本發(fā)明屬于煙草制備技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種微膠囊果膠酶及其在煙草薄片加工過(guò)程中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
造紙法煙草薄片（paper-processreconstitutedtobacco）是一種煙草資源再生利用的產(chǎn)品。它是利用一些煙草廢棄料、邊角料，如煙梗、煙葉碎片、煙末等為原料，經(jīng)過(guò)浸提、濃縮、分離、打漿、磨漿、抄造、烘干、加香工藝過(guò)程，制成煙葉薄片，用作卷煙填充物。造紙法煙草薄片，不僅在改善煙葉產(chǎn)品結(jié)構(gòu)強(qiáng)度、燃燒性能及降低卷煙的煙氣煙堿和焦油量等方面具有優(yōu)勢(shì)，同時(shí)還能降低煙葉單耗，節(jié)約生產(chǎn)成本，可以說(shuō)是煙草工業(yè)近年最重要的成果之一。而近年來(lái)，生物技術(shù)與造紙法煙草薄片技術(shù)在生產(chǎn)中的結(jié)合應(yīng)用，不僅發(fā)揮了造紙法煙草薄片的工藝優(yōu)勢(shì)，而且利用生物技術(shù)有選擇地改變煙草化學(xué)成分，明顯改善了煙草薄片的品質(zhì)。
研究表明，煙草原料中的纖維素、木質(zhì)素、果膠和蛋白質(zhì)在高溫下均會(huì)產(chǎn)生芳烴類化合物。其中果膠是一種膠體性物質(zhì)，沉積在初生細(xì)胞壁和胞間層，并與纖維素、半纖維素、木質(zhì)素以及一些蛋白質(zhì)相互交聯(lián)。果膠在熱解過(guò)程中主要生成甲醇等有害物質(zhì)。果膠的去除不僅能夠減少這類物質(zhì)的生成，而且還能夠改變煙草細(xì)胞結(jié)構(gòu)，讓細(xì)胞變的更松散透氣，有利于提高煙草燃燒能力，減少熱解的發(fā)生。
現(xiàn)有技術(shù)中，針對(duì)煙草薄片中果膠類物質(zhì)的降解主要是采用傳統(tǒng)的果膠酶進(jìn)行的。但是由于煙草薄片中果膠結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性和多樣性，而現(xiàn)有技術(shù)中的果膠酶普遍存在對(duì)于煙草薄片中果膠降解針對(duì)性不強(qiáng)、降解不夠充分、降解過(guò)程難以控制的缺陷，因而急需探討新的果膠酶及其在煙草薄片加工中的應(yīng)用。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明目的在于提供一種利用特定菌株發(fā)酵制備的微膠囊果膠酶，利用該微膠囊果膠酶有針對(duì)性用于煙草薄片加工過(guò)程中的煙草薄片濃縮液，實(shí)現(xiàn)對(duì)濃縮液中果膠成分的降解，從而改善煙草品質(zhì)。
本發(fā)明的技術(shù)方案具體如下所述。
一種微膠囊果膠酶，采用如下步驟制備獲得：
（1）菌種活化，從保藏培養(yǎng)基上挑取發(fā)酵菌株，接種到活化培養(yǎng)基中28~32℃活化培養(yǎng)2~3d左右；
所述發(fā)酵菌株具體為中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心(cicc)保藏的保藏號(hào)為cicc41120的亮白曲霉（aspergilluscandidus）；該菌株為可公開(kāi)獲得菌株；
所述活化培養(yǎng)基為pda培養(yǎng)基；從保藏培養(yǎng)基挑取菌株后接種活化培養(yǎng)基時(shí)具體可采用劃線法接種；
（2）制備種子液，將步驟（1）中活化后的菌種接種到種子培養(yǎng)基中，28~30℃、120~180r/min搖床培養(yǎng)36~48h左右（優(yōu)選25℃、160r/min搖床培養(yǎng)48h左右），制備種子液；
