專利名稱：用Bac-to-Bac系統(tǒng)在家蠶內(nèi)表達(dá)人血管生長(zhǎng)因子的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)、桿狀病毒基因表達(dá)系統(tǒng)，尤其涉及一種利用Bac-to-Bac 桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)在家蠶內(nèi)表達(dá)人體內(nèi)皮血管生長(zhǎng)因子和純化的方法。
背景技術(shù)：
家蠶桿狀病毒基因表達(dá)系統(tǒng)是目前高效的真核表達(dá)系統(tǒng)之一。申請(qǐng)人利用 細(xì)菌轉(zhuǎn)座子原理構(gòu)建了專門用于家蠶的Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)(參見論 文吳小鋒，曹翠平，魯興萌。2006，利用細(xì)菌轉(zhuǎn)座子構(gòu)建適用于家蠶的Bac-to-Bac 快速基因表達(dá)系統(tǒng)。蠶業(yè)科學(xué)，32 (2): 183-188)。該系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)在于重組桿狀 病毒可以通過(guò)細(xì)菌轉(zhuǎn)座子的基因定位轉(zhuǎn)移作用，在大腸桿菌內(nèi)實(shí)現(xiàn)基因的轉(zhuǎn)移 重組，快速獲得重組病毒，構(gòu)建了可利用我國(guó)特色資源昆蟲一家蠶的Bac-to-Bac 快速基因表達(dá)系統(tǒng)。該系統(tǒng)由供體質(zhì)粒、含有家蠶桿狀病毒BmBacmid基因組 的感受態(tài)細(xì)菌DH10BmBac構(gòu)成，其產(chǎn)生重組病毒的原理是首先將外源目的 基因克隆入供體質(zhì)粒，然后將供體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入DH10BmBac感受態(tài)細(xì)胞中，通 過(guò)細(xì)菌轉(zhuǎn)座子的定點(diǎn)轉(zhuǎn)位作用，將啟動(dòng)子和目的基因一并轉(zhuǎn)入家蠶桿狀病毒基 因組而產(chǎn)生重組病毒DNA，最后轉(zhuǎn)染家蠶培養(yǎng)細(xì)胞而獲得含有目的基因重組病 毒。申請(qǐng)人嘗試?yán)迷撓到y(tǒng)快速產(chǎn)生能夠表達(dá)人體內(nèi)皮血管生長(zhǎng)因子的重組病 毒，并利用家蠶作為寄主表達(dá)何生產(chǎn)重組人體內(nèi)皮血管生長(zhǎng)因子蛋白，并利用 親和層析技術(shù)建立分離該蛋白的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明公開了一種用Bac-to-Bac系統(tǒng)在家蠶內(nèi)表達(dá)人血管生長(zhǎng)因子的方法。 主要包含兩個(gè)方面的內(nèi)容， 一個(gè)是利用Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建含有 人體內(nèi)皮血管生長(zhǎng)因子的重組病毒的方法， 一個(gè)是利用肝糖層析柱從感染的家 蠶體內(nèi)分離純化重組的蛋白質(zhì)方法。
為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案其步驟如下 1、利用Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建含有人體內(nèi)皮血管生長(zhǎng)因子的重 組病毒的方法
將人體內(nèi)皮血管生長(zhǎng)因子基因克隆入Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)配套的 供體質(zhì)粒pFastBacHT多克隆位點(diǎn)，供體質(zhì)粒為美國(guó)Invitrogene公司產(chǎn)品，使該 基因位于桿狀病毒多角體啟動(dòng)子下游，然后將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入含有家蠶桿狀病毒
BmBacmid基因組的感受態(tài)細(xì)菌DH10BmBac細(xì)胞內(nèi)，在含有抗生素的培養(yǎng)板上 培養(yǎng)13小時(shí)后，通過(guò)藍(lán)白斑篩選獲得陽(yáng)性菌斑，隨后從陽(yáng)性菌斑從抽提質(zhì)粒 DNA，該質(zhì)粒DNA即為重組病毒的基因組，將此DNA轉(zhuǎn)染入家蠶培養(yǎng)細(xì)胞 BmN， 120小時(shí)后分離培養(yǎng)基上清液，獲得含有人體內(nèi)皮血管生長(zhǎng)因子基因的重 組病毒。
2、利用肝糖層析柱從感染的家蠶體內(nèi)分離純化重組的蛋白質(zhì)方法利用注 射法將20微升上述重組病毒注射入家蠶五齡幼蟲，120小時(shí)后收集感染的家蠶 樣品，然后加入磷酸緩沖液并勻漿樣品，高速離心后取上清液，將上清液作為 提取重組人體內(nèi)皮血管生長(zhǎng)因子蛋白的原料，利用肝糖親和層析柱分離、純化 獲得相應(yīng)的蛋白質(zhì)，并通過(guò)SDS-PAGE分析純化的蛋白質(zhì)純度。
本發(fā)明具有的有益效果是利用家蠶Bac-to-Bac表達(dá)系統(tǒng)能夠快速產(chǎn)生含 有人體內(nèi)皮血管生長(zhǎng)因子基因的重組桿狀病毒，并在家蠶幼蟲內(nèi)高效表達(dá)，利 用肝糖親和層析柱實(shí)現(xiàn)重組蛋白的快速分離和純化。


附圖是供體質(zhì)粒pFastBacHT圖。
具體實(shí)施例方式
