基因治療載體和胞嘧啶脫氨酶的制作方法
【專利說明】
[0001] 本申請是申請日為2009年9月26日，發(fā)明名稱為"基因治療載體和胞嘧啶 脫氨酶"、PCT國際專利申請PCT/US2009/058510進(jìn)入中國國家階段的中國專利申請?zhí)?200980147509. 6的分案申請。
[0002] 與相關(guān)申請的交叉引用
[0003] 本申請要求于2008年9月26提出的美國臨時申請系列號61/100, 666、于2008年 12月8日提出的美國臨時申請系列號61/120,618和于2009年6月13日提出的美國臨時 申請系列號61/186, 823的優(yōu)先權(quán)，它們的公開內(nèi)容通過引用并入本文。
技術(shù)領(lǐng)域
[0004] 本公開涉及修飾的胞嘧啶脫氨酶（⑶）。本公開還涉及表達(dá)此類修飾⑶的細(xì)胞和 使用此類修飾CD治療疾病和病癥的方法。
【背景技術(shù)】
[0005] 酵母或細(xì)菌胞嘧啶脫氨酶將無毒性的抗生素前體藥物5-FC轉(zhuǎn)變成細(xì)胞毒性的化 學(xué)治療劑5-氟尿嘧啶（5-FU)。尚不知曉人（一般而言，哺乳動物）具有編碼具有顯著胞嘧 啶脫氨酶活性的酶的天然存在基因。酵母和細(xì)菌胞嘧啶脫氨酶在使用基因遞送和病毒載體 用于遞送酶、然后用5-FC治療的癌癥治療中得到認(rèn)可，其中5-FC然后被酶轉(zhuǎn)變成細(xì)胞毒性 藥物（Miller等，CanRes62:773-780 2002;Kievit等，CanRes59:1417-1421 1999)〇

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本文提供將5-FC轉(zhuǎn)變成5-FU的多肽。還提供編碼此類多肽的核酸分子、表達(dá)此 類多肽的細(xì)胞、包含此類多核苷酸和多肽的載體以及適宜地使用此類多肽合成5-FU或其 衍生物的方法。因此，在多個實施方案中，提供了包含具有SEQIDN0 :2所示序列的胞嘧啶 脫氨酶的分離的或重組的多肽。在其它實施方案中，多肽包含具有選自A23L、V108I、I140L 及其任何組合的突變的SEQIDNO:2。在又一實施方案中，多肽包含SEQIDNO:4中所示 序列并且包括除殘基：（a) 23、108和140之外的可達(dá)50、25、10或5個保守氨基酸取代。通 常，本文提供的多肽表現(xiàn)出用于將5-FC轉(zhuǎn)變成5-FU的胞嘧啶脫氨酶活性。
[0007] 本公開還提供包含與SEQIDN0 :4至少80%、90%、95%、98%或99%相同的序列 的多肽，其中多肽在第23位具有亮氨酸，在第108位具有異亮氨酸并且在第140位具有亮 氨酸，并且其中多肽具有胞嘧啶脫氨酶活性。在又一實施方案中，多肽包含SEQIDN0 :4中 所示序列。
[0008] 本公開還提供包含可操作連接至尿嘧啶磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶（UPRT)或乳清酸磷酸 核糖基轉(zhuǎn)移酶（0PRT)的任何一種前述多肽的融合構(gòu)建體。在一個實施方案中，融合構(gòu)建 體包含連接至具有UPRT或0PRT活性的第二多肽的第一多肽，所述第一多肽包含具有選自 A23L、V108I、I140L及其任何組合的突變的SEQIDN0:2。在又一實施方案中，融合構(gòu)建 體包含具有SEQIDN0 :4中所示序列的第一多肽并且包括除殘基23、108和140之外可達(dá) 50、25、10或5個保守氨基酸取代，其中第一多肽連接至具有UPRT或OPRT活性的第二多肽。 本公開還提供融合構(gòu)建體，其包含具有胞嘧啶脫氨酶活性并且含有與SEQIDNO:4至少 80%、90 %、95 %、98 %或99%相同的序列的第一多肽，其中該多肽在第23位具有亮氨酸， 在第108位具有異亮氨酸并且在第140位具有亮氨酸，并且其中第一多肽連接至包含UPRT 或0PRT活性的第二多肽。在一個實施方案中，具有UPRT或0PRT活性的多肽包含分別在 SEQIDNO:8和10中所示序列或其變體。在又一實施方案中，包含胞嘧啶脫氨酶活性的第 一多肽連接至具有UPRT或0PRT活性的多肽，其中多肽通過肽連接體分開。在另一實施方 案中，融合構(gòu)建體包含選自SEQIDNO:12、14、16或18的序列。
