Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)在制備家蠶microRNA超量表達(dá)系統(tǒng)中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)在制備家蠶 microRNA超量表達(dá)系統(tǒng)中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 家蠶(silkworm，Bombyx mori)是一種具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值和科學(xué)研究?jī)r(jià)值的鱗翅 目昆蟲。隨著家蠶基因組的解析，對(duì)家蠶的研究已經(jīng)進(jìn)入功能基因組時(shí)代。miRNA技術(shù)是常 用的功能基因研究的技術(shù)之一，目前miRNA常用的方法是體外注射人工合成的miRNA模擬物 或通過(guò)轉(zhuǎn)基因載體來(lái)體內(nèi)高效表達(dá)家蠶miRNA，但是體外注射人工合成的miRNA模擬物，成 本高、期效短;而通過(guò)轉(zhuǎn)基因載體來(lái)高效表達(dá)家蠶miRNA卻又受到表達(dá)載體的局限，其原因 是目前大多數(shù)商業(yè)化miRNA表達(dá)載體適用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞，卻不適合于miRNA在昆蟲細(xì)胞中 的表達(dá)。
[0003] 因此，急需一種適用于家蠶的miRNA表達(dá)系統(tǒng)，能夠在家蠶個(gè)體或細(xì)胞中高效表達(dá) 外源基因，為家蠶miRNA的功能研究提供了新的工具。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于提供Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)在制備家蠶 microRNA超量表達(dá)系統(tǒng)中的應(yīng)用。
[0005] 為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：
[0006] Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)在制備家蠶mi croRNA超量表達(dá)系統(tǒng)中的應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明中，所述家蠶microRNA超量表達(dá)系統(tǒng)含有重組pFastBacl載體，所述重組 pFastBacl載體由pFastBacl載體多克隆酶切位點(diǎn)處依次插入紅色熒光蛋白編碼基因和表 達(dá)家蠶microRNA的次級(jí)前體序列而得。
[0008] 優(yōu)選的，所述重組pFastBacl載體由pFastBacl載體的EcoR I和Spe I處插入紅色 熒光蛋白編碼基因，并于Xba I和Κρη I酶切位點(diǎn)插入表達(dá)家蠶microRNA的次級(jí)前體序列而 得。
[0009] 更優(yōu)選的，所述紅色熒光蛋白編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.5所示。
[0010] 更優(yōu)選的，所述表達(dá)家蠶microRNA的次級(jí)前體序列的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1、 SEQID Ν0· 2或SEQ ID Ν0· 3所示。
[0011] 本發(fā)明中，所述重組pFastBacl載體由以下方法制備：克隆紅色焚光蛋白編碼基 因，然后插入pFastBacl載體多克隆酶切位點(diǎn)處，獲得重組載體Red-pFastBacl;再克隆表達(dá) 家蠶microRNA的次級(jí)前體序列，然后再插入重組載體Red-pFastBacl的紅色焚光蛋白編碼 基因下游，得家蠶microRNA的超量表達(dá)系統(tǒng)。
[0012] 優(yōu)選的，所述紅色熒光蛋白編碼基因插入pFastBacl載體的EcoR I和Spe I酶切位 點(diǎn)處;所述表達(dá)家蠶microRNA的次級(jí)前體序列插入pFastBacl載體的Xba I和Κρη I酶切位 點(diǎn)處。
[0013]本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明通過(guò)以Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)作為家蠶 microRNA的超量表達(dá)系統(tǒng)，該表達(dá)系統(tǒng)能夠超量表達(dá)家蠶簇microRNAs，其中以家蠶let-7 簇miRNAs為例，實(shí)現(xiàn)了外源基因的高效表達(dá)，克服了體外注射人工合成的miRNA模擬物，成 本高、期效短的缺陷，同時(shí)克服了轉(zhuǎn)基因載體不適合于昆蟲細(xì)胞的缺陷，并為家蠶miRNA的 功能研究提供了新的工具。
【附圖說(shuō)明】
[0014] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果更加清楚，本發(fā)明提供如下附圖：
[0015] 圖 1 為家蠶pri-let-7、pri-miR-100、pri-miR-2795和let-7-C PCR擴(kuò)增結(jié)果（A: pri-let-7 擴(kuò)增結(jié)果;B:pri-miR-100 擴(kuò)增結(jié)果;C:pri-miR-2795 擴(kuò)增結(jié)果;D:let-7-C 擴(kuò)增 結(jié)果）。
