專利名稱：一種用蠶生產(chǎn)抗腫瘤治療藥物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及到通過家蠶桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)用蠶幼蟲和蛹制備人內(nèi)皮抑素的方法，本發(fā)明還涉及用蠶幼蟲和蛹生產(chǎn)人內(nèi)皮抑素制備抗腫瘤治療藥物的方法。
本發(fā)明提供了含有人內(nèi)皮抑素的大腸桿菌質(zhì)粒pUC-Endo，以人肝臟組織mRNA為模板，通過RT-PCR擴(kuò)增，在5’端引物引進(jìn)BamHI酶切位點，在3’端引入XbaI位點，PCR產(chǎn)物經(jīng)Klenow酶補(bǔ)平克隆進(jìn)入pUC19的SmaI位點(寶靈曼公司)，構(gòu)建質(zhì)粒pUC-Endo。
本發(fā)明還提供了含人內(nèi)皮抑素基因的桿狀病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pBac-Endo。從pUC-Endo質(zhì)粒用BamHI和XbaI酶切，將目的片段連在同樣被BamHI和XbaI酶切的pBacPAK8上(CLONTECH公司)，構(gòu)建含人內(nèi)皮抑素基因的桿狀病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pBac-Endo(

圖1)。
本發(fā)明還提供了含人內(nèi)皮抑素基因的重組家蠶桿狀病毒BmBacEndo。將轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pBac-Endo與家蠶核型多角體病毒DNA進(jìn)行共轉(zhuǎn)染家蠶(Bombyx mori)細(xì)胞BmN，進(jìn)行10輪空斑和Southern點雜交篩選篩選出含人內(nèi)皮抑素基因的重組昆蟲桿狀病毒BmBacEndo，該病毒已提交中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保存，地址在北京中關(guān)村，保藏日期為2001年7月2日，保藏編號為GMCC NO0592。
本發(fā)明還提供了人內(nèi)皮抑素基因在家蠶五齡幼蟲和蛹中的表達(dá)產(chǎn)物。將重組桿狀病毒BmBacEndo感染BmN家蠶細(xì)胞進(jìn)行病毒擴(kuò)增，然后將擴(kuò)增后的重組桿狀病毒BmBacEndo注射至五齡家蠶幼蟲和蛹體內(nèi)，分別取24、48、72、96、120小時的家蠶幼蟲和蛹淋巴血，經(jīng)5000rpm5分鐘離心后取上清，稀釋10倍后加等體積的2×蛋白上樣緩沖液，取20ul進(jìn)行12％的SDS-PAGE分析。用考馬斯亮藍(lán)R250染色，結(jié)果見圖2。從SDS-PAGE和Wersten印跡(圖3)結(jié)果可以看出，人內(nèi)皮抑素基因在家蠶幼蟲和蛹中的表達(dá)產(chǎn)物為20kD，與天然產(chǎn)物大小一致。
本發(fā)明還對人內(nèi)皮抑素的的表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行了生物活性的鑒定。病毒感染細(xì)胞的抽提物1-5天的細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)物均表現(xiàn)出不同程度的抑制活性，到第三天達(dá)到抑制率達(dá)90.1％。取BmBacEndo注射家蠶幼蟲和蛹體表達(dá)產(chǎn)物血淋巴(第五天)2ul倍比稀釋后，加入96孔板中(每孔鋪有1×104內(nèi)皮細(xì)胞)，測定表達(dá)產(chǎn)物對內(nèi)皮細(xì)胞的抑制活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)最高的抑制率達(dá)87.3％。
本發(fā)明還提供了在家蠶幼蟲表達(dá)的人內(nèi)皮抑素進(jìn)行純化。發(fā)病5天后收集蠶血清先經(jīng)離心和硫酸銨沉淀后上Sephadex G150柱和MonoQ柱分離，每次收集樣品均經(jīng)測活，確定其活性存在，進(jìn)一步用HPLC陽離子交換柱和陰離子交換柱純化，獲得純度為95％的重組蛋白。
本發(fā)明還將家蠶幼蟲和蛹體表達(dá)人內(nèi)皮抑素制成口服藥物。在家蠶幼蟲和蛹體表達(dá)人內(nèi)皮抑素，經(jīng)過過濾(100KD超濾)，30000rmp離心后經(jīng)冷凍干燥后，以家蠶幼蟲和家蠶蛹為填充料配制成口服藥物。
本發(fā)明還對用家蠶幼蟲蠶蛹表達(dá)的人內(nèi)皮抑素進(jìn)行動物試驗。將C57小鼠荷瘤部位切開(購自浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院)，取出腫瘤，切成2mm3的均勻碎片，植入正常C57小鼠皮下，隨機(jī)分成5組?？诜o藥劑量分別為30mg/kg和10mg/kg，每天給藥，連續(xù)30天。注射給藥劑量為3mg/kg和1mg/kg，隔天給藥，連續(xù)30天，另一陰性對照，以相同體積喂水。結(jié)果如表1，在腫瘤大小給藥組和對照組有明顯差異，腫瘤抑制效果顯著，表明口服和注射藥物均具有明確的抗腫瘤作用。