[0009] 本公開還提供編碼任何前述多肽的多核苷酸。例如，本公開提供多核苷酸，所述 多核苷酸編碼包含具有選自A23L、V108I、I140L及其任何組合的突變的SEQIDN0:2的多 肽。在又一實施方案中，多核苷酸編碼包含SEQIDNO:4所示序列的多肽并且包括除殘基： (a) 23、108和140外可達(dá)50、25、10或5個保守氨基酸取代。在進(jìn)一步的實施方案中，本公開 提供多核苷酸，所述多核苷酸編碼包含與SEQIDN0:4至少80%、90%、95%、98 %或99 % 相同的序列的多肽，其中多肽在第23位具有亮氨酸，在第108位具有異亮氨酸并且在第140 位具有亮氨酸，并且其中多肽具有胞嘧啶脫氨酶活性。在又一實施方案中，多核苷酸編碼包 含SEQIDN0:4的多肽。在又一實施方案中，多核苷酸編碼包含SEQIDN0:4、6、8、10、ll、 12或13所示序列的多肽。
[0010] 本公開提供編碼胞嘧啶脫氨酶的人密碼子優(yōu)化的多核苷酸。在一個實施方案中， 人密碼子優(yōu)化的多核苷酸包含SEQIDN0 :3所示序列。在又一實施方案中，多核苷酸包含SEQIDN0 :5、7或9所示序列。
[0011] 在其它實施方案中，本公開的胞嘧啶脫氨酶或融合構(gòu)建體使用基因遞送系統(tǒng) (GDS)遞送。在另一方面中，編碼胞嘧啶脫氨酶的多核苷酸使用其為病毒或病毒衍生載體的 GDS遞送。病毒載體可以是復(fù)制型或者非復(fù)制型，并且可以是腺病毒載體、麻疹病毒載體、 皰疹病毒載體、反轉(zhuǎn)錄病毒載體（包括慢病毒載體）、彈狀病毒載體例如水泡性口炎病毒載 體、呼腸孤病毒載體、矽尼卡谷病毒載體、痘病毒載體（包括動物疹或痘病毒衍生的載體）、 細(xì)小病毒屬載體（包括AAV載體）、甲病毒屬載體或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它病毒載體。 在一個實施方案中，病毒載體可以是能感染正在復(fù)制的哺乳動物細(xì)胞的可復(fù)制型反轉(zhuǎn)錄病 毒載體?？蓮?fù)制型反轉(zhuǎn)錄病毒載體可以包括正反轉(zhuǎn)錄病毒（Orthoretrovirus)或更有代表 性的γ反轉(zhuǎn)錄病毒載體。在一個方面中，可復(fù)制型反轉(zhuǎn)錄病毒載體包含在編碼本公開胞嘧 啶脫氨酶的多核苷酸5'端的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點（IRES)。在一個實施方案中，編碼胞嘧啶 脫氨酶的多核苷酸在反轉(zhuǎn)錄病毒載體ENV多核苷酸的3'端。
[0012] 在其它實施方案中，提供用本公開的胞嘧啶脫氨酶或融合構(gòu)建體或者包括本公開 多核苷酸或融合構(gòu)建體的載體轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。宿主細(xì)胞包括真核細(xì)胞，例如酵母細(xì)胞、昆 蟲細(xì)胞或動物細(xì)胞。宿主細(xì)胞還包括原核細(xì)胞，例如細(xì)菌細(xì)胞。
[0013] 本公開還提供治療細(xì)胞增殖性病癥（包括癌癥）的方法，包括向受試者施用本公 開的多核苷酸或多肽和使受試者接觸包含5-氟胞嘧啶（5-FC)的細(xì)胞毒性藥物。
