，具有序列表中seqid№：4所示的氨基酸序列。序列表中seqid№.5所示的氨基酸序列由334個(gè)氨基酸殘基組成；即ctxyn10a成熟蛋白。上述1)、2)和3)中的ctxyn10a蛋白可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得到。上述1)、2)和3)中的ctxyn10a蛋白的編碼基因可通過將序列表中序列表中seqid№：1、seqid№：2、和/或seqid№：2的第55位-1059位所示核苷酸序列所示的dna序列缺失一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)堿基對的錯(cuò)義突變后得到。編碼所述ctxyn10a蛋白的核酸分子也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述核酸分子可以是dna，如cdna、基因組dna或重組dna；所述核酸分子也可以是rna，如mrna、hnrna或trna等。本發(fā)明的還一個(gè)目的是提供一種編碼基因，其特征在于，所述編碼基因具有下述核苷酸序列之一：1)編碼本發(fā)明所述蛋白的多核苷酸序列；2)序列表中seqid№：1、seqid№：2、和/或seqid№：2的第55位-1059位所示核苷酸序列；3)編碼序列表中seqid№：3和/或seqid№.5蛋白質(zhì)序列的多核苷酸序列；4)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與1)、2)、和/或3)任一限定的dna序列雜交的核苷酸序列；5)與1)、2)、3)、和/或4)任一限定的dna序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的dna序列。具體的，所述同源性為95％以上；再具體的為96％以上；再具體的為97％以上；再具體的為98％以上；再具體的為99％以上。上述高嚴(yán)謹(jǐn)條件可為用6×ssc，0.5％sds的溶液，在65℃下雜交，然后用2×ssc，0.1％sds和1×ssc，0.1％sds各洗膜一次。其中，序列表中seqid№：1所示的核苷酸序列，共1202bp，含有2個(gè)長度分別為59bp和84bp的內(nèi)含子序列，所述2個(gè)內(nèi)含子序列分別具有序列表中seqid№：1所示的第141位-199位核苷酸序列和第512位-595位核苷酸序列；去掉所述2個(gè)內(nèi)含子序列后的cdna長1059bp，具有序列表中seqid№：2的核苷酸序列，編碼序列表中seqid№：3所示的氨基酸序列和一個(gè)終止密碼子，即本發(fā)明所述ctxyn10a蛋白；具有序列表中seqid№：2的第55位-1059位核苷酸序列的核酸片段編碼序列表中seqid№：5所示的氨基酸序列，即本發(fā)明所述ctxyn10a成熟蛋白。本發(fā)明的還一個(gè)目的是提供一種載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系、重組菌、和/或微生物，所述載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系、重組菌、和/或微生物含有所述的編碼基因。具體的，所述載體包括重組克隆載體、重組表達(dá)載體；再具體的包括ppic-ctxyn10a；所述重組菌的出發(fā)菌包括大腸桿菌、酵母、芽孢桿菌、乳酸桿菌、曲霉、和/或木霉；再具體的，所述重組菌的出發(fā)菌包括畢赤酵母、啤酒酵母、和/或多型遜酵母；再具體的，所述重組菌的出發(fā)菌為畢赤酵母gs115；再具體的，所述重組菌具體為gs115/ctxyn10a；所述微生物包括天山枝孢菌cladosporiumtianshanensesl-14；所述重組表達(dá)載體可用現(xiàn)有的表達(dá)載體構(gòu)建。所述表達(dá)載體還可包含外源基因的3’端非翻譯區(qū)域，即包含聚腺苷酸信號和任何其它參與mrna加工或基因表達(dá)的dna片段。所述聚腺苷酸信號可引導(dǎo)聚腺苷酸加入到mrna前體的3’端。使用所述基因構(gòu)建重組表達(dá)載體時(shí)，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強(qiáng)型、組成型、組織特異型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，它們可單獨(dú)使用或與其它的啟動(dòng)子結(jié)合使用；此外，使用本發(fā)明的基因構(gòu)建重組表達(dá)載體時(shí)，還可使用增強(qiáng)子，包括翻譯增強(qiáng)子或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子。