重組桿狀病毒無縫克隆的方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術領域中基因工程和蛋白工程，具體地說就是一種桿狀病毒的 重組構建方法，可用于表達重組蛋白、構建基因治療載體、制備偽病毒樣顆粒疫苗等。
【背景技術】
[0002] 桿狀病毒載體表達系統(tǒng)度EV巧是一種利用昆蟲桿狀病毒作為載體，在蟲體內或 者宿主昆蟲細胞中表達外源蛋白的真核表達系統(tǒng)。因其極晚期基因（地和PlO)啟動子可 W強效驅動外源基因表達而常用于構建重組病毒，高效表達目的蛋白。自從1983年，Smith 等人利用AcMNPV作為表達載體高水平地表達了人0 -干擾素后，在近S十年間，BEVS表達 了成千上萬的外源蛋白，因而成為繼大腸桿菌、酵母和哺乳動物細胞的=大表達系統(tǒng)之后 又一個重要的表達系統(tǒng)。
[0003] 最早的BEVS是通過與野生病毒同源重組來實現(xiàn)外源基因的表達的，重組效率極 低，不到0. 1%，而且需要多輪隧斑篩選純化病毒，技術復雜，耗時費力。后來，Kitts等人 將IacZ基因插入到多角體基因座位置，并在orfl629和orf603基因處各引入一個BSU36I 酶切位點構建了一種可W通過線性化獲得復制缺陷型病毒的方法度acPAK系統(tǒng)），病毒DNA 被BSU36I線性化之后，由于缺失了復制所必需的基因orfl629,即使自連也無法產生有感 染力的病毒。線性化的該載體系統(tǒng)與轉移載體共轉染，同源重組獲得重組病毒。但由于無 法保證病毒載體100%線性化，因此，仍然需要進行隧斑篩選W純化病毒。隨后Lee等在桿 狀病毒DNA上引入細菌人工染色體片段度AC),建立了Bac-to-Bac的邸VS。該系統(tǒng)引入的 BAC片段具有細菌mini-F復制子、Tn7轉座位點、卡那霉素化an)抗性基因，使病毒DNA能 夠W質粒的形式在細菌細胞內復制，通過轉座重組克隆目的基因，藍白篩選獲得單克隆重 組DNA，轉染宿主細胞后復制擴增產生重組病毒并表達外源蛋白。
[0004]Zhao和化ssee等分別建立了 一套復制缺陷型的病毒載體BAClO:K01629和 flashBAC。他們在基因組中插入一個低拷貝的mini-F復制子失活orfl629。運種方法結 合了BacPAK系統(tǒng)和Bac-to-Bac系統(tǒng)的優(yōu)點，只需要構建一個重組轉移載體，并與BAClO: K01629或fIashBAC載體共轉染細胞就可W-步法獲得重組病毒，無需篩選。
[0005] 此外，也出現(xiàn)如酵母-昆蟲細胞穿梭質粒載體系統(tǒng)和化e-loxP系統(tǒng)等桿狀病毒重 組方法。國內，也出現(xiàn)一些新的重組病毒構建方法。但總的來說，運些方法，要么仍然需要 隧斑篩選，要么需要特定菌株重組克隆，要么借助特別重組酶和標記基因，桿狀病毒重組方 法并沒有新的突破。

【發(fā)明內容】

[0006] 本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種重組桿狀病毒無縫克隆的方法。
[0007] 為了解決上述技術問題，本發(fā)明提供的一種重組桿狀病毒無縫克隆的方法，包括 兩個主要構成元件：可線性化的復制缺陷型桿狀病毒載體和重組捶救DNA片段，上述兩個 元件在昆蟲細胞內直接重組（自行直接重組）產生重組桿狀病毒。
[0008] 作為本發(fā)明的重組桿狀病毒無縫克隆的方法的改進：所述線性化的復制缺陷型桿 狀病毒載體和重組捶救DNA片段在昆蟲細胞內的DNA重組設及到IO-SObp長同源臂的同源 重組和/或非同源的末端連接。
[0009] 作為本發(fā)明的重組桿狀病毒無縫克隆的方法的進一步改進：
[0010] 所述可線性化的復制缺陷型桿狀病毒載體為在病毒基因組中W細菌人工染色體 片段（即包含miniF復制子的BAC片段）替代桿狀病毒多角體基因座及復制必需基因 O計1629的3'端序列，并在BAC片段與orfl629之間引入一個單酶切位點BSU36I;
[0011] 所述重組捶救DNA片段為一端包含orfl629缺失的3'端序列及其同源臂序列，另 一端包含或不包含BAC片段的同源臂。
[0012] 作為本發(fā)明的重組桿狀病毒無縫克隆的方法的進一步改進：可線性化的復制缺陷 型桿狀病毒載體，在與重組捶救DNA片段共轉染時利用BSU36I酶切成線性的包含0rfl629 末端和BAC末端的單個片段。