[0014] 本公開提供重組的可復(fù)制型反轉(zhuǎn)錄病毒（RCR)，包含：反轉(zhuǎn)錄病毒GAG蛋白；反轉(zhuǎn) 錄病毒P0L蛋白；反轉(zhuǎn)錄病毒包膜；包含位于反轉(zhuǎn)錄病毒多核苷酸序列3'端的長末端重復(fù) (LTR)序列、位于反轉(zhuǎn)錄病毒多核苷酸5'端的啟動子序列、gag核酸結(jié)構(gòu)域、pol核酸結(jié)構(gòu) 域和env核酸結(jié)構(gòu)域的反轉(zhuǎn)錄病毒多核苷酸，所述啟動子適宜于在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)； 包含可操作連接至異源多核苷酸的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點（IRES)的盒，其中盒位于3'LTR的 5'端并且位于編碼反轉(zhuǎn)錄病毒包膜的env核酸結(jié)構(gòu)域的3'端；和在靶細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄、 包裝和整合必需的順式作用序列，其中與PACE載體（SEQIDNO:21)相比，RCR在6次傳代 后保持了較高的復(fù)制能力。在一個實施方案中，反轉(zhuǎn)錄病毒多核苷酸序列衍生自鼠白血病 病毒（MLV)、莫洛尼鼠白血病病毒（MoMLV)、貓科白血病病毒或長臂猿白血病病毒（GALV)。 在另一實施方案中，MLV是雙嗜性MLV。在又一實施方案中，反轉(zhuǎn)錄病毒是致癌反轉(zhuǎn)錄病毒。 在又一實施方案中，靶細(xì)胞是具有細(xì)胞增殖性病癥的細(xì)胞。細(xì)胞增殖性病癥可以選自，但 不限于，肺癌、結(jié)腸-直腸癌、乳腺癌、前列腺癌、泌尿道癌、子宮癌、腦癌、頭頸癌、胰腺癌、 黑素瘤、胃癌和卵巢癌、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和其它自身免疫病。在一個實施方案中，啟動子包 括具有SEQIDN0:19、20或22的從核苷酸1至大約核苷酸582所示序列的CMV啟動子 并且可包括對一個或更多個核酸堿基的修飾，所述啟動子能夠指導(dǎo)和起始轉(zhuǎn)錄。在仍然進(jìn) 一步的實施方案中，啟動子包含SEQIDNO:19、20或22從核苷酸1至大約核苷酸582所 示序列。在又一實施方案中，啟動子包含CMV-R-U5結(jié)構(gòu)域多核苷酸。在一個實施方案中， CMV-R-U5結(jié)構(gòu)域包含連接至MLVR-U5區(qū)的人巨細(xì)胞病毒立即早期啟動子。在又一實施方 案中，CMV-R-U5結(jié)構(gòu)域多核苷酸包含SEQIDNO:19、20或22從大約核苷酸1至大約核苷 酸1202所示序列或者與SEQIDNO:19、20或22所示序列至少95%相同的序列，其中多核 苷酸促進(jìn)與其可操作連接的核酸分子的轉(zhuǎn)錄。在另一實施方案中，所述多核苷酸的gag和 pol衍生自致癌反轉(zhuǎn)錄病毒。gag核酸結(jié)構(gòu)域可包含SEQIDNO:19從大約核苷酸1203至 大約核苷酸2819的序列或者與其具有至少95%、98%、99%或99. 8%同一性的序列。pol 結(jié)構(gòu)域可包含SEQIDNO:19從大約核苷酸2820至大約核苷酸6358的序列或與其具有至 少95%、98%、99%或99. 9%同一性的序列。在一個實施方案中，env結(jié)構(gòu)域編碼兩性env 蛋白質(zhì)。env結(jié)構(gòu)域可包含SEQIDNO:19從大約核苷酸6359至大約核苷酸8323的序列 或與其具有至少95%、98%、99 %或99. 8 %同一性的序列。載體的IRES結(jié)構(gòu)域可以是任何 IRES，然而，在一個實施方案中，IRES衍生自腦心肌炎病毒。在又一實施方案中，IRES包含 SEQIDN0:19從大約核苷酸8327至大約核苷酸8876的序列或與其具有至少95%、98%或 99%同一性的序列。在仍然進(jìn)一步的實施方案中，異源多核苷酸包括具有SEQIDNO:3、5、 11、13、15或17所示序列的多核苷酸。在又一實施方案中，異源序列編碼包含SEQIDNO:4 所示序列的多肽。異源核酸是人密碼子優(yōu)化的并且編碼如SEQIDNO:4中所示多肽。在又 一實施方案中，異源核酸包含SEQIDNO:19從大約核苷酸8877至大約9353所示序列。在 一個實施方案中，3'LTR衍生自致癌反轉(zhuǎn)錄病毒。在又一實施方案中，3'LTR包含U3-R-U5 結(jié)構(gòu)域。在仍然進(jìn)一步的實施方案中，3'LTR包含SEQIDNO: 19從大約核苷酸9405至大 約9998所示序列或與其至少95%、98%或99. 5%相同的序列。