為了便于對轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對所用植物表達(dá)載體進(jìn)行加工，如加入在微生物中表達(dá)可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因(gus基因、gfp基因、螢光素酶基因等)、具有抗性的抗生素標(biāo)記物(慶大霉素標(biāo)記物、卡那霉素標(biāo)記物等)或是抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因(如抗除莠劑基因)等。從轉(zhuǎn)基因生物的安全性考慮，可不加任何選擇性標(biāo)記基因，直接以逆境篩選轉(zhuǎn)化株。本發(fā)明的還一個(gè)目的是提供一種引物對，所述引物對可擴(kuò)增所述編碼基因全長或其任意片段。本發(fā)明的還一個(gè)目的是提供一種蛋白的制備方法，所述方法包括：1)制備本發(fā)明所述的編碼基因；2)制備包含步驟1)所述編碼基因的重組表達(dá)載體；3)使步驟2)所述表達(dá)載體表達(dá)以獲得目的蛋白。具體的，所述方法還包括目的蛋白的去糖基化；所述使步驟2)所述表達(dá)載體表達(dá)的具體步驟包括將所述表達(dá)載體導(dǎo)入微生物中，使其表達(dá)；再具體的，所述微生物包括大腸桿菌、酵母、芽孢桿菌、乳酸桿菌、曲霉、和/或木霉；再具體的，所述微生物包括畢赤酵母、啤酒酵母、和/或多型遜酵母；再具體的，所述微生物為畢赤酵母gs115；具體的，所述重組表達(dá)載體包括ppic-ctxyn10a。所述蛋白制備方法制備得到的蛋白也屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍；具體的，所述蛋白包括本發(fā)明所述ctxyn10a蛋白和修飾結(jié)構(gòu)；具體的，所述修飾結(jié)構(gòu)包括糖基化結(jié)構(gòu)。本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供本發(fā)明所述的蛋白、編碼基因、重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系、重組菌、和/或微生物、引物對、蛋白制備方法、所述制備方法制備得到的蛋白的應(yīng)用。具體的，所述應(yīng)用包括在如下1)-8)至少一種中的應(yīng)用：1)在制備木聚糖酶和/或含有木聚糖酶相關(guān)產(chǎn)品中的應(yīng)用；2)在制備木聚糖酶突變體和/或含有木聚糖酶突變體相關(guān)產(chǎn)品中的應(yīng)用；3)在制備重組木聚糖酶和/或含有重組木聚糖酶相關(guān)產(chǎn)品中的應(yīng)用；4)在制備木寡糖、木二糖、木一糖、含有木寡糖、含有木二糖、和/或含有木一糖相關(guān)產(chǎn)品中的應(yīng)用；5)作為纖維素酶、葡聚糖酶和/或制備具有纖維素酶、葡聚糖酶酶活性相關(guān)產(chǎn)品中的應(yīng)用；6)在降解木聚糖、纖維素、和/或葡聚糖中的應(yīng)用；7)在制備應(yīng)用于工業(yè)、農(nóng)業(yè)、食品、醫(yī)藥、飼料、能源、廢物處理和/或環(huán)境保護(hù)領(lǐng)域中的產(chǎn)品中的應(yīng)用；8)在工業(yè)、農(nóng)業(yè)、食品、醫(yī)藥、飼料、能源、廢物處理和/或環(huán)境保護(hù)領(lǐng)域中的應(yīng)用。具體的，所述木聚糖包括櫸木木聚糖、可溶小麥阿拉伯木聚、樺木木聚糖、不可溶小麥阿拉伯木聚糖；所述纖維素包括羧甲基纖維素、地衣多糖；所述葡聚糖包括大麥葡聚糖。具體的，所述木聚糖酶包括本發(fā)明所述蛋白和/或本發(fā)明所述蛋白制備方法制備得到的蛋白；所述木聚糖酶突變體包括將本發(fā)明所述蛋白和/或本發(fā)明所述蛋白制備方法制備得到的蛋白經(jīng)點(diǎn)突變后所獲得的蛋白；所述重組木聚糖酶包括將本發(fā)明所述蛋白和/或本發(fā)明所述蛋白制備方法制備得到的蛋白經(jīng)同源重組后獲得的蛋白。具體的，所述應(yīng)用包括在如下1)、2)、3)、和/或4)所述條件下的應(yīng)用：1)ph包括4.0-12.0；2)溫度包括0℃-90℃；3)包括金屬離子、和/或化學(xué)試劑的環(huán)境；4)底物包括木聚糖、纖維素、和/或葡聚糖。優(yōu)選的，所述ph包括5.0-8.0；再優(yōu)選的，所述ph包括6.0-7.0；最優(yōu)選的，所述ph為6.5；優(yōu)選的，所述溫度包括50℃-80℃；優(yōu)選的，所述溫度包括50℃-75℃；優(yōu)選的，所述溫度包括60℃-75℃；最優(yōu)選的，所述溫度為70℃；所述金屬離子、和/或化學(xué)試劑包括ni2+，co2+，na+，cr3+，mg2+，mn2+，k+，cu2+，ca2+，pb2+，zn2+，fe3+，β-巰基乙醇，edta，sds；所述金屬離子、和/或化學(xué)試劑的濃度包括5mmol/l；所述木聚糖包括櫸木木聚糖、可溶小麥阿拉伯木聚、樺木木聚糖、不可溶小麥阿拉伯木聚糖；所述纖維素包括羧甲基纖維素、地衣多糖；所述葡聚糖包括大麥葡聚糖。