專利名稱：一種廣譜、耐高溫的高比活植酸酶及其編碼基因和表達(dá)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種植酸酶及其編碼基因。本發(fā)明還涉及含有改植酸酶的表達(dá)載體和含有該表達(dá)載體的重組酵母細(xì)胞。
目前在單胃動(dòng)物如雞、豬等飼料中是添加無機(jī)磷如磷酸氫鈣來滿足動(dòng)物對(duì)磷的需求。但是在主要以植物性飼料為主的動(dòng)物日糧中本身就含有豐富的磷，只不過是因?yàn)樗鼈冎饕詣?dòng)物不能利用的植酸磷的形式存在而已。
植酸磷是谷物、豆類和油料等作物籽實(shí)中磷和肌醇的基本貯存形式，含量高達(dá)1-5％(Lolas M.Et al.Food Sci.421094-1097，1977).它占植物中總磷的60-80％(Nelson T.S.Poultry Sci.47862-871，1967).但是以植酸磷形式存在的磷卻因單胃動(dòng)物體內(nèi)缺乏能分解植酸的酶而難以被利用(Cromwell G.L.Biotechnology in the Feed Industry，Lyons T.P.ed.AlltechTechnical Publication，Nicholasville，KY，133-145)，其利用率僅在0-40％。
植酸磷不能被單胃動(dòng)物有效利用，從而在飼喂過程中造成了許多問題，第一、造成磷源浪費(fèi)。一方面飼料中的磷源不能得到有效利用，另一方面為了滿足動(dòng)物對(duì)磷的需求，又必須在飼料中額外添加無機(jī)磷，提高了飼料成本。在實(shí)際生產(chǎn)中，添加無機(jī)磷時(shí)還常因無機(jī)磷中殘留有氟、重金屬等元素而造成動(dòng)物中毒。第二、形成高磷糞便而污染環(huán)境。飼料中85％左右的植酸磷會(huì)被動(dòng)物直接排出體外，糞便中大量的磷使水和土壤受到嚴(yán)重污染。目前許多歐洲國(guó)家如荷蘭等已因此問題開始限制畜禽的養(yǎng)殖數(shù)量。我國(guó)是畜牧生產(chǎn)大國(guó)，單胃動(dòng)物占畜禽總數(shù)的比例遠(yuǎn)高于西方國(guó)家，因此，防止磷對(duì)環(huán)境的污染在我國(guó)更具有特殊的意義。第三、植酸磷還是一種抗?fàn)I養(yǎng)因子，它在動(dòng)物腸胃道的消化吸收過程中會(huì)與多種金屬離子Zn2+、Ca2+、Cu2+、Fe2+等以及蛋白質(zhì)螯合成相應(yīng)的不溶性復(fù)合物，從而降低了動(dòng)物對(duì)這些營(yíng)養(yǎng)元素的有效利用(Sharma C.B.et al.,Phytochemistry.17201-204，1978).
植酸酶(EC.3.1.3.8)是一種能水解植酸的酶類。它能將植酸磷降解為肌醇和磷酸。植酸酶廣泛存在于微生物中，如枯草芽孢桿菌(Paver，V.K.J.，Bacteriol.1511102-1108，1982)，假單孢桿菌(Cosgrove D.J.，Austral.J.Biol.Sci.231207-1220，1970)，乳酸桿菌(Shirai K.，Letters Appl.Biol.Sci.19366-369，1994)，大腸桿菌(Greiner R.，Arch Biochem.Biophys.303107-113，1993)，酵母(Nayini N.R.et al.Lebensm Wiss.Technol.1724-26，1984)，曲霉(Yamada K.et al.Agric.Biol.Chem.321275-1282，1986；Van Gorcom R.F.M.et al.，US Patent No.5436156，1995)。其中來源于A.ficuum NRRL3135(A.niger var.awamori)的植酸酶(Van Gorcom R.F.M.et al.，US Patent No.5436156，1995)具有較好的耐熱性，在酸性條件下有較高的酶活性，被認(rèn)為是目前最有應(yīng)用前景的飼用植酸酶，它的最適pH值為2.5和5.5，最適溫度為55℃，特異比酶活性為1×105U/mg酶蛋白。