[0013] 作為本發(fā)明的重組桿狀病毒無縫克隆的方法的進一步改進：重組捶救DNA片段， 其一端包含的〇rfl629同源臂序列至少IObp長。
[0014] 備注說明：
[0015] 通常，同源重組中同源臂越長重組的概率越高。本發(fā)明已證實包含10到50bp同 源臂的重組捶救DNA片段均能與線性化病毒載體重組產生重組病毒，無同源臂的片段無法 產生重組病毒。
[0016] 作為本發(fā)明的重組桿狀病毒無縫克隆的方法的進一步改進：所述重組捶救DNA片 段，可W是化學合成的，也可W是通過其他方法合成的包含除必需基因捶救DNA序列及同 源臂W外的其他序列DNA。
[0017] 作為本發(fā)明的重組桿狀病毒無縫克隆的方法的進一步改進：
[0018] 無縫克隆方法為：是通過重組捶救DNA片段與線性化的復制缺陷型桿狀病毒載體 混合，然后一起導入昆蟲細胞內，通過同源重組和/或非同源的末端連接產生重組病毒。
[0019] 本發(fā)明的重組桿狀病毒無縫克隆的方法的技術方案具體如下：
[0020] -種可線性化的復制缺陷型桿狀病毒載體，運種桿狀病毒載體在病毒基因組多角 體基因座插入細菌人工染色體片段度AC,包含miniF復制子、Tn7轉座子位點和卡那霉素抗 性基因），并缺失復制必需基因OTf1629的3'端序列，化及在BAC片段與OTf1629之間引入 一個單酶切位點BSU36I。
[0021] 上述可線性化復制缺陷型桿狀病毒載體克隆過程包含如下步驟：
[0022] 1)在桿狀病毒穿梭載體度mBacmid，見專利ZL201210037290. 8,或者Bacmid bM0N14271)基礎上，W氯霉素（Cm)抗性基因表達盒（CAT)作為打祀片段，通過Red重組，在 大腸桿菌細胞內敲除桿狀病毒復制必需基因〇rfl629的3'端序列，同時在CAT兩側各引入 一個BSU36I位點，產生復制缺陷型的桿狀病毒穿梭載體BmBacmid-CAT-K01629。
[0023] 2)然后Bsu36I酶切去除CAT,通過T4DNA連接酶連接Bsu36I粘性末端，使酶切后 的分子自連，連接產物電轉化DHlOB大腸桿菌感受態(tài)細胞，通過卡那霉素化an)抗性和氯 霉素（Cm)敏感性篩選獲得消除CAT的重組Bacmid,即可線性化復制缺陷型桿狀病毒載體 BmBacmid-K01629〇
[0024] 本發(fā)明所述重組捶救DNA片段為一端包含orfl629缺失的3>端序列及其同源臂 序列，另一端包含或不包含BAC片段的同源臂，該重組捶救DM片段由由必需基因捶救DM片段、目的基因片段和啟動子片段通過重疊PCR的方法合成，具體包含W下步驟：
[00巧]1)必需基因捶救DNA片段，為包含必需基因OTf1629缺失序列和同源臂的片段。[002引。目的基因片段，W目的基因DNA為模板，設計引物，PCR擴增合成，合成的目的基 因片段兩端分別與必需基因捶救DNA片段和啟動子片段有20-5化P的重疊。
[0027] 3)啟動子片段，根據目的基因定位的宿主W化學方法或PCR法合成相應的啟動子 序列。
[0028] 4)上述S個DNA片段，按照重疊PCR的方法合成包含目的基因表達盒和必需基因 O計1629缺失序列的重組捶救DNA片段。
[0029] 本發(fā)明公開的重組桿狀病毒無縫克隆方法，其DNA重組過程是，可線性化復制缺 陷型桿狀病毒載體BmBacmid-K01629經BSU36I酶切而線性化，然后與重疊PCR合成的重組 捶救DNA片段混合，再共轉染昆蟲細胞BmN。在BmN細胞內，重組捶救DNA片段通過一端的 O計1629同源臂與線性化的BmBacmid-K01629發(fā)生同源重組，修復必需基因orfl629而救活 病毒，另一端則或末端連接，或同源重組。
[0030] 本發(fā)明所提及的重組方案，所用昆蟲桿狀病毒及其培養(yǎng)細胞，可線性化的復制缺 陷型桿狀病毒載體元件中所選擇缺失的必需基因，及重組捶救DNA片段所包含同源臂和目 的DNA的改變，均屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0031] 本發(fā)明公開的重組桿狀病毒無縫克隆方法，無需構建目的基因的轉移載體和隧斑 篩選，也無需特定菌株或重組酶的作用，操作簡單高效，可高通量構建重組桿狀病毒，