本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供一種木聚糖酶的制備方法，所述方法包括：從cladosporiumtianshanensesl-14中提取木聚糖酶。本發(fā)明提供的木聚糖酶ctxyn10a在中性(ph5.0-8.0)和高溫(50℃-75℃)范圍內(nèi)均具有高活性的特性。本發(fā)明篩選到天山枝孢菌cladosporiumtianshanensesl-14(中國農(nóng)業(yè)菌種保藏中心accc32710)所產(chǎn)生的木聚糖酶ctxyn10a，其最適ph值為6.0-7.0，在ph5.0-8.0的范圍內(nèi)維持80％以上的酶活性；最適溫度為70℃，在60-75℃間均具有70％以上的酶活力；在0℃條件下還有10％酶活；且對多種木聚糖、葡聚糖、纖維素具有降解作用。這種性質(zhì)的中性高溫木聚糖酶還未曾有過報(bào)道。本發(fā)明克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，獲得了高溫木聚糖酶的菌物資源，提供了一種性質(zhì)優(yōu)良的、適合于在食品、造紙、能源工業(yè)中應(yīng)用新的中性高溫木聚糖酶ctxyn10a。本發(fā)明的木聚糖酶ctxyn10a最適ph為6.0-7.0，在ph5.0～8.0都有較高的酶活性；ph穩(wěn)定性好；比活力為461u/mg；具有寬泛的底物特異性。其中性高溫的特點(diǎn)，可降低木聚糖酶在工業(yè)生產(chǎn)上的能源成本。ph適應(yīng)范圍廣，可提高水產(chǎn)飼料消化能和代謝能，降低配方成本，減少環(huán)境污染。其寬泛的底物特異性可以提高谷物加工副產(chǎn)品的營養(yǎng)價(jià)值，提升飼料產(chǎn)品品質(zhì)。木聚糖酶ctxyn10a可應(yīng)用于釀酒工業(yè)，降低物料粘度，可以有利于淀粉酶作用于淀粉層，提高淀粉利用率，增加酒精的產(chǎn)率。還可以在常溫條件下，將造紙工業(yè)廢料及農(nóng)業(yè)廢棄物中的木聚糖可被轉(zhuǎn)化為木寡糖，而木寡糖可以被細(xì)菌、酵母及真菌轉(zhuǎn)化成有價(jià)值的燃料。因此，木聚糖酶ctxyn10a在能源工業(yè)中的應(yīng)用也顯示出其巨大的潛力。木聚糖酶ctxyn10a水解產(chǎn)物(木糖和低聚木糖)可應(yīng)用在食品行業(yè)，作為增稠劑、脂肪代替物、益生寡糖和抗凍食品添加劑；在制藥工業(yè)中木聚糖與其它物質(zhì)結(jié)合使用，可以延緩藥物成分的釋放。木聚糖酶及其水解產(chǎn)物還可以進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為液體燃料、溶劑和低熱量甜味劑。附圖說明圖1為重組菌gs115/ctxyn10a中表達(dá)的重組木聚糖酶ctxyn10a的sds-page分析，其中，泳道1為去糖基化的純化重組木聚糖酶；泳道2為純化重組木聚糖酶；泳道3為低分子量蛋白質(zhì)marker。圖2為重組木聚糖酶ctxyn10a的最適ph測定結(jié)果圖。圖3為重組木聚糖酶ctxyn10a的ph穩(wěn)定性測定結(jié)果圖。圖4為重組木聚糖酶ctxyn10a的最適溫度測定結(jié)果圖。圖5為重組木聚糖酶ctxyn10a的熱穩(wěn)定性測定結(jié)果圖。具體實(shí)施方式說明：下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中未作具體說明的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，均參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第三版)j.薩姆布魯克一書中所列的具體方法進(jìn)行，或者按照試劑盒和產(chǎn)品說明書進(jìn)行。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。試驗(yàn)材料和試劑：1、菌株及載體：下述實(shí)施例中所用天山枝孢菌cladosporiumtianshanensesl-14，保存于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)菌種保藏中心(北京市海淀區(qū)中關(guān)村南大街12號，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)菌種保藏中心，100081)，其保藏號為：accc32710，公眾可從該中心購買得到該菌株。畢赤酵母表達(dá)載體ppic9及菌株gs115購自于invitrogen公司。2、酶類及其它生化試劑：內(nèi)切酶購自takara公司，連接酶購自invitrogen公司。櫸木木聚糖購自sigma公司，其它都為國產(chǎn)試劑(均可從普通生化試劑公司購買得到)。3、培養(yǎng)基：(1)cladosporiumtianshanensesl-14培養(yǎng)基為馬鈴薯汁培養(yǎng)基：1000ml馬鈴薯汁，10g葡萄糖，25g瓊脂，ph5.0。