[0015] 本公開提供包含SEQIDN0 :19、20或22所示序列的多核苷酸。
[0016] 本公開提供分離的多核苷酸，從5'至3'包含：人巨細(xì)胞病毒立即早期啟動子與 MLVR-U5區(qū)的CMV-R-U5融合物；PBS，對于反轉(zhuǎn)錄酶的引物結(jié)合位點；5'剪接位點；Φ包裝 信號；MLV組特異性抗原的gag編碼序列；MLV聚合酶多蛋白的pol編碼序列；3'剪接位點； MLV株4070A包膜蛋白的4070Aenv編碼序列；來自腦心肌炎病毒的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點 (IRES);修飾的胞嘧啶脫氨酶編碼序列；多嘌呤段；和U3-R-U5MLV長末端重復(fù)。
[0017] 本公開提供治療患有細(xì)胞增殖性病癥的受試者的方法，包括使受試者與具有胞 嘧啶脫氨酶活性的本公開多肽的多核苷酸在多核苷酸表達(dá)的條件下接觸，和使受試者與 5_氟胞嘧啶接觸。
[0018] 本公開還提供治療受試者中細(xì)胞增殖性病癥的方法，包括使受試者與本公開的反 轉(zhuǎn)錄病毒接觸，其中異源核酸序列編碼抑制贅生性細(xì)胞增殖的治療蛋白質(zhì)。在一個實施方 案中，反轉(zhuǎn)錄病毒包含編碼具有SEQIDN0 :4、12、14、16或18所示序列的多肽的多核苷酸。
[0019] 本公開的一個或更多個實施方案的細(xì)節(jié)在附圖和下面的說明書中描述。根據(jù)說明 書和附圖以及根據(jù)權(quán)利要求書，其它特征、目的和優(yōu)點將是顯而易見的。
【附圖說明】
[0020] 圖1A-D顯示（a)本公開重組反轉(zhuǎn)錄病毒載體的示意圖；(b)本公開多核苷酸的質(zhì) 粒圖譜；（c和d)本公開的多核苷酸的序列（SEQIDN0 :19)。
[0021] 圖2A-D顯示包含具有⑶、0PRT和UPRT活性的多肽的本公開各個實施方案產(chǎn)生的 方案。
[0022] 圖3顯示觀察到與感染的U-87細(xì)胞內(nèi)野生型y⑶蛋白相比y⑶2蛋白水平更高。
[0023] 圖4顯示包含本公開CD多肽的載體的穩(wěn)定性和與本公開的其它載體的比較。
[0024] 圖5A-B顯示，當(dāng)感染的細(xì)胞暴露于增加水平的5-FC時，與野生型y⑶活性 (T5. 0007)相比，本公開的胞嘧啶脫氨酶活性和載體提供相當(dāng)?shù)幕蚋玫谋磉_(dá)，并且因此殺 死感染的大鼠RG2 (5A)或U87細(xì)胞（5B)。
[0025] 圖6顯示感染的U87細(xì)胞內(nèi)T5. 0002 (yCD2)的比活性高于T5. 0001 (部分優(yōu)化的 yCD)，T5. 0001 高于T5. 0007 (野生型yCD)。
[0026] 不同圖中相同參考符號表不著相同的元素。
【具體實施方式】
[0027] 如本文和后附權(quán)利要求書中所使用，單數(shù)形式"一（a) "、"一（an) "和"該（the) " 包括復(fù)數(shù)指示物，除非上下文另外明確指出。因此，例如，當(dāng)提到"一細(xì)胞（acell)"時包括 多數(shù)的此類細(xì)胞并且當(dāng)提到"該試劑（theagent)"時包括提到本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的一種 或多種試劑，等等。