所述種子培養(yǎng)基配方為：果膠3g/l，酵母粉10g/l，mgso4?7h2o0.5g，nacl0.5g，k2hpo41.5g，ph=6.0～6.5，具體裝液量可設(shè)計(jì)為：100/250ml錐形瓶；
（3）發(fā)酵培養(yǎng)，將步驟（2）中所制備的種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，28~30℃、120~180r/min搖床培養(yǎng)3~16h（優(yōu)選28℃、160r/min搖床培養(yǎng)12h左右）以進(jìn)一步發(fā)酵培養(yǎng)；
將種子液接種發(fā)酵培養(yǎng)基時(shí)，接種量具體可按4%體積分?jǐn)?shù)比例進(jìn)行接種；
所述發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：果膠23.18~56.82g/l、酵母粉0.98~6.02g/l，ph=5；優(yōu)選配方為：果膠50g/l、酵母粉2.0g/l，ph=5；
（4）制備粗酶液，將步驟（3）中發(fā)酵液經(jīng)抽濾濾去菌體，再經(jīng)超濾濃縮即可獲得粗酶液，測(cè)定酶活；
（5）制備微膠囊酶，將步驟（4）中制備的粗酶液采用噴霧冷凝法將其制備成微膠囊，具體制備參數(shù)為：海藻酸鈉質(zhì)量濃度2%、氯化鈣溶液質(zhì)量濃度2%、乳化劑吐溫60質(zhì)量濃度1%；所制備微膠囊果膠酶規(guī)格為：粒徑1000μm、孔徑200nm、包埋率50%。
所述亮白曲霉發(fā)酵制備的微膠囊果膠酶在煙草中的應(yīng)用，用于煙草薄片加工過(guò)程，用于降解煙草薄片原料所制備濃縮液中果膠成分。
具體使用時(shí)，以上述步驟（5）所制備微膠囊果膠酶直接應(yīng)用為例，按濃縮液：微膠囊果膠酶=25ml：1~5g的比例，將濃縮液原料與微膠囊果膠酶混合均勻，40~50℃、酶解3~9h；
優(yōu)選處理?xiàng)l件為，濃縮液：微膠囊果膠酶=25ml：1g的比例，50℃、酶解6h。
一種利用微膠囊果膠酶針對(duì)煙草薄片中果膠成分的處理方法，具體包括如下步驟：
（1）制備微膠囊果膠酶，按照上述步驟（1）至步驟（5）制備微膠囊果膠酶?jìng)溆茫?/p>
（2）按現(xiàn)有工藝制備煙草薄片，在煙草薄片原料制備的濃縮液中加入微膠囊果膠酶，具體使用時(shí)，按濃縮液：微膠囊果膠酶=25ml：1~5g的比例，將濃縮液原料與微膠囊果膠酶混合均勻，40~50℃、酶解3~9h。
本發(fā)明的總體技術(shù)路線是：將特定菌種首先混合發(fā)酵，篩選優(yōu)化最佳發(fā)酵條件，獲得最高果膠酶酶活的粗酶液，然后將粗酶液制備成微膠囊，直接用于濃縮液處理以降低其果膠酶含量，通過(guò)優(yōu)化處理工藝，獲得最佳降解效果，從而改善煙草品質(zhì)。
初步試驗(yàn)表明，本發(fā)明采用特定菌株發(fā)酵所得粗酶液制備的微膠囊的酶活最高可達(dá)2540.35u/ml，具有較好的應(yīng)用潛力。進(jìn)一步用于濃縮液處理后，可將濃縮液中果膠含量由2.40%降低到1.92%，降解率達(dá)到20.00%。將處理后濃縮液用于卷煙后，進(jìn)一步的感官抽吸評(píng)價(jià)表明，添加有酶解后煙草薄片的卷煙樣品相較于未處理的樣品，卷煙煙氣更加細(xì)膩，甜潤(rùn)感有所增強(qiáng)且刺激性減輕，香氣量增加，雜味減少，勁頭足，且燃燒性更好，從而較好的改善了煙草的吸食品質(zhì)。
總體而言，本申請(qǐng)所制備微膠囊果膠酶與現(xiàn)有煙草薄片加工工藝結(jié)合較為緊密，可直接應(yīng)用于煙草薄片原料加工后濃縮液中，適應(yīng)性較好，具有一定地推廣應(yīng)用價(jià)值。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的解釋說(shuō)明。在介紹具體實(shí)施例前，就下述實(shí)施例中果膠含量測(cè)定、果膠降解率的計(jì)算方法簡(jiǎn)要介紹如下。