(2)大腸桿菌培養(yǎng)基lb(1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％nacl,ph7.0)。(3)bmgy培養(yǎng)基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，1.34％ynb，0.00004％biotin，1％甘油(v/v)。(4)bmmy培養(yǎng)基：除以0.5％甲醇(v/v)代替甘油,其余成份均與bmgy相同，ph4.0。實(shí)施例1、中性高溫木聚糖酶ctxyn10a的基因組dna的克隆提取天山枝孢菌cladosporiumtianshanensesl-14基因組dna：將液體培養(yǎng)3天的菌絲體用無菌濾紙過濾放入研缽中，加入2ml提取液，研磨5min，然后將研磨液置于50ml離心管中，65℃水浴鍋裂解20min，每隔10min混勻一次，在4℃下10000rpm離心5min。取上清于酚/氯仿中抽提除去雜蛋白，再取上清加入等體積異丙醇，于室溫靜置5min后，4℃下10000rpm離心10min。棄上清，沉淀用70％的乙醇洗滌兩次，真空干燥，加入適量te溶解，置于-20℃?zhèn)溆?。根?jù)cladosporiumtianshanensesl-14基因組框架圖的序列分析，設(shè)計(jì)合成特異引物ctxyn10a-f/ctxyn10a-r：ctxyn10a-f：5'-atgcgtttcactgaggtcttcactgctc-3'；ctxyn10a-r：5'-tcacttcttgccacccttgatgccc-3'；以天山枝孢菌cladosporiumtianshanensesl-14總dna為模板，以上述ctxyn10a-f/ctxyn10a-r為特異引物，進(jìn)行pcr擴(kuò)增。pcr反應(yīng)參數(shù)為：94℃變性5min；然后94℃變性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸60sec，30個(gè)循環(huán)后72℃保溫10min。上述pcr反應(yīng)得到一約1200bp的核酸片段，將該片段回收后與peasy-t3載體相連送三博生物技術(shù)有限公司測序。測序結(jié)果表明，上述pcr擴(kuò)增得到的核酸片段的序列具有序列表中seqid№：1所示的核苷酸序列，共1202bp。將該具有序列表中seqid№：1所示的核苷酸序列的核酸片段命名為ctxyn10a。實(shí)施例2、編碼成熟中性高溫木聚糖酶ctxyn10a基因的獲得提取天山枝孢菌cladosporiumtianshanensesl-14的總rna，利用反轉(zhuǎn)錄酶得到cdna的一條鏈，然后以引物ctxyn10a-f/ctxyn10a-r擴(kuò)增該單鏈cdna,擴(kuò)增得到產(chǎn)物回收后送三博生物技術(shù)有限公司測序。ctxyn10a-f：5'-ggggaattccacccttcggctcccaaggac-3'；ctxyn10a-r：5'-ggggcggccgctcacttcttgccacccttgatgcc-3'；通過比較實(shí)施例1所測的核酸片段的基因組序列和上述pcr擴(kuò)增產(chǎn)物測序結(jié)果后，發(fā)現(xiàn)該基因有2個(gè)內(nèi)含子，cdna長1059bp，具有序列表中seqid№：2的核苷酸序列，編碼序列表中seqid№：3所示的氨基酸序列和一個(gè)終止密碼子。具有序列表中seqid№：3所示的氨基酸序列的蛋白，共352個(gè)氨基酸殘基，n端18個(gè)氨基酸為預(yù)測的信號肽序列，具有序列表中seqid№：4所示的氨基酸序列。序列表中seqid№：1的第141位-199位核苷酸序列和第512位-595位核苷酸序列分別為59bp和84bp的內(nèi)含子序列上述pcr擴(kuò)增產(chǎn)物測序結(jié)果表明，上述pcr擴(kuò)增得到核酸片段包括ecori+noti雙酶切位點(diǎn)，上述兩個(gè)酶切位點(diǎn)中間為具有序列表中seqid№：2的第55位-1059位核苷酸序列的核酸片段。具有序列表中seqid№：2的第55位-1059位核苷酸序列的核酸片段為ctxyn10a基因編碼成熟蛋白部分的核酸片段，編碼序列表中seqid№：5所示的氨基酸序列；將ctxyn10a基因編碼成熟蛋白部分的核酸片段與genbank上的木聚糖酶基因序列進(jìn)行同源比較，最高一致性為74％，氨基酸序列最高一致性為72％，證明從天山枝孢菌cladosporiumtianshanensesl-14中分離克隆得到的編碼木聚糖酶的基因?yàn)樾禄颉?shí)施例3、中性高溫木聚糖酶ctxyn10a的制備將畢赤酵母表達(dá)載體ppic9進(jìn)行雙酶切(ecori+noti)，同時(shí)將上述實(shí)施例2制備得到的編碼成熟蛋白的核酸片段雙酶切(ecori+noti)，切出編碼成熟蛋白的基因片段與雙酶切后的表達(dá)載體ppic9連接。