植酸酶的飼喂效果已在世界范圍內(nèi)得到了確證(Ware J.H.et al.，USPatent No.3297548，1967；Nelson T.S.et al.，J.Nutrition 1011289-1294，1971；Nelson T.S.et al.，Poult Sci.471842-1848，1968)。它可使植物性飼料中磷的利用率提高60％，糞便中磷排泄量減少40％，還可降低植酸磷的抗?fàn)I養(yǎng)作用。因此對(duì)提高畜牧業(yè)生產(chǎn)效益及降低植酸磷對(duì)環(huán)境的污染有重要意義。
隨著飼料工業(yè)的發(fā)展，植酸酶已經(jīng)成為飼料添加劑和酶制劑研究的熱點(diǎn)。重點(diǎn)的研究方向之一就是解決在天然微生物中植酸酶的表達(dá)量太低，不能大量獲得廉價(jià)的植酸酶產(chǎn)品，難以滿足飼料工業(yè)發(fā)展的需求(Han，1989)。隨著生物技術(shù)、基因工程等高新技術(shù)的發(fā)展，人們意識(shí)到通過基因工程的手段，利用生物反應(yīng)器來高效表達(dá)植酸酶基因可望達(dá)到大幅度提高植酸酶產(chǎn)量、降低生產(chǎn)成本的目的(Conneely et al.，1992)。
植酸酶基因表達(dá)的研究主要集中在來源于A.niger(ficuum)的酸性植酸酶基因phyA和phyB上。如1993年在A.niger ALK02268中表達(dá)了源于A.niger var.awamori的植酸酶基因phyA，其表達(dá)量比原菌株提高了幾倍(Piddington C.S.，1993；)。同年，將來源于A.ficumm NRRL3135的phyA基因?qū)Щ卦辏筽hyA基因的拷貝數(shù)增加到15個(gè)以上，從而使植酸酶的表達(dá)量提高到7600U/mL(Van Hartingsveldt W.et al.，1993)。Moore E.等在A.oryzae中表達(dá)來源于酵母Saccharomyces cerevisiae的植酸酶基因和來源于A.niger762的phyB基因，其結(jié)果也是使表達(dá)量分別提高到840U/mL和750U/mL(Moore E.et al.，1995)。以上的這些表達(dá)研究，從總體上看，其表達(dá)水平還較低，但卻證實(shí)了利用基因工程手段來提高植酸酶的表達(dá)、生產(chǎn)量這一途徑的有效性。
1995年Van Gorcomd等(Van Gorcom R.F.M.et al.，1995)將酸性植酸酶基因phyA重組到黑曲霉中，使植酸酶在重組菌株中的表達(dá)量達(dá)到了2.8×105U/mL，與天然植酸酶產(chǎn)生菌株相比有了大幅度的提高，大大降低了植酸酶的生產(chǎn)成本。這是目前國(guó)外報(bào)道的植酸酶最高表達(dá)水平，也是國(guó)外目前植酸酶工業(yè)生產(chǎn)所采用的菌株。
1997年本實(shí)驗(yàn)室的“863”項(xiàng)目研究小組構(gòu)建的基因工程酵母在小試水平上其酸性植酸酶的表達(dá)量達(dá)到5×105U/mL(相當(dāng)于每毫升發(fā)酵液中表達(dá)5mg植酸酶蛋白)(Bin Y et al.，1998；姚斌等，1998；姚斌等，中國(guó)發(fā)明專利97121731.9，2000)，中試水平上將表達(dá)量提高到8×105U/mL發(fā)酵液，比原始的天然菌株Aspergillus niger963中的植酸酶表達(dá)量高3000倍，比國(guó)外正在用于商品化生產(chǎn)酸性植酸酶的基因工程曲霉(Van Gorcom R.F.M.et al.，1995)高一倍以上。目前已開始工業(yè)化生產(chǎn)。