果膠含量測(cè)定
下述實(shí)施例中對(duì)于濃縮液中的果膠含量采用咔唑比色法測(cè)定，具體測(cè)定步驟如下：
1、樣品預(yù)處理，取待測(cè)樣品10ml于250ml錐形瓶中，加入150ml加熱至沸騰的0.05mol/l的hcl溶液，裝上冷凝器，于90℃水浴中加熱回流1h，冷卻后把濾液移入250ml容量瓶中，加入2mol/l的naoh中和至ph=4，搖勻，收集濾液即得總果膠提取液，備用；
2、以半乳糖醛酸為標(biāo)準(zhǔn)品，咔唑比色法測(cè)定果膠含量，取步驟a中所得總果膠提取液1ml于含有6ml濃硫酸的試管中，搖勻；
85℃水浴加熱15min；冷卻，加入0.15%咔唑無(wú)水乙醇溶液0.3ml，搖勻，暗置30min；530nm下測(cè)吸光度；
3、根據(jù)咔唑比色法標(biāo)準(zhǔn)曲線和公式，求得待測(cè)液果膠含量；
所述公式為：果膠（%）=c×v×k×100/(w×106)；
其中，c：對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線求得的果膠提取稀釋液的果膠含量（μg/ml)，v：果膠提取液原液體積（ml），k：果膠提取液稀釋倍數(shù)，w：樣品質(zhì)量（g），106：質(zhì)量單位換算系數(shù)；
所述咔唑比色法標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制方法為：
首先準(zhǔn)確稱取0.1000g半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)品于燒杯中，用少量蒸餾水溶解后轉(zhuǎn)移至100ml容量瓶中，用ph為3的鹽酸定容；
然后分別取0、1、2、3、4、5、6、7ml于8個(gè)100容量瓶中，用ph為3的hcl定容，得到濃度為0、10、20、30、40、50、60、70μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液；
最后以上述方法測(cè)定，然后繪制咔唑比色法的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
果膠降解率計(jì)算
下述實(shí)施例中果膠降解率按以下公式計(jì)算：
ei=[（c0－ci）/c0]×100%；
其中，ei：果膠的降解率，c0：空白對(duì)照樣中果膠水解生成的半乳糖醛酸的量；ci：酶處理的煙草薄片中果膠水解生成的半乳糖醛酸的量；空白對(duì)照樣和酶處理的煙草薄片中果膠含量測(cè)定均按上述咔唑比色法進(jìn)行測(cè)定。
酶活力檢測(cè)方法：
參照miller(1959)方法，取0.4ml的l%果膠溶液于試管中，加入1.0mlph=5的0.04mol/lna2hpo4-0.02mol/l檸檬酸緩沖液，45℃水浴平衡5min；
加入0.1ml適當(dāng)稀釋的酶液，45℃反應(yīng)30min（空白對(duì)照組以煮沸失活的酶液代替），加入3.0mldns溶液終止反應(yīng)，沸水浴5min，冷卻，定容至15ml，于分光光度計(jì)540nm波長(zhǎng)下測(cè)吸光度，得到反應(yīng)體系中半乳糖醛酸的量；
酶活力單位：1ml酶液或1g酶在45℃、ph5.0的條件下，每min分解底物產(chǎn)生lμg半乳糖醛酸的酶量定義為1單位聚半乳糖醛酸酶(pg)酶活；以u(píng)/ml表示；
酶活力計(jì)算公式：u=(c實(shí)驗(yàn)-c對(duì)照)*n*1000*(v總/v酶)/t；
n—酶液稀釋倍數(shù)，v總—反應(yīng)總體積，v酶—酶液體積，t—反應(yīng)時(shí)間（min）；
dns法標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：