測序驗(yàn)證序列的正確性。所得重組質(zhì)粒中插入的外源基因的序列為seqid№：2第55-1059位核苷酸，將該重組質(zhì)粒命名為ppic-ctxyn10a。將上述重組質(zhì)粒ppic-ctxyn10a轉(zhuǎn)化畢赤酵母gs115；將陽性重組菌提取質(zhì)粒測序驗(yàn)證序列的正確性，將測序正確的含有重組質(zhì)粒ppic-ctxyn10a的重組畢赤酵母菌株命名為gs115/ctxyn10a。取重組菌gs115/ctxyn10a菌株，接種于300mlbmgy培養(yǎng)液中，30℃250rpm振蕩培養(yǎng)48h后，離心收集菌體。然后于100mlbmmy培養(yǎng)基重懸，30℃250rpm振蕩培養(yǎng)。誘導(dǎo)72h后，離心收集上清，純化蛋白，測定木聚糖酶ctxyn10a的活力。sds-page結(jié)果如圖1所示，圖1結(jié)果表明，木聚糖酶ctxyn10a在畢赤酵母重組菌gs115/ctxyn10a中得到了表達(dá)。所表達(dá)的木聚糖酶ctxyn10a經(jīng)過純化之后，其目標(biāo)蛋白質(zhì)的含量達(dá)到總蛋白的90％以上，達(dá)到電泳純。經(jīng)endo-h脫糖基化后，純化蛋白的分子量與理論值一致，為37.4kda。實(shí)施例4、中性高溫木聚糖酶ctxyn10a的酶活測定采用dns法測定上述實(shí)施例3制備得到的木聚糖酶ctxyn10a的活力，具體方法如下：在ph6.5，70℃條件下，1ml的反應(yīng)體系包括100μl適當(dāng)?shù)南♂屆敢海?00μl底物，反應(yīng)10min，加入1.5mldns終止反應(yīng)，沸水煮5min。冷卻后540nm測定od值。1個(gè)酶活單位(u)定義為在給定的條件下每分鐘釋放出1μmol還原糖的酶量。經(jīng)測定，實(shí)施例3制備得到的中性高溫木聚糖酶ctxyn10a的酶活為160u/ml。實(shí)施例5、中性高溫木聚糖酶ctxyn10a的性質(zhì)測定1、重組木聚糖酶ctxyn10a的最適ph和ph穩(wěn)定性的測定方法如下：將實(shí)施例3純化的重組木聚糖酶在不同的ph下進(jìn)行酶促反應(yīng)以測定其最適ph。將底物木聚糖用不同ph的0.1mol/l檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液溶解，30℃下進(jìn)行木聚糖酶活力測定。結(jié)果如圖2所示，木聚糖酶ctxyn10a的最適ph為6.0-7.0，在ph5.0～8.0的范圍內(nèi)，酶活性均維持在最大酶活性的80％以上。木聚糖酶于上述各種不同ph的緩沖液中37℃處理60min，再在ph6.5緩沖液體系中70℃下測定酶活性，以研究酶的ph耐性。結(jié)果如圖3所示，木聚糖酶ctxyn10a在ph4.0-12.0之間均很穩(wěn)定，在此ph范圍內(nèi)處理60min后剩余酶活性在80％以上，這說明此酶具有較好的ph穩(wěn)定性。2、木聚糖酶的最適溫度及熱穩(wěn)定性測定方法如下：木聚糖酶的最適溫度的測定為在檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液(ph6.5)緩沖液體系及不同溫度下進(jìn)行酶促反應(yīng)。耐溫性測定為木聚糖酶在不同溫度下處理不同時(shí)間，再在ph6.5、70℃下進(jìn)行酶活性測定。酶反應(yīng)最適溫度測定結(jié)果如圖4所示，木聚糖酶ctxyn10a的最適溫度為70℃，比活為461u/mg；50℃-75℃的高溫范圍內(nèi)具有較高活性；在60℃-75℃間均具有70％以上的酶活力；在0℃條件下還有10％酶活；酶的熱穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果如圖5(圖5中80℃所示結(jié)果為有底物反應(yīng)時(shí)間10分鐘；圖4中80℃、結(jié)果及表述在無底物80℃溫浴一定時(shí)間后測定酶活)所示，木聚糖酶ctxyn10a在60℃時(shí)穩(wěn)定性非常好，70℃下保溫60min，完全失去酶活。此外，還測定了木聚糖酶ctxyn10a在90℃和ph9.0時(shí)的酶活，結(jié)果顯示其保持了20％以上的酶活。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，木聚糖酶ctxyn10a為中性高溫酶，具有中性高溫的特點(diǎn)。3、木聚糖酶的km值測定方法如下：用不同濃度的櫸木木聚糖為底物，在檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液(ph6.5)緩沖液體系中，70℃下測定酶活性，計(jì)算出其在70℃下的km、vmax、kcat和kcat/km值。經(jīng)測定，此木聚糖酶ctxyn10a在70℃下以櫸木木聚糖為底物的km值為0.64mg/ml，最大反應(yīng)速度vmax為450μmol/min·mg，kcat值為281/s和kcat/km值為434ml/mg·s.