植酸酶的熱穩(wěn)定性是其能在飼料中廣泛應(yīng)用的關(guān)鍵因素之一。在飼料生產(chǎn)上，飼料加工都需經(jīng)過一個(gè)制粒工藝，在制粒過程中有一個(gè)持續(xù)時(shí)間為數(shù)分鐘的高溫，溫度一般在75～93℃，飼料用酶制劑在此高溫下活性大幅度地不可逆喪失。但另一方面，飼料用酶又必須在常溫下具有較高的酶活性，因?yàn)轱暳嫌妹缸罱K的作用場(chǎng)所又是動(dòng)物正常體溫(37℃左右)的腸胃道中，這與工業(yè)上所使用的一些高溫酶不同。目前，雖已報(bào)道從嗜溫微生物中分離到幾種高溫植酸酶，如Myceliophthora thermophila、Aspergillus terreus等中植酸酶，其最適溫度在70～80℃，具有很好的耐溫性，但它在37℃下的酶活性極低，在飼料中沒有使用價(jià)值，而相反，來源于A.niger等的植酸酶在37℃下具有高酶活性，但它又不能經(jīng)受制粒時(shí)的高溫。目前還未曾報(bào)道過同時(shí)具備了耐短暫的制粒高溫、又能在動(dòng)物正常體溫下具有高酶活性這雙重性質(zhì)的優(yōu)良植酸酶。目前生產(chǎn)上使用的植酸酶均是來源于A.niger的不耐熱的植酸酶，在70℃以上制粒時(shí)，絕大部分酶活性不可逆地喪失，因而它只能應(yīng)用于不需制粒的粉料飼料中而不能應(yīng)用于顆粒飼料中。
以往的研究主要集中在用于單胃畜禽動(dòng)物飼料中的植酸酶，如來源于酵母Saccharomyces cerevisiae(Bajwa et al.，1984；Meyhack et al.，1982)、Aspergillus niger(MacRae，1988)、A.terreus和Myceliophthorathermophila(Van Loon，1995)、A.niger(ficuum)(Van Hartimgsveldt et al.，1993；Ehlich et al.，1993；Bin Y et al.，1998)、A.niger var.awamori(Piddington et al.，1993)、Talaromyces thermophilus(Pasamontes Let al.，1997)、Talaromyces lanuginosus(Berka R M et al.，1998)、Emericellanidulans(Pasamontes L et al.1997)、Schwanniomyces occidentalis(Mochizuki，1998)等的植酸酶。而這些植酸酶在pH6.5以上基本沒有酶活性。
單胃畜禽和淡水魚類飼料中都需要使用植酸酶，但它們對(duì)植酸酶的性質(zhì)有不同的要求。對(duì)單胃畜禽而言，植酸酶的主要作用場(chǎng)所是單胃動(dòng)物酸性的胃中，因而要求植酸酶在酸性條件下要有較高的酶活性，即酶反應(yīng)的最適pH值為酸性的植酸酶，如國(guó)外目前商品化生產(chǎn)的來源于A.ficuum NRRL3135(A.niger var.awamori)的植酸酶PHYA(Van Gorcom etal.，1995)，它的最適pH值為2.5和5.5。我國(guó)用基因工程酵母生產(chǎn)的植酸酶PHYA2最適pH值為1.8和5.5(姚斌等，中國(guó)發(fā)明專利97121731.9，2000)。
而對(duì)于淡水養(yǎng)殖的主要魚類—鯉科魚類來說，它無胃，只有pH值呈中性(pH6.5～8.0)的腸道，因而在魚類飼料中必需使用在中性pH值條件下有高活性的植酸酶。目前商品化生產(chǎn)的用于單胃畜禽的植酸酶在中性pH值環(huán)境下基本沒有酶活性，因而不能用于鯉科魚類飼料。1998年Kerovuo等曾報(bào)道篩選到一株產(chǎn)植酸酶的芽孢桿菌，并克隆了其編碼基因。這一植酸酶最適pH為7.5，基因全長(zhǎng)1203bp，編碼400個(gè)氨基酸。此植酸酶的酶活性必需嚴(yán)格依賴高濃度Ca2+的存在，使其應(yīng)用前景受到限制。同時(shí)，它在pH6.0以下基本沒有活性，不能應(yīng)用于單胃動(dòng)物飼料中。到目前為至，還未有在酸性和中性環(huán)境下均具有高酶活性的廣譜pH植酸酶的報(bào)道。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種編碼本發(fā)明的植酸酶的DNA分子。所述的DNA分子可以具有SEQ ID NO1的核苷酸序列。