[0016] 圖2為重組報(bào)告基因載體構(gòu)建（A:Rp-let-7、Rp-miR-100重組質(zhì)粒和Red-pFastBacl報(bào)告基因載體雙酶切驗(yàn)證，其中泳道l~5分別表示Rp-let-7重組質(zhì)粒、Rp-miR-100重組質(zhì)粒、Rp-let-7重組質(zhì)粒雙酶切、Rp-miR-100重組質(zhì)粒雙酶切、Red-pFastBacl質(zhì)粒 雙酶切;B: Rp-miR-2795重組質(zhì)粒雙酶切驗(yàn)證，其中泳道1和2分別表示Rp-miR-2795重組質(zhì) 粒、Rp-miR-2795重組質(zhì)粒雙酶切;C:Rp-let-7-C重組質(zhì)粒雙酶切驗(yàn)證，其中泳道1和2分別 表示Rp-let-7-C重組質(zhì)粒、Rp-let-7-C重組質(zhì)粒雙酶切）。
[0017] 圖3為miRNA的重組桿狀病毒表達(dá)載體的構(gòu)建(A:Red-pFastBacl載體與目的基因 連接后載體結(jié)構(gòu)示意圖；B:重組后基因結(jié)構(gòu)示意圖；C:Rp-let-7重組后PCR檢測(cè)結(jié)果;D:Rp-miR-100E重組后PCR檢測(cè)結(jié)果;F: RP-miR-2795重組后PCR檢測(cè)結(jié)果;A:RP-let-7-C重組后 PCR檢測(cè)結(jié)果）。
[0018] 圖4為重組桿狀病毒上清液感染Sf 9細(xì)胞后Red報(bào)告基因信號(hào)檢測(cè)(A:未處理的Sf9 細(xì)胞系(WT);B:陰性對(duì)照AcNPV感染Sf9細(xì)胞系；C-F:重組桿狀病毒Bac-let-7、Bac-miR-100、Bac-miR-2795和Bac-let-7-C上清液分別感染Sf9細(xì)胞系(各組左為白光，右為紅光））。
[0019] 圖5為桿狀病毒miRNA表達(dá)載體在細(xì)胞水平對(duì)miRNAs的過(guò)量表達(dá)。
[0020] 圖6為miRNA重組Bacmid在個(gè)體水平對(duì)miRNAs的過(guò)量表達(dá)。
【具體實(shí)施方式】
[0021]下面將結(jié)合附圖，對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。實(shí)施例中未注明具體 條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版，J.薩姆布魯克等著） 中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0022]本發(fā)明利用桿狀病毒載體是一個(gè)被廣泛應(yīng)用于真核生物的高效表達(dá)外源基因和 重組蛋白的工具，將苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(AcNPV)表達(dá)系統(tǒng)超量表達(dá)家蠶let-7簇 miRNAs，為家蠶miRNA的功能研究提供了新的工具。
[0023] 實(shí)施例1、重組Red-FastBacl報(bào)告基因載體的構(gòu)建
[0024]從11111?1^86(111^卩：//'\￥?^.111；[1^&86.0找/)下載家香161：-7(131]1〇-161：-7)、家香11111?-100(bm〇-miR-100)、家蠶miR-2795(bm〇-miR-2795)次級(jí)前體序列，具體序列分別如SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.3所示，然后從家蠶基因組數(shù)據(jù)庫(kù)SilkDB(http:// silkworm, swu· edu· cn/cgi-bin/gbrowse/silkdb/)中獲得家香let-7_C(bm〇-let_7_C)全 長(zhǎng)序列，具體序列如SEQ ID NO.4所示，從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)(http: //www.ncbi .nlm.nih. gov/)下 載珊瑚蟲的Red紅色熒光蛋白R(shí)ed基因序列，具體序列如SEQ ID NO.5所示。然后利用 primer5 · 0軟件分別設(shè)計(jì)擴(kuò)增 bm〇-let-7、bm〇-miR-100、bm〇-miR-2795、bm〇-let-7-C 和 Red 的引物口1'卜161：-7、卩1'；[-11111?-100、卩1'；[-11111?-2795、161：-7-0和1^(1，具體引物如表1所不。
[0025] 表1、pri-let-7、pri-miR-100、p;ri-miR-2795、let-7-C 和 Red 引物序列
[0026]
[0029] 以珊瑚蟲cDNA為模板，SEQIDN0.14和SEQIDN0.15為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增珊瑚蟲 Red基因片段，然后用EcoR I和Spe I雙酶切Red基因片段，回收Red酶切片段；同時(shí)用相同的 酶酶切pFastBacl質(zhì)粒，回收pFastBacl質(zhì)粒骨架，然后分別取回收的lyL pFastBacl質(zhì)粒骨 架和4yL Red酶切回收片段，用T4連接酶于16°C連接5h，獲得重組載體Red-pFastBacl，依次 經(jīng)轉(zhuǎn)化、挑斑、菌液PCR和雙酶切驗(yàn)證后，送深圳華大基因測(cè)序鑒定。結(jié)果表明克隆的珊瑚蟲 Red基因片段與SEQ ID N0.5所示序列一致，表明成功克隆了珊瑚蟲Red基因。
[0030] 以剛化蛾家香cDNA 為模板，用引物pri-let-7、pri-miR-100、pri-miR-2795和let-7_C分別擴(kuò)增miRNA初級(jí)前體序列bmo-let-7、bmo-miR-100、bmo-miR-2795和bmo-let-7-C; 50yL反應(yīng)體系為lOXEx Taq buffer 5yL，dNTP Mixture(2.5mM/L each)4yL，MgCl24yL，弓丨 物各lyL，Ex Taq(5U/yL)0.5yL，cDNA模板4yL，高壓滅菌的雙蒸水補(bǔ)至50yL;PCR擴(kuò)增條件： 94°C預(yù)變性3min ; 94°C變性30s，Tm