1、 研究材料家蠶Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)由申請(qǐng)人開發(fā)完成，并已 公開發(fā)表，(參見論文吳小鋒，曹翠平，魯興萌。2006，利用細(xì)菌轉(zhuǎn)座子構(gòu)建 適用于家蠶的Bac-to-Bac快速基因表達(dá)系統(tǒng)。蠶業(yè)科學(xué)，32 (2): 183-188)。供 體質(zhì)粒pFastBacHT (圖1)購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。各種限制性內(nèi)切酶、連接 酶等分子生物學(xué)操作試劑購(gòu)自日本Takara公司。人體內(nèi)皮血管生長(zhǎng)因子基因購(gòu) 自美國(guó)Clontech公司。肝糖親和層析柱Heparin Sepharose購(gòu)于美國(guó)GE公司。
2、 工作流程
將人體內(nèi)皮血管生長(zhǎng)因子基因克隆入Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)配套的 供體質(zhì)粒pFastBacHT多克隆位點(diǎn)BamHI和HindIII之間，使該基因位于桿狀病 毒多角體啟動(dòng)子下游，然后將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入含有家蠶桿狀病毒BmBacmid基因 組的感受態(tài)細(xì)菌DH10BmBac細(xì)胞內(nèi)，在添加了卡那霉素(濃度50微克/ML)、 慶大霉素(濃度35微克/ML)兩種抗生素以及半乳糖苷類似物X-Gal的培養(yǎng)板上 培養(yǎng)13小時(shí)后，通過(guò)藍(lán)白斑篩選獲得陽(yáng)性菌斑(白斑，即基因發(fā)生了插入重組)， 隨后從陽(yáng)性菌斑從抽提大質(zhì)粒DNA，該質(zhì)粒DNA即為重組病毒的基因組，將 此DNA轉(zhuǎn)染入家蠶單層培養(yǎng)細(xì)胞BmN內(nèi)，120小時(shí)后分離培養(yǎng)基上清液，獲 得含有人體內(nèi)皮血管生長(zhǎng)因子基因的重組病毒。將20微升上述重組病毒通過(guò)經(jīng)
皮注射的方式接種家蠶五齡幼蟲，然后觀察家蠶的發(fā)病情況，120小時(shí)后收集被 病毒感染的家蠶，然后以每頭家蠶2毫升的比例加入PH7.2d的磷酸緩沖液，并 采用勻漿器對(duì)樣品精心勻漿處理，再高速離心后取上清液，將上清液作為提取 重組人體內(nèi)皮血管生長(zhǎng)因子蛋白的原料。利用肝糖親和層析柱Heparin Sepharose 分離、純化獲得相應(yīng)的蛋白質(zhì)，將上述原料加入層析柱使之與樹脂結(jié)合，最后 用含有1.5M的NaCl溶液一步洗脫、分離重組的人體內(nèi)皮血管生長(zhǎng)因子蛋白。 純化的樣品利用SDS-PAGE電泳分析純化的蛋白質(zhì)純度。
根據(jù)實(shí)際結(jié)果，每頭家蠶幼蟲的產(chǎn)量估計(jì)在600微克左右。
權(quán)利要求
1、用Bac-to-Bac系統(tǒng)在家蠶內(nèi)表達(dá)人血管生長(zhǎng)因子的方法，其特征在于該方法的步驟如下1)利用Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建含有人體內(nèi)皮血管生長(zhǎng)因子基因的重組病毒的方法將人體內(nèi)皮血管生長(zhǎng)因子基因克隆入Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)配套的供體質(zhì)粒pFastBacHT多克隆位點(diǎn)，使該基因位于桿狀病毒多角體啟動(dòng)子下游，然后將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入含有家蠶桿狀病毒BmBacmid基因組的感受態(tài)細(xì)菌DH10BmBac細(xì)胞內(nèi)，在含有抗生素的培養(yǎng)板上培養(yǎng)13小時(shí)后，通過(guò)藍(lán)白斑篩選獲得陽(yáng)性菌斑，隨后從陽(yáng)性菌斑從抽提質(zhì)粒DNA，該質(zhì)粒DNA即為重組病毒的基因組，將此DNA轉(zhuǎn)染入家蠶培養(yǎng)細(xì)胞BmN，120小時(shí)后分離培養(yǎng)基上清液，獲得含有人體內(nèi)皮血管生長(zhǎng)因子基因的重組病毒；2)利用肝糖層析柱從感染的家蠶體內(nèi)分離純化重組的蛋白質(zhì)方法利用注射法將20微升上述重組病毒注射入家蠶五齡幼蟲，120小時(shí)后收集感染的家蠶樣品，然后加入磷酸緩沖液并勻漿樣品，高速離心后取上清液，將上清液作為提取重組人體內(nèi)皮血管生長(zhǎng)因子蛋白的原料，利用肝糖親和層析柱分離、純化獲得相應(yīng)的蛋白質(zhì)，并通過(guò)SDS-PAGE分析純化的蛋白質(zhì)純度。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用Bac-to-Bac系統(tǒng)在家蠶內(nèi)表達(dá)人血管生長(zhǎng)因子的方法。該方法的步驟如下利用Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建含有人體內(nèi)皮血管生長(zhǎng)因子的重組病毒；利用肝糖層析柱從感染的家蠶體內(nèi)分離純化重組的蛋白質(zhì)。本發(fā)明利用家蠶Bac-to-Bac表達(dá)系統(tǒng)能夠快速產(chǎn)生含有人體內(nèi)皮血管生長(zhǎng)因子基因的重組桿狀病毒，并在家蠶幼蟲內(nèi)高效表達(dá)，利用肝糖親和層析柱實(shí)現(xiàn)重組蛋白的快速分離和純化。
文檔編號(hào)C12N7/01GK101381726SQ20081012160
公開日2009年3月11日 申請(qǐng)日期2008年10月14日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月14日
發(fā)明者吳小鋒, 相興偉, 琳 陳 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)