本發(fā)明篩選到一種天然菌株，它所產(chǎn)生的植酸酶具有好的熱穩(wěn)定性，同時(shí)它在常溫下又具有高酶活性，即耐高溫的中溫型植酸酶(酶反應(yīng)的最適溫度在中溫)。本發(fā)明篩選到天然菌株是一株曲霉Aspergillus sp.，它所產(chǎn)生的植酸酶PHYA3的最適溫度為55℃，為中溫型植酸酶，同時(shí)，此酶在80～90℃下處理30分鐘后冷卻到常溫，能夠可逆性地恢復(fù)其酶活性的85％以上，具有很好的耐熱性。這種性質(zhì)使其具備了既能耐受飼料制粒的高溫又能在動(dòng)物體內(nèi)常溫的環(huán)境下維持高的酶活性這雙重性質(zhì)，這種性質(zhì)的植酸酶還未曾有過報(bào)道。如國(guó)外目前商品化生產(chǎn)的來源于A.ficuumNRRL3135(A.niger var.awamori)的植酸酶PHYA(Van Gorcom etal.，1995)、我國(guó)用基因工程酵母生產(chǎn)的植酸酶PHYA2(姚斌等，中國(guó)發(fā)明專利97121731.9，2000)等的最適溫度雖在55℃左右，但70℃以上處理后酶活性不可逆地喪失。而報(bào)道的來源于Myceliophthora thermophila、Aspergillus terreus等中的植酸酶，雖具有較好的耐熱性，但其最適溫度在70～80℃，在常溫下的酶活性極低，在飼料中沒有使用價(jià)值。
本發(fā)明篩選到的曲霉Aspergillus sp.所產(chǎn)生的植酸酶PHYA3的最適pH峰較寬且平，為5.5～7.5，同時(shí)在pH3～8的范圍內(nèi)均具有高的酶活性。這種性質(zhì)使其具備了既能應(yīng)用于單胃動(dòng)物飼料有能應(yīng)用于淡水魚類飼料中，這種廣譜的植酸酶還未曾有過報(bào)道。例如，國(guó)外目前商品化生產(chǎn)的來源于A.ficuum NRRL3135(A.niger var.awamori)的植酸酶PHYA(VanGorcom et al.，1995)的最適pH為5.5和2.5，在pH6以上基本沒有活性，只能應(yīng)用于單胃動(dòng)物飼料中而不能用于淡水魚類飼料中，而報(bào)道的來源于芽孢桿菌的植酸酶(Kerovuo，1998)是唯一一個(gè)其最適pH在中性(7.5)的植酸酶，但它又不能用于單胃動(dòng)物飼料中。
本發(fā)明篩選到的曲霉Aspergillus sp.所產(chǎn)生的植酸酶PHYA3的比活性達(dá)到了310000U/mg酶蛋白，比國(guó)外目前商品化生產(chǎn)的來源于A.ficuumNRRL3135(A.niger var.awamori)的植酸酶PHYA(Van Gorcom etal.，1995)、我國(guó)用基因工程酵母生產(chǎn)的植酸酶PHYA2(中國(guó)發(fā)明專利97121731.9，2000)等的比活性高2～3倍。
本發(fā)明通過PCR的方法分離克隆了這一植酸酶基因phyA3，DNA全序列分析結(jié)果表明，phyA3結(jié)構(gòu)基因全長(zhǎng)1455個(gè)核苷酸，其中+48～+104的57個(gè)核苷酸序列是一典型的真菌內(nèi)含子序列。phyA3基因編碼465個(gè)氨基酸，N端的25個(gè)氨基酸為信號(hào)肽。從氨基酸推斷出的理論分子量約為60kDa。來源于曲霉的中性植酸酶是一糖基化蛋白，在phyA3編碼的氨基酸序列上，發(fā)現(xiàn)了7個(gè)潛在的N-糖基化位點(diǎn)(Asn-X-Ser/Thr，X為任意氨基酸)。通過對(duì)氨基酸序列進(jìn)行分析，推斷出植酸酶的活性位點(diǎn)序列(Active-site sequence)為CRITLVQVLSRHGARYPTSSKSK，它位于氨基酸序列的+70～+92。RHGERYPS是不同微生物來源的植酸酶活性位點(diǎn)中最保守的序列(Ullah，1993)，其中核心序列RHGRYPT高度保守。