[0028] 同樣，"或"的使用意思是指"和/或"，除非另外說明。類似地，"包含/包括（com prise,comprises,comprising) "、"包括（includes,including) "可互換并且不旨在是限制 性的。
[0029] 還應(yīng)當(dāng)進(jìn)一步理解，當(dāng)使用術(shù)語"包含/包括"描述各種實施方案時，本領(lǐng)域技術(shù) 人員將理解在一些特別情況下實施方案可選地使用語言"基本上由……組成"或"由……組 成"描述。
[0030] 除非另外定義，本文所使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本公開所屬領(lǐng)域普通技 術(shù)人員通常理解相同的含義。雖然與本文所述的那些方法和材料相似或等同的方法和材料 可以用于實施所公開的方法和組合物，但是本文描述示例性的方法、裝置和材料。
[0031] 上面以及本文通篇所討論的出版物被提供，原因僅僅在于它們的公開先于本申請 的提交日。但無論如何不能解釋為承認(rèn)發(fā)明人因在先公開而無權(quán)占先于此類公開。
[0032] 胞嘧啶脫氨酶（EC3. 5. 4. 1)是催化下列化學(xué)反應(yīng)的酶：
[0033] 胞嘧啶+H20 -尿嘧啶+NH3
[0034] 因此，該酶的兩個底物是胞嘧啶和H20,而其兩個產(chǎn)物是尿嘧啶和NH3。該酶屬于水 解酶家族，這些酶作用于肽鍵之外的碳-氮鍵，特別是環(huán)脒中的碳-氮鍵。該酶類的系統(tǒng)名 稱是胞嘧啶氨基水解酶。該酶也叫作異胞嘧啶脫氨酶。該酶參與嘧啶代謝。
[0035] 更加具體而言，胞嘧啶脫氨酶是參與嘧啶代謝途徑的酶，通過該酶外源胞嘧啶 經(jīng)水解脫氨基作用轉(zhuǎn)化成尿嘧啶。了胞嘧啶脫氨酶（CD酶或CD)活性已經(jīng)展示于原 核生物和低等真核生物中，但是它們在哺乳動物中缺乏（Koechlin等，1966，Biochem. Pharmacol. 15,435_446;Polak等，1976，Chemotherapy22，137_153)。分別編碼釀酒酵 母和大腸桿菌兩種生物⑶酶的釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae，S.cerevisiae) FCY1基因和大腸桿菌（E.coli)coda基因是已知的并且它們的序列已經(jīng)公布（EP402 108 ; Erbs等，1997,Curr.Genet. 31，1-6 ;W0 93/01281)。CD酶也將胞嘧啶類似物 5-氟胞嘧 啶（5-FC)脫氨成為5-氟尿嘧啶（5-FU)，其是高度細(xì)胞毒性的化合物，特別是當(dāng)其被轉(zhuǎn) 變成5-氟-UMP(5-FUMP)時。因為編碼該酶的基因的鈍化突變或者因為該酶天然缺乏 (例如哺乳動物細(xì)胞）而缺乏CD酶活性的細(xì)胞對5-FC有抗性（Jund和Lacroute，1970， J.Bacteriol. 102,607-615;Kilstrup等，1989,J.Bacteriol.，171，2124-2127)。另一方 面，已經(jīng)證明可以將5-FC敏感性傳遞給已經(jīng)轉(zhuǎn)移入編碼CD酶活性的序列的哺乳動物細(xì)胞 (Huber等，1993，CancerRes. 53,4619_4626;Mullen等，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89,33-37 ;W0 93/01281)。因此，⑶的使用在基因治療、特別是抗癌基因治療情況下是有利 的。
