一種高效利用昆蟲核型多角體病毒表型多樣性的方法
【專利說明】
一、技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于害蟲生物防治技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種高效利用昆蟲核型多角體病毒表型多樣性的方法。
二、技術(shù)背景
[0002]自然界中寄生物-寄主相互作用中，普遍存在寄生物多基因型混合感染現(xiàn)象。這些基因型在存在遺傳差異的同時，往往其表型上也表現(xiàn)出差異。昆蟲病毒也不例外，昆蟲核型多角體病毒(NPV)中有豐富的基因型，不同基因型又常常有著不同的表型。NPV表型多樣性主要表現(xiàn)為殺蟲活性、殺蟲速度和病毒產(chǎn)量等特性上。如在草地貪夜蛾核型多角體病毒Spodoptera frugiperda NPV(SfMNPV)尼加拉瓜分離株的9種基因型中，其殺蟲速度存在顯著差異，并且分離株的殺蟲速度同優(yōu)勢基因型相比較慢，表明可能至少有2種甚至更多的基因型決定著病毒種群的殺蟲速度。由I頭松夜蛾中得到的4種NPV基因型，它們的毒力相差達6倍，此外，侵染速度和病毒產(chǎn)出也有差異。在甜菜夜蛾核型多角體病毒Spodoptera exiguaNPV(SeNPV)西班牙分離株的4種基因型中，有I種基因型的活性顯著低于其它3種，另外3種基因型間無顯著差異。
[0003]斜紋夜蛾核型多角體病毒Spodoptera litura MNPV(SpltMNPV)也不例外，其在自然界中同樣存在豐富的基因型和表型Jaeda等(1990)從日本采集的SpltNPV 4個分離株可分為4類基因型。Takatsuka等(2003)發(fā)現(xiàn)來源于日本、越南和印度等地的9個SpltNPV分離株和埃及的I個?；页嵋苟?SpliMNPV)分離株均由幾種基因型組成。Kamiya(2004)從日本全國各地采集野外感病幼蟲中病毒可分為A、B、C三類基因型。這些SpltMNPV不同基因型在病毒產(chǎn)量、殺蟲活性和殺蟲速度上表現(xiàn)出不同的表型特征。Kamiya等(2004)發(fā)現(xiàn)A、B和C三類病毒基因型的產(chǎn)量不同，在經(jīng)口感染斜紋夜蛾幼蟲時，C型包涵體產(chǎn)量比A型和B型多2000?20000倍;血淋巴注射結(jié)果同樣表現(xiàn)出C型產(chǎn)量高。殺蟲毒力和作用速度也有顯著差異，殺蟲活性以A型最尚，殺蟲速度則以C型最尚。
[0004]從進化的動力來看，病毒多基因型的復(fù)合侵染是由于:(I)毒力更高。這已在松夜蛾核型多角體病毒Pannolis fiammea NPV(PfMNPV)上得到證實，不同基因型的復(fù)合侵染毒力要高于單獨侵染。進一步研究發(fā)現(xiàn)PfNPV多個基因型混合侵染時毒力提高是由于產(chǎn)生了比單個基因型侵染致病力更強的病毒包涵體。同樣也發(fā)現(xiàn)SfNPV多基因型種群(SfNIC)的侵染活性高于其中任何一種基因型單獨侵染的活性。(2)宿主域更廣。對能夠感染一種以上宿主的病毒而言，病毒的多態(tài)性能夠提高其在不同宿主中的適應(yīng)性。此亦在PfMNPV不同基因型對松夜蛾P(guān)anolis fiammea和甘藍夜蛾Mamestra brassicae致病力差異的研究中得到證實。
[0005]合理高效利用NPV表型多樣性是充分發(fā)揮病毒控害作用的重要途徑。關(guān)于病毒多樣性，主要研究集中在分離株上，并且集中在分離株中分離到不同基因型后比較各基因型間表型差異上，病毒分離株或單頭病蟲在進行分離時，可獲得不同的克隆株系，這些克隆株系并不一定屬于不同基因型，它們之間的表型多樣性如何？尚未見報道，而明確單頭病蟲中分離到的各病毒克隆株系殺蟲活性、殺蟲速度及病毒產(chǎn)量等表型多樣性，可為合理高效利用核型多角體病毒表型多樣性進行害蟲防治提供依據(jù)和方法。
三、
【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]1、發(fā)明目的