此植酸酶蛋白與來源于絲狀真菌的植酸酶在氨基酸序列上有一定的同源性，與曲霉來源的植酸酶同源性較高，其中與來源于Aspergillusniger(ficuum)的PHYA(Van Gorcom R F M et al.，1995)同源性最高，為66％。與細(xì)菌來源的植酸酶無同源性。
本發(fā)明的植酸酶可通過PCR技術(shù)、定點(diǎn)突變技術(shù)、基因設(shè)計(jì)后化學(xué)合成等技術(shù)來改造，使用表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)?？蛇x擇的表達(dá)系統(tǒng)包括低等真核表達(dá)系統(tǒng)如酵母、絲狀真菌等；原核表達(dá)系統(tǒng)大腸桿菌、芽孢桿菌、乳酸桿菌、桿狀病毒等；高等真核表達(dá)系統(tǒng)如玉米、大豆、水稻、豬、雞、鴨及各種魚類和昆蟲等。本發(fā)明中，為了使植酸酶基因能在畢赤酵母中高效表達(dá)，我們通過PCR的方法將植酸酶基因phyyA3原有的信號(hào)肽序列和內(nèi)含子除掉，改造后的植酸酶基因插入到帶有α-因子信號(hào)肽序列的酵母表達(dá)載體上，經(jīng)轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞后，穩(wěn)定整合到酵母染色體上，此重組酵母經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)后，表達(dá)的植酸酶蛋白在信號(hào)肽的引導(dǎo)下分泌到培養(yǎng)基中。經(jīng)測(cè)定，植酸酶表達(dá)量達(dá)到520000U/mL，其表達(dá)水平是原始菌株A.sp.高4000倍，也比國(guó)際表達(dá)水平最高的專利(Van Gorcom R.F.M.et al.，Patent No.US 5436156，1995)所報(bào)道的高近一倍。
本發(fā)明提供了使改造后的植酸酶基因在表達(dá)系統(tǒng)中高效表達(dá)的具體方法。包括整套重組表達(dá)載體的構(gòu)建、受體菌的遺傳轉(zhuǎn)化方法、重組子的篩選與分子鑒定方法以及重組子中植酸酶的表達(dá)方法。本發(fā)明采用畢赤酵母(P.pastoris)做為植酸酶基因的表達(dá)受體，是因?yàn)榕cVan Gorcom R.F.M.等的專利(Patent No.US 5436156，1995)所采用的宿主菌霉菌相比，畢赤酵母具有很多方面的優(yōu)勢(shì)，第一，霉菌的生長(zhǎng)繁殖周期比畢赤酵母長(zhǎng)很多，生物體生長(zhǎng)周期長(zhǎng)是生物工程的大忌；第二，霉菌的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)是通過菌絲體尖端的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)實(shí)現(xiàn)的，這種生長(zhǎng)特性尤其適合固體培養(yǎng)，而并不適合現(xiàn)代發(fā)酵工藝所常用的液態(tài)發(fā)酵，一般而言固體發(fā)酵工效低，周期長(zhǎng)，成本高，由此使獲得大量發(fā)酵產(chǎn)品的成本比之液態(tài)發(fā)酵要增加很多。相比之下，畢赤酵母是通過裂殖而增加營(yíng)養(yǎng)體的，這種繁殖特性十分適合液態(tài)發(fā)酵；第三，霉菌營(yíng)養(yǎng)體在生長(zhǎng)發(fā)育期間需要提供足夠的較復(fù)雜的碳氮有機(jī)養(yǎng)分，這也會(huì)增加發(fā)酵成本，畢赤酵母營(yíng)養(yǎng)體的生長(zhǎng)發(fā)育主要利用廉價(jià)的簡(jiǎn)單養(yǎng)分如甲醇、葡萄糖和氨水等，獲得同等量的營(yíng)養(yǎng)體畢赤酵母比霉菌消耗的養(yǎng)分要便宜得多。