綜合所述，本發(fā)明的優(yōu)點如下用蠶高效表達(dá)人內(nèi)皮抑素，可以避免直接從動物體內(nèi)純化存在的操作煩瑣、產(chǎn)率底、生產(chǎn)成本高等缺點，不會造成公害；家蠶是可以無菌大規(guī)模飼養(yǎng)經(jīng)濟(jì)昆蟲，可以低成本地大規(guī)模飼養(yǎng)；蠶體中有多種天然蛋白質(zhì)保護(hù)劑，對表達(dá)產(chǎn)物有保護(hù)作用，使基因表達(dá)產(chǎn)物十分穩(wěn)定；家蠶生產(chǎn)的蛋白可以口服藥物，為患者解除了注射的痛苦和被感染的威脅。
權(quán)利要求
1.一種用蠶生產(chǎn)抗腫瘤治療藥物的方法，其特征在于通過基因工程方法獲得重組的帶人內(nèi)皮抑素基因的家蠶(Bombyx mori)重組桿狀病毒，該病毒已提交中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保存，地址在北京中關(guān)村，保藏日期為2001年7月2日，保藏編號為CGMCC NO.0592，并用該病毒接種家蠶幼蟲和蛹進(jìn)行表達(dá)人內(nèi)皮抑素。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用蠶生產(chǎn)抗腫瘤治療藥物的方法其特征在于還包括分離，純化家蠶表達(dá)的人內(nèi)皮抑素的步驟。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種用蠶生產(chǎn)抗腫瘤治療藥物的方法，其特征在于還包括冷凍干燥家蠶表達(dá)的人內(nèi)皮抑素的步驟。。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種用蠶生產(chǎn)抗腫瘤治療藥物的方法其特征在于還包括以家蠶為填充劑制備口服藥物的步驟。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用蠶生產(chǎn)抗腫瘤治療藥物的方法，其特征在于所述的通過基因工程方法獲得重組的帶人內(nèi)皮抑素基因的家蠶(Bombyx mori)重組桿狀病毒包括人內(nèi)皮抑素基因的桿狀病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pBac-Endo的構(gòu)建是通過RT-PCR方法合成的人內(nèi)皮抑素基因片段，克隆進(jìn)入經(jīng)SmaI酶切的pUC19位點，將人內(nèi)皮抑素基因片段克隆進(jìn)入轉(zhuǎn)移載體pBacPAK-8中，獲得的重組轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒pBac-Endo。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用蠶生產(chǎn)抗腫瘤治療藥物的方法，其特征在于所述的通過基因工程方法獲得重組的帶人內(nèi)皮抑素基因的家蠶(Bombyx mori)重組桿狀病毒包括人內(nèi)皮抑素基因的重組家蠶桿狀病毒BmBacEndo的構(gòu)建是通過重組轉(zhuǎn)移載體pBac-Endo DNA與家蠶核型多角體病毒DNA進(jìn)行共轉(zhuǎn)染家蠶細(xì)胞經(jīng)10輪空斑篩選和Southern雜交斑篩選獲得重組病毒BmBacEndo。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用蠶生產(chǎn)抗腫瘤治療藥物的方法，其特征在于所述的人內(nèi)皮抑素基因在家蠶幼蟲和蛹中的表達(dá)產(chǎn)物是通過重組桿狀病毒BmBacEndo注射至五齡家蠶幼蟲和蛹體內(nèi)表達(dá)產(chǎn)生。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用蠶生產(chǎn)抗腫瘤治療藥物的方法，該方法屬于生物技術(shù)制藥工程中的基因工程生產(chǎn)多肽類藥物技術(shù)領(lǐng)域。通過家蠶桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)(Bombyx mori Nuclear polyhedrosis Virus)重組帶有人內(nèi)皮抑素基因，獲得重組病毒，該病毒已提交中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保存，地址在北京中關(guān)村，保藏日期為2001年7月2日，保藏編號為CGMCC NO.0592，將該重組病毒接種家蠶幼蟲、蛹進(jìn)行表達(dá)，經(jīng)分離純化，冷凍干燥，制成注射和口服藥物，經(jīng)動物試驗，對小鼠具有明顯的抑制腫瘤生長的作用，成為一種制備抗腫瘤的治療藥物的新型方法。與現(xiàn)有技術(shù)相比，原料易得，生產(chǎn)成本低，治療效果良好。
文檔編號C12N15/63GK1408430SQ0114214
公開日2003年4月9日 申請日期2001年9月14日 優(yōu)先權(quán)日2001年9月14日
發(fā)明者張耀洲, 金勇豐, 吳祥甫 申請人:浙江中奇生物藥業(yè)股份有限公司