[0036] 然而，5-FC敏感性取決于細(xì)胞系而極大不同。在例如以表達(dá)大腸桿菌coda基因的 反轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的PANC-1 (胰腺的癌）和SK-BR-3 (乳腺癌）人腫瘤細(xì)胞系中觀察到低敏感 性（Harris等，1994，GeneTherapy1，170-175)。該現(xiàn)象被解釋為由⑶酶的酶作用所形成 的5-FU向細(xì)胞毒性5-FUMP的內(nèi)源轉(zhuǎn)變?nèi)狈虿?。在哺乳動物?xì)胞中正常由乳清酸磷酸核 糖基轉(zhuǎn)移酶（0PRT酶）實現(xiàn)的這一步驟可能在某些腫瘤中缺乏并且因此使得基于CD酶的 基因治療無效。在原核生物和低等真核生物中，通過尿嘧啶磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶的作用（UPRT 酶活性）尿嘧啶被轉(zhuǎn)變成UMP。該酶也將5-FU轉(zhuǎn)變成5-FUMP。重要的是，細(xì)菌尿嘧啶磷酸 核糖基轉(zhuǎn)移酶（UPRT)與哺乳動物細(xì)胞的乳清酸磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶（0PRT)或尿苷-5'-一 磷酸合酶功能等效。這些酶介導(dǎo)5-氟尿嘧啶（5-FU)(尿嘧啶的氟化類似物）向5-氟尿 苷5' 一磷酸（5-FUMP)的轉(zhuǎn)變。5-氟尿苷5' 一磷酸之后通過哺乳動物嘧啶從頭合成途徑 被轉(zhuǎn)變成5-FdUDP和FdUTP。每一 5-FdUTP是胸苷酸合酶（Thy-A)的不可逆抑制劑并且導(dǎo) 致dTTP饑餓。廣泛公認(rèn)的是，這種轉(zhuǎn)變是實現(xiàn)5-氟尿嘧啶的細(xì)胞毒性作用必需途徑之一 并且細(xì)菌來源的細(xì)菌尿嘧啶磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶能夠向哺乳動物乳清酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶一 樣將5-氟尿嘧啶轉(zhuǎn)變成相同的活性代謝物。在UPRT酶活性或0PRT酶活性缺乏情況下，源 于5-FC被⑶酶的脫氨作用產(chǎn)生的5-FU不被轉(zhuǎn)變成細(xì)胞毒性的5-FUMP(Jund和Lacroute， 1970,J.Bacteriol. 102,607-615) 〇
[0037] 如本文所述，本公開提供編碼多肽的多核苷酸和包含具有胞嘧啶脫氨酶活性的第 一多肽與包含UPRT或0PRT活性的第二多肽融合的多肽。此種融合構(gòu)建體可用于將尿嘧啶 或其衍生物轉(zhuǎn)變成一磷酸類似物，并且具體而言將5-FU轉(zhuǎn)變成5-FUMP。
[0038] 如將在下面更加詳細(xì)地描述，本公開至少部分地基于催化5-FC轉(zhuǎn)變成5-FU的 新的多肽的產(chǎn)生和表達(dá)。在一個實施方案中，提供了已經(jīng)被工程改造而具有將5-FC轉(zhuǎn)變 成5-FU的改良催化特性的新多肽。此種多肽包括已經(jīng)被改變成在指定殘基處包括氨基酸 取代的變體。雖然這些變體將在下面更加詳細(xì)地描述，但是應(yīng)當(dāng)理解，本公開的多肽可包 含一個或更多個修飾的氨基酸。修飾的氨基酸的存在將在例如（a)增加多肽體內(nèi)半壽期， (b)降低或增加多肽抗原性，和（c)增加多肽保存穩(wěn)定性中是有利的。一個或多個氨基酸 通過例如重組產(chǎn)生過程中的共翻譯或者翻譯后修飾（例如在哺乳動物細(xì)胞中在表達(dá)過程 中N-X-S/T基序處的N-連接糖基化）或者通過合成手段修飾。因此，"突變體"、"變體" 或者"修飾的"蛋白質(zhì)、酶、多核苷酸、基因或者細(xì)胞意思是指已經(jīng)被改變或衍生，或者以一 定方式與親本蛋白質(zhì)、酶、多核苷酸、基因或者細(xì)胞不同或者改變的蛋白質(zhì)、酶、多核苷酸、 基因或細(xì)胞。突變體或修飾的蛋白質(zhì)或酶通常，雖然不是必須，從突變體多核苷酸或基因表 達(dá)。