酵母的高細(xì)胞密度、低成本發(fā)酵方法已經(jīng)建立(Siegel R.S.，Biotechnol.Bioeng，34403-404，1989)，發(fā)酵培養(yǎng)基中所使用的碳源、氮源、鹽、微量元素和生物素等都很便宜；第四，霉菌特有的霉味會(huì)降低牲畜的適口性，而畢赤酵母發(fā)酵產(chǎn)生的一種醬香味具有良好的誘食作用；第五，畢赤酵母含有多種大量的促進(jìn)生長(zhǎng)的有機(jī)化合物，如低聚糖、核苷酸、各種氨基酸、短肽等，這些優(yōu)勢(shì)都是霉菌比不上的或所不具有的；第六，在真核生物表達(dá)系統(tǒng)中，酵母，包括畢赤酵母在內(nèi)無疑是研究得最為詳透的，在進(jìn)行分子生物學(xué)操作時(shí)，酵母比霉菌更為容易、方便和有效。到目前為止，我們還未見到有利用酵母表達(dá)、生產(chǎn)植酸酶的報(bào)道，但酵母作為一種良好的真核表達(dá)系統(tǒng)已成功地高效表達(dá)出許多具有生物活性的外源基因產(chǎn)物，如1989年報(bào)道的在酵母中表達(dá)了具有全部生物性活性的溶菌酶(Diyan M.E.，Bio/Tech.7160-164，1989)，其表達(dá)量達(dá)到了550mg/L發(fā)酵液。又如，鼠表皮生長(zhǎng)因子也在酵母中得到了高效表達(dá)，其表達(dá)量達(dá)到450mg/L。第七、畢赤酵母本身具有很好的安全性，曾作為單細(xì)胞蛋白廣泛應(yīng)用，酵母培養(yǎng)基中不含有毒物質(zhì)和致熱源，所以重組酵母表達(dá)的植酸酶就可以不用分離純化而能直接以酵母培養(yǎng)物的形式添加到飼料中，可降低植酸酶的生產(chǎn)成本；第八、表達(dá)的植酸酶在信號(hào)肽的引導(dǎo)下會(huì)分泌到培養(yǎng)基中，這使植酸酶直接暴露出來而無需破碎酵母菌體，也為把包含植酸酶的酵母培養(yǎng)物直接作為飼料添加劑提供了可能；以上這些優(yōu)勢(shì)都是利用黑曲霉做為植酸酶表達(dá)受體(Van Gorcom R.F.M.et al.，Patent No.US 5436156，1995)所不具備的，它為利用重組酵母工業(yè)化大規(guī)模、低成本發(fā)酵生產(chǎn)植酸酶奠定了基礎(chǔ)。
本發(fā)明還提供了重組的植酸酶基因工程菌株的高密度發(fā)酵、植酸酶蛋白大量產(chǎn)生的方法，為植酸酶工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。本發(fā)明提供的以葡萄糖為碳源、氨水為氮源、葡萄糖—甲醇(均為廉價(jià)的工業(yè)原料)混合飼喂的菌體高密度發(fā)酵方法，使用通用的發(fā)酵裝置即可，與國(guó)外以曲霉為生產(chǎn)菌株的發(fā)酵方法(Van Gorcom R.F.M.et al.，Patent No.US5436156，1995)相比，在發(fā)酵原料、發(fā)酵時(shí)間及最終的發(fā)酵產(chǎn)物植酸酶的量上均有所不同(表2)，在發(fā)酵原料的成本上，本發(fā)明全為較廉價(jià)的工業(yè)原料，而曲霉發(fā)酵時(shí)還需有甘露-葡聚糖、酵母提取物、水解酪蛋白等天然有機(jī)提取物，因而本項(xiàng)目的原料成本將比曲霉發(fā)酵低得多；發(fā)酵時(shí)間本項(xiàng)目為108-132小時(shí)，曲霉發(fā)酵為140-200個(gè)小時(shí)，在發(fā)酵過程中的能源消耗上本發(fā)明也有優(yōu)勢(shì)。而發(fā)酵的植酸酶產(chǎn)量(指單位體積發(fā)酵液中植酸酶產(chǎn)量)本項(xiàng)目要高出約一倍左右。再加上本發(fā)明生產(chǎn)的植酸酶無需純化而可以直接以酵母培養(yǎng)物的形勢(shì)做為添加劑，因而總的來說，本發(fā)明要比國(guó)外用基因工程曲霉來生產(chǎn)