[0007]提供一種理想的昆蟲核型多角體病毒多表型樣性高效利用方法，能更加有效地控制害蟲。
[0008]2、技術(shù)方案
[0009]本發(fā)明為一種昆蟲核型多角體病毒表型多樣性高效利用方法，其特征在于利用單頭病蟲中的病毒表型多樣性。
[0010]3、有益效果
[0011]本發(fā)明的方法與現(xiàn)有技術(shù)相比，產(chǎn)生以下有益效果:(I)與常規(guī)通過明確基因型多樣性后再進行表型多樣性研究相比，本發(fā)明通過直接比較單頭病蟲中各病毒克隆株系表型多樣性，其發(fā)現(xiàn)效率更高；(2)與利用基于病毒基因型多樣性的表型多樣性相比，本發(fā)明直接利用單頭病蟲中的表型多樣性，更為便捷高效。
四、【具體實施方式】
[0012]本發(fā)明的實施例是采用室內(nèi)生物測定的方法。
[0013]供試材料
[0014]斜紋夜蛾:室內(nèi)人工飼養(yǎng)100多代的斜紋夜蛾，飼養(yǎng)溫度為27±1°C，光照為14:10(L:D)，蟲卵用2%甲醛消毒，幼蟲3齡前群體飼養(yǎng)，3齡后單頭飼養(yǎng)，選擇健康的3齡中期幼蟲進行毒力試驗。
[0015]斜紋夜蛾核型多角體病毒(SpltNPV)=SpltNPV 1_15號克隆株系由安徽和縣田間采集的兩頭感染NPV的斜紋夜蛾中通過活體克隆分離獲得，其中1-8號為同一頭病蟲中分離，9-15號為另一頭病蟲分離獲得。
[0016]供試方法
[0017]病毒株系活體克隆方法:用來自于同一頭病蟲中的高濃度原始病毒感染4齡斜紋夜蛾幼蟲10-15頭，72h后，收集血淋巴，稀釋后，再用來感染150頭的3齡幼蟲，此時所用病毒的濃度控制在對幼蟲的致死率低于20%。將發(fā)病的蟲體單頭收集，并對昆蟲病毒多角體進行500rpm和3000rpm的差速離心純化。
[0018]生物測定:用飼料喂毒法測定由安徽和縣自然界單頭病蟲中活體克隆得到的病毒對斜紋夜蛾的殺蟲活性、殺蟲速度及病毒產(chǎn)量，測定來自于兩頭病蟲的15個活體克隆株系。試驗在6孔板中進行，將人工飼料切成相同小塊(確保24h吃完)加入6孔板中，每孔I塊，每塊飼料上加上病毒液10yL，15個病毒克隆株系濃度均為106PIB/ml，對照加清水。分別接入大小較為一致的斜紋夜蛾3齡I頭，每個濃度處理60頭幼蟲即10塊板。待含病毒液飼料吃完后補充新鮮無毒的人工飼料，試驗在29°C± TC的光照培養(yǎng)箱中進行。每日調(diào)查死亡蟲數(shù)，分別記錄病毒死亡和其它死亡蟲頭數(shù)，同時收集病毒死亡蟲于離心管中，每板單獨收集于同一離心管內(nèi)，用于病毒產(chǎn)量的分析。每天調(diào)查兩次，以保證病死蟲及時收集。調(diào)查時間為12d，即直到不再有病毒死亡蟲出現(xiàn)。統(tǒng)計12d內(nèi)的總致病率，作為病毒毒力比較的依據(jù)。并計算各處理病毒死亡蟲的平均死亡時間，每板所有病蟲為一個重復(fù)。同時將收集的病毒蟲進行差速離心，每板收集的病毒為一個重復(fù)，用血球計數(shù)板計數(shù)方法對多角體進行計數(shù)，統(tǒng)計產(chǎn)量。
[0019]應(yīng)用DPS統(tǒng)計分析軟件對致死率、死亡時間和病毒產(chǎn)量進行差異顯著性統(tǒng)計分析。
[0020]實施效果:
[0021]實施例1
[0022]比較了SpltNPV和縣株I頭病蟲中分離獲得的8個活體克隆株系在斜紋夜蛾上的表型差異。從致病力來看，不同活體克隆株系病毒間的致病力存在差異。I 06PIB/mlSpltNPVl-8號對斜紋夜蛾3齡幼蟲的致死率分別為78.3%、58.3%、68.3%、71.7%、76.7%、73.3%、65%和51.7%，其中I號病毒的致死率最高，為78.3%，8號病毒最低，為51.7%，各克隆株間有顯著差異$ = 2.49，(^ = 7，79，？ = 0.0239)。