配置1mg/ml的半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)溶液；取1mg/ml半乳糖醛酸溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml于試管中，補(bǔ)水至1ml，加dns試劑3ml，混合后于沸水中煮7min，冷卻后定容至15ml，于分光光度計(jì)540nm波長(zhǎng)下測(cè)吸光度；以吸光度為縱坐標(biāo)，半乳糖醛酸量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
實(shí)施例1
本實(shí)施例所提供的利用亮白曲霉發(fā)酵所制備的微膠囊果膠酶，通過(guò)如下生產(chǎn)步驟制備獲得。
（1）菌種活化，從保藏培養(yǎng)基上挑取發(fā)酵菌株，接種到活化培養(yǎng)基中30℃活化培養(yǎng)2d左右；
所述發(fā)酵菌株具體為中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心(cicc)保藏的保藏號(hào)為cicc41120的亮白曲霉（aspergilluscandidus）；本實(shí)施例中所用菌株從保藏單位購(gòu)買(mǎi)獲得；
所述活化培養(yǎng)基為pda培養(yǎng)基；從保藏培養(yǎng)基挑取菌株后接種活化培養(yǎng)基時(shí)具體采用劃線法接種；
所述pda培養(yǎng)基按常規(guī)方法制備，具體為：馬鈴薯提取液1.0l，葡萄糖20.0g，瓊脂15.0g，ph自然；
所述馬鈴薯提取液制備方法為：取去皮馬鈴薯200g，切成小塊，加水1.0l煮沸30min，濾去馬鈴薯塊，將濾液補(bǔ)足至1.0l，121℃滅菌即可。
（2）制備種子液，將步驟（1）中活化后的菌種接種到種子培養(yǎng)基中，27℃、160r/min搖床培養(yǎng)48h，制備種子液；
所述種子培養(yǎng)基配方為：果膠3g/l，酵母粉10g/l，mgso4?7h2o0.5g，nacl0.5g，k2hpo41.5g，ph=6.0，具體裝液量為：100/250ml錐形瓶。
從活化培養(yǎng)基中挑取菌株時(shí)，具體按如下方法進(jìn)行：
用打孔器在活化培養(yǎng)基平板上靠近菌株生長(zhǎng)邊緣的位置取兩塊0.5cm2的、長(zhǎng)滿新生菌絲的接種塊，再接種于種子培養(yǎng)基中；
還需解釋的是，在搖床發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束后，可加入滅菌的磁珠和適量的玻璃珠，使用磁力攪拌器攪拌1h左右，以使將培養(yǎng)物打碎，便于作為種子液接種用于進(jìn)一步發(fā)酵培養(yǎng)擴(kuò)增使用。
（3）發(fā)酵培養(yǎng)，將步驟（2）中所制備的種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，27℃、160r/min搖床培養(yǎng)10h以進(jìn)一步發(fā)酵培養(yǎng)；
將種子液接種發(fā)酵培養(yǎng)基時(shí)，接種量具體按4%體積分?jǐn)?shù)比例進(jìn)行接種；
所述發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：果膠23.18~56.82g/l、酵母粉0.98~6.02g/l，ph=5。
（4）制備粗酶液，將步驟（3）中發(fā)酵液經(jīng)抽濾濾去菌體，再經(jīng)超濾濃縮即可獲得粗酶液，測(cè)定酶活后即可作為果膠酶進(jìn)行應(yīng)用；
對(duì)步驟（3）中培養(yǎng)條件進(jìn)一步優(yōu)化后，在發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：果膠50g/l、酵母粉2.0g/l時(shí)，27℃、160r/min搖床培養(yǎng)10h后，所制備粗酶液酶活最高，此時(shí)檢測(cè)結(jié)果為2540.35u/ml。