[0039] "突變"意思是指產(chǎn)生突變體蛋白質(zhì)、酶、多核苷酸、基因或細(xì)胞的任何過程或者機(jī) 制。這包括其中蛋白質(zhì)、酶、多核苷酸或基因序列被改變的任何突變，和源于此突變的在細(xì) 胞中的任何可檢測的改變。有代表性地，突變以單個或多個核苷酸殘基的點突變、缺失或插 入出現(xiàn)在多核苷酸或者基因序列中。突變包括基因的蛋白質(zhì)編碼區(qū)內(nèi)出現(xiàn)的多核苷酸改變 以及蛋白質(zhì)編碼區(qū)序列外的區(qū)域（例如但不限于調(diào)節(jié)序列或啟動子序列）的改變。基因中 的突變可以是"沉默的"，即不反映在表達(dá)時的氨基酸改變，產(chǎn)生基因的"序列保守"變體。這 通常在一個氨基酸對應(yīng)于一個以上密碼子時發(fā)生。
[0040] 修飾的氨基酸的非限定性實例包括糖基化氨基酸、硫酸化氨基酸、異戊二烯化 (例如法呢基化、櫳牛兒基櫳牛兒基化）氨基酸、乙酰化氨基酸、酰化氨基酸、聚乙二醇化 氨基酸、生物素化氨基酸、羧化氨基酸、磷酸化氨基酸，等等。足以指導(dǎo)技術(shù)人員修飾氨基 酸的參考文獻(xiàn)在文獻(xiàn)中到處都是。實例方案存在于Walker(1998)ProteinProtocolson CD-ROM(HumanaPress，Towata，N.J.)中。
[0041] 本文描述了用于產(chǎn)生、分離和使用本公開的修飾的⑶多肽和多核苷酸的重組方 法。除了重組生產(chǎn)外，多肽可以通過使用固相技術(shù)的直接肽合成（例如，Stewart等（1969) Solid-PhasePeptideSynthesis(WHFreemanCo,SanFrancisco)jPMerrifield(1963) J.Am.Chem.Soc.85 :2149-2154)產(chǎn)生。肽合成可以使用手工技術(shù)開展或者自動開展。自 動合成可以使用例如AppliedBiosystems431 肽合成儀（PerkinElmer，F(xiàn)osterCity， Calif.)按照制造商提供的說明書實現(xiàn)。
[0042]通過例證方式，編碼大腸桿菌（Anderson等，1992，Eur.J.Biochem204, 51-56)、 乳酸鏈球菌（Lactococcuslactis)(Martinussen和Hammer，1994，J.Bacteriol. 176， 6457-6463)、牛分枝桿菌（Mycobacteriumbovis)(Kim等，1997，BiochemMol.Biol. Int41，1117-1124)和枯草芽抱桿菌（Bacillussubtilis)(Martinussen等，1995， J.Bacteriol. 177,271-274)UPRT酶的核酸序列可以在本公開背景中使用。然而，使用酵母 UPRT酶，并且特別是由釀酒酵母FUR1基因編碼的UPRT酶，其序列公開于Kern等（1990， Gene88,149-157)中，通過引用整合入本文。通過明示方式，基因的序列和相應(yīng)UPRT酶的 那些序列可以在文獻(xiàn)中和專門的數(shù)據(jù)庫（SWISSPR0T，EMBL，GenbankMedline，等）中找到。 [0043] 在本文中互換使用的術(shù)語"蛋白質(zhì)"或"多肽"包含稱作氨基酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)塊通過 稱作肽鍵的化學(xué)鍵連接在一起的一個鏈或更多個鏈。"酶"意思是指尤其是或多或少催化或 促進(jìn)一種或更多種化學(xué)或生物化學(xué)反應(yīng)的任何物質(zhì)，優(yōu)選全部或大部分由蛋白質(zhì)組成。術(shù) 語"酶"還可指催化多核苷酸（例如RNA或DNA)。"天然"或"野生型"蛋白質(zhì)、酶、多核苷 酸、基因或細(xì)胞意思是指天然存在的蛋白質(zhì)、酶、多核苷酸、基因或細(xì)胞。
[0044] 因此，在幾個實施方案中，提供分離的或重組的多肽，其包含具有選自A23L、 V108I、I140L及其任何組合的突變的SE