[0023]從殺蟲速度看，各克隆株系對斜紋夜蛾的殺蟲速度也存在差異。106PIB/mlSpltNPVl-8號對斜紋夜蛾3齡幼蟲的致死時間分別為142.2、129.4、113.8、121.6、126.5、122、123.6和120.5h，以I號病毒的殺蟲速度最慢，平均致死時間為142.2h，3號病毒的殺蟲速度最快，平均致死時間僅為113.811，各克隆株系間差異顯著卬=8.976，(^ = 7，79，？<
0.0001)。
[0024]再從克隆株系間病毒產(chǎn)量的差異來看，106PIB/ml1_8個活體克隆株系侵染斜紋夜蛾3齡幼蟲后，單頭病蟲的產(chǎn)量分別為1.22 X 108、1.07 X 108、1.12 X 108、1.1 X 108、0.95X 108、1.13 X 108、1.02 X 18和1.03 X 18PIB,所有活體克隆株系病毒間產(chǎn)量上無顯著性差異(F=1.557，df = 7，79，P = 0.1623)。
[0025]因此，單頭病蟲中存在豐富的病毒表型多樣性，直接利用單頭斜紋夜蛾病蟲即可利用病毒豐富表型多樣性。
[0026]實施例2
[0027]比較了SpltNPV和縣株另I頭病蟲中分離獲得的7個單頭病毒在斜紋夜蛾上的表型差異。從致病力來看，不同活體克隆株系病毒間的致病力也存在差異。1-7號病毒對斜紋夜蛾3齡幼蟲的致死率分別為63.3%、31.7%、51.7%、46.7%、58.3%、61.7%和50%，其中I號病毒的致死率最高，為63.3%，2號病毒最低，為31.7%，各克隆株間有顯著差異(F =2.859，df = 6，69，P = 0.0158)。
[0028]從殺蟲速度看，單頭病毒對斜紋夜蛾的殺蟲速度也存在差異。106PIB/mlSpltNPV1-7號對斜紋夜蛾3齡幼蟲的致死時間分別為120.6、117.4、111.9、126.1、127、122.8和110h，以5號病毒的殺蟲速度最慢，平均致死時間為127h，7號病毒的殺蟲速度最快，平均致死時間僅為110h，各克隆株間無顯著差異(F = 0.783，df = 6，69，P = 0.5863)。
[0029]再從病毒分離株內(nèi)病毒產(chǎn)量的差異來看，106PIB/ml1_8個活體克隆株系病毒侵染斜紋夜蛾3齡幼蟲后，單頭病毒的產(chǎn)量分別為1.04 X 18U.24 X 18,0.89 X 18U.14 X108、1.16 X 108、1.08 X 18和1.32 X 18PIB,7個活體克隆株系病毒間產(chǎn)量上無顯著性差異(F= 1.133,df = 6,69,P = 0.4074) ο
[0030]因此，單頭病蟲中存在豐富的病毒表型多樣性，直接利用單頭斜紋夜蛾病蟲即可利用病毒豐富表型多樣性。
【主權(quán)項】
1.一種利用昆蟲核型多角體病毒表型多樣性方法，其特征在于利用單頭病蟲中病毒表型多樣性。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用單頭病蟲中病毒表型多樣性，其特征在于利用病毒殺蟲活性和殺蟲速度多樣性。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種利用單頭病蟲中昆蟲核型多角體病毒表型多樣性方法?，F(xiàn)有的昆蟲核型多角體病毒表型多樣性發(fā)掘和利用主要通過先明確基因型多樣性后再進行表型多樣性研究比較，較為費時費力。本發(fā)明通過直接比較單頭病蟲中各病毒克隆株系表型多樣性，將單頭病蟲直接進行活體克隆，比較各克隆株系殺蟲速度、殺蟲活性和病毒產(chǎn)量等表型，發(fā)現(xiàn)單頭病蟲中存在豐富的表型多樣性，進而明確可直接利用單頭病蟲中表型多樣性。同現(xiàn)有技術(shù)相比，本方法提高了病毒表型多樣性的獲得速度，有效地提高了病毒的利用效率。
【IPC分類】A01P7/04, A01N63/00
【公開號】CN105557755
【申請?zhí)枴緾N201510943480
【發(fā)明人】郭慧芳, 俞棋, 任彬元, 劉寶生, 鐘萬芳, 方繼朝
【申請人】江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【公開日】2016年5月11日
【申請日】2015年12月15日