（5）制備微膠囊酶，將步驟（4）中所得的粗酶液用噴霧冷凝法制備成微膠囊酶，酶活762.11u/g。
實(shí)施例2
將實(shí)施例1所制備粗酶液用于降解煙草薄片原料中果膠，所述煙草薄片原料，具體使用方法為：
將實(shí)施例1中所制備微膠囊果膠酶（酶活為762.11u/ml，理論而言，實(shí)施例1中所制備任意酶活的微膠囊果膠酶均可用于降解果膠應(yīng)用，但為確定較好降解條件及對(duì)煙草實(shí)際改善效果，因而僅以實(shí)施例1所制備的酶活為2540.35u/ml的粗酶液所制備微膠囊果膠酶為例進(jìn)行實(shí)驗(yàn)）進(jìn)行直接應(yīng)用，然后根據(jù)不同物料配比（煙草薄片濃縮液體積(ml)與微膠囊酶（g）之比）設(shè)計(jì)，將微膠囊果膠酶均勻施于50ml濃縮液中，40℃~50℃條件下，酶解3~9h；
酶解結(jié)束后，測(cè)定處理后樣品中的果膠含量。
同樣操作條件下，以未包埋果膠酶的微膠囊（未接種菌株，相當(dāng)于僅包含培養(yǎng)基）作為對(duì)照組，最終計(jì)算果膠降解率。
實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，為獲得最佳的降解率，發(fā)明人采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的方法，選用l9(33)正交表對(duì)果膠降解條件（微膠囊果膠酶加入質(zhì)量（a）、酶解溫度（b）、酶解時(shí)間（c））進(jìn)行了優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)。
實(shí)驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)如下：
具體酶解處理結(jié)果如下表所示：
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，加入微膠囊2g、反應(yīng)溫度50℃、處理時(shí)間6小時(shí)，在此條件下濃縮液中果膠降解率達(dá)到最大，為20.00%。
為進(jìn)一步檢測(cè)酶解處理后濃縮液對(duì)于煙草吸食效果的改進(jìn)程度，以上述最佳酶解處理?xiàng)l件處理后濃縮液為例，發(fā)明人對(duì)其進(jìn)行了實(shí)際卷煙抽吸實(shí)驗(yàn)，相關(guān)實(shí)驗(yàn)過(guò)程簡(jiǎn)要介紹如下。
將最佳酶解條件處理后濃縮液涂布到煙草薄片在80℃條件下進(jìn)行適當(dāng)烘干（至濕度65%）后，切絲，然后置于恒溫恒濕箱內(nèi)平衡（相對(duì)濕度(60±5)%，溫度(22±2)℃）48h；
按煙絲重量15%（即稱取0.12g樣品）與平衡后85%的云南曲靖c3f煙絲均勻混合后按現(xiàn)有技術(shù)制備抽吸用卷煙，此即為試驗(yàn)組卷煙。
相同條件及相同方法下采用加入未包埋酶的微膠囊的濃縮液所制備的卷煙記為對(duì)照組
將各組卷煙樣品（每支煙只總重0.80±0.01g）在溫度(22±2)℃、相對(duì)濕度(60±5)%的恒溫恒濕箱中平衡24h后，依據(jù)國(guó)家現(xiàn)行成品煙評(píng)析標(biāo)準(zhǔn)gb5606.4-2005對(duì)卷煙進(jìn)行質(zhì)量評(píng)吸鑒定和評(píng)價(jià)。
具體評(píng)價(jià)結(jié)果如下表所示：
從上述評(píng)價(jià)結(jié)果可以看出，酶解處理后的煙草薄片添加與卷煙后，可使卷煙的香氣更加細(xì)膩，煙氣透發(fā)性更好，同時(shí)能夠增加甜潤(rùn)感且減輕刺激性，口感發(fā)澀程度減小，余味純凈舒適，勁頭足，且燃燒性更好，卷煙的吸食品質(zhì)得到了較好改善。