，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明ctxyn10a與底物的親和力較強(qiáng)，在高溫條件下還具有較高的催化效率，其酶學(xué)性質(zhì)大大優(yōu)于序列相似的真菌木聚糖酶foxyn10a(最適ph7.0,最適溫度45℃，km0.8mg/ml,vmax1.22μmol/min·mg；christakopoulosetal.carbohydrateresearch,1997,302:191-195)4、不同金屬離子化學(xué)試劑對木聚糖酶ctxyn10a的酶活的影響測定如下：在酶促反應(yīng)體系中加入不同濃度的不同的金屬離子及化學(xué)試劑，研究各種化學(xué)試劑對木聚糖酶ctxyn10a活力的影響，各種物質(zhì)終濃度為5mmol/l。在70℃、ph6.5條件下測定酶活性。結(jié)果如表1所示，大多數(shù)離子和化學(xué)試劑在濃度為5mmol時(shí)對重組木聚糖酶ctxyn10a的活力沒有明顯影響,sds有部分抑制作用。mn2+在5mmol時(shí)能使重組酶活力增加到原來的1.32倍。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明ctxyn10a具有較好的化學(xué)抗性，適當(dāng)?shù)奶砑由倭縨n2+還可以增加酶活，從而降低應(yīng)用成本。5、木聚糖酶ctxyn10a的底物特異性在酶促反應(yīng)體系中加入不同的底物，研究木聚糖酶ctxyn10a的底物特異性。在70℃、ph6.5條件下測定酶活性。結(jié)果如表2所示，木聚糖酶ctxyn10a同時(shí)具有木聚糖酶、纖維素酶和葡聚糖酶的活性。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，木聚糖酶ctxyn10a具有寬泛的底物特異性，除了作用于木聚糖外，還可催化纖維素、葡聚糖等多種底物的降解，因此在工業(yè)領(lǐng)域中具有更廣泛的應(yīng)用前景。表1表2底物相對酶活(％)櫸木木聚糖(1％)100.0可溶小麥阿拉伯木聚糖(1％)130.6樺木木聚糖(1％)88.1不可溶小麥阿拉伯木聚糖(1％)49.0cmc(1％)31.7地衣多糖(1％)24.6大麥葡聚糖(0.5％)8.96、木聚糖酶ctxyn10a降解櫸木木聚糖產(chǎn)物的分析如下：在500μl1％的木聚糖中加入100μl純化的酶液，最適溫度下保溫12h。用無水乙醇將酶蛋白沉淀，上清液用2500色譜儀，利用高效陰離子交換色譜-脈沖安培(hpaec-pad)檢測方法，進(jìn)行產(chǎn)物中糖種類的分析。分析結(jié)果表明：木聚糖酶ctxyn10a降解櫸木木聚糖的產(chǎn)物主要是木二糖和木一糖。產(chǎn)物中木二糖含量為68％，木一糖含量為24％。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，木聚糖酶ctxyn10a可用于生產(chǎn)木二糖和木一糖等相關(guān)產(chǎn)品。序列表<110>中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料所<120>一種中性高溫木聚糖酶及其編碼基因和其應(yīng)用<160>5<210>1<211>1202<212>dna<213>天山枝孢菌cladosporiumtianshanensesl-14<400>1atgcgtttcactgaggtcttcactgctcttacgctggccgcttcggcggttgcccaccct60tcggctcccaaggacaagaagggtttggccactgctatgaaggctcgtggaagggagttt120atcggcacagcccttacactgtacgtggttgattgatctctcaaggatttcgactttttt180gctgacttcaagattccagtcgcggcaacgagaccgaagaagccattgctcgcaacaacg240ccgacttcaactctttcacgccagagaatgcaatgaagtgggaggccattgagcctaacc300gcaacaacttcaccttcagcgacgccgaccgctaccgcgactgggccaaggccaataaga360aggaaatccactgccacactcttgtctggcactctcagctccctccttgggtcgctgctg420gcaactacgacaacaagaccctgatagggatcatggaaaaccacatcaagaacgtggctg480gccgctacaaggacgtgtgcacccgctgggagtaagtggacccgacttttttttctcgac540tttcgacgaacttttttccggacttgcaacgaaccatcaactaacaccataacagcgtag600tcaacgaggcgttggaggaggacggtacctaccgctcctcacccttctacgacaccatcg660gcgaagctttcatcccaatcgccttcaaattcgccaagaagtacagccccaagtccgagc720tcttctacaacgactacaacctcgagtacaatggcaacaagaccctcggcgccaagcgca780tcgtcaagctggtccagagctacggcgtgcacatcgacggcgtgggtctgcaagcccact840tggcccaggaagtcaccccgaccgccggcgccctgcccgaccaagccactctcgagaccg900ttctcagaggcttcacttccctggacgtcgatgttgtttacaccgagattgatatccgca960tgaacacccccagcaccccggccaagctcaagacacaggccaaggctttcgagactgttg1020ctcgcagctgtcttgctgtcaagaggtgcattggaatgaccgtttggggtatttcagacg1080ctttctcgtggatccctggtgtattccctggtgagggcgctgcgcttctttgggacgaga1140accttaagaagaagccggcttacgatggcttctacaagggcatcaagggtggcaagaagt1200ga1202<210>2<211>1059<212>dna<213>天山枝孢菌cladosporiumtianshanensesl-14<400>2atgcgtttcactgaggtcttcactgctcttacgctggccgcttcggcggttgcccaccct60tcggctcccaaggacaagaagggtttggccactgctatgaaggctcgtggaagggagttt120atcggcacagcccttacacttcgcggcaacgagaccgaagaagccattgctcgcaacaac180gccgacttcaactctttcacgccagagaatgcaatgaagtgggaggccattgagcctaac240cgcaacaacttcaccttcagcgacgccgaccgctaccgcgactgggccaaggccaataag300aaggaaatccactgccacactcttgtctggcactctcagctccctccttgggtcgctgct360ggcaactacgacaacaagaccctgatagggatcatggaaaaccacatcaagaacgtggct420ggccgctacaaggacgtgtgcacccgctgggacgtagtcaacgaggcgttggaggaggac480ggtacctaccgctcctcacccttctacgacaccatcggcgaagctttcatcccaatcgcc540ttcaaattcgccaagaagtacagccccaagtccgagctcttctacaacgactacaacctc600gagtacaatggcaacaagaccctcggcgccaagcgcatcgtcaagctggtccagagctac660ggcgtgcacatcgacggcgtgggtctgcaagcccacttggcccaggaagtcaccccgacc720gccggcgccctgcccgaccaagccactctcgagaccgttctcagaggcttcacttccctg780gacgtcgatgttgtttacaccgagattgatatccgcatgaacacccccagcaccccggcc840aagctcaagacacaggccaaggctttcgagactgttgctcgcagctgtcttgctgtcaag900aggtgcattggaatgaccgtttggggtatttcagacgctttctcgtggatccctggtgta960ttccctggtgagggcgctgcgcttctttgggacgagaaccttaagaagaagccggcttac1020gatggcttctacaagggcatcaagggtggcaagaagtga1059<210>3<211>352<212>prt<213>天山枝孢菌cladosporiumtianshanensesl-14<400>3metargphethrgluvalphethralaleuthrleualaalaserala151015valalahisproseralaprolysasplyslysglyleualathrala202530metlysalaargglyargglupheileglythralaleuthrleuarg354045glyasngluthrgluglualailealaargasnasnalaasppheasn505560serphethrprogluasnalametlystrpglualailegluproasn65707580argasnasnphethrpheseraspalaaspargtyrargasptrpala859095lysalaasnlyslysgluilehiscyshisthrleuvaltrphisser100105110glnleuproprotrpvalalaalaglyasntyraspasnlysthrleu115120125ileglyilemetgluasnhisilelysasnvalalaglyargtyrlys130135140aspvalcysthrargtrpaspvalvalasnglualaleuglugluasp145150155160glythrtyrargserserprophetyraspthrileglyglualaphe165170175ileproilealaphelysphealalyslystyrserprolysserglu180185190leuphetyrasnasptyrasnleuglutyrasnglyasnlysthrleu195200205glyalalysargilevallysleuvalglnsertyrglyvalhisile210215220aspglyvalglyleuglnalahisleualaglngluvalthrprothr225230235240alaglyalaleuproaspglnalathrleugluthrvalleuarggly245250255phethrserleuaspvalaspvalvaltyrthrgluileaspilearg260265270metasnthrproserthrproalalysleulysthrglnalalysala275280285phegluthrvalalaargsercysleualavallysargcysilegly290295300metthrvaltrpglyileseraspalaphesertrpileproglyval305310315320pheproglygluglyalaalaleuleutrpaspgluasnleulyslys325330335lysproalatyraspglyphetyrlysglyilelysglyglylyslys340345350<210>4<211>18<212>prt<213>天山枝孢菌cladosporiumtianshanensesl-14<400>4metargphethrgluvalphethralaleuthrleualaalaserala151015valala<210>5<211>334<212>prt<213>天山枝孢菌cladosporiumtianshanensesl-14<400>5hisproseralaprolysasplyslysglyleualathralametlys151015alaargglyargglupheileglythralaleuthrleuargglyasn202530gluthrgluglualailealaargasnasnalaasppheasnserphe354045thrprogluasnalametlystrpglualailegluproasnargasn505560asnphethrpheseraspalaaspargtyrargasptrpalalysala65707580asnlyslysgluilehiscyshisthrleuvaltrphisserglnleu859095proprotrpvalalaalaglyasntyraspasnlysthrleuilegly100105110ilemetgluasnhisilelysasnvalalaglyargtyrlysaspval115120125cysthrargtrpaspvalvalasnglualaleuglugluaspglythr130135140tyrargserserprophetyraspthrileglyglualapheilepro145150155160ilealaphelysphealalyslystyrserprolyssergluleuphe165170175tyrasnasptyrasnleuglutyrasnglyasnlysthrleuglyala180185190lysargilevallysleuvalglnsertyrglyvalhisileaspgly195200205valglyleuglnalahisleualaglngluvalthrprothralagly210215220alaleuproaspglnalathrleugluthrvalleuargglyphethr225230235240serleuaspvalaspvalvaltyrthrgluileaspileargmetasn245250255thrproserthrproalalysleulysthrglnalalysalapheglu260265270thrvalalaargsercysleualavallysargcysileglymetthr275280285valtrpglyileseraspalaphesertrpileproglyvalphepro290295300glygluglyalaalaleuleutrpaspgluasnleulyslyslyspro305310315320alatyraspglyphetyrlysglyilelysglyglylyslys325330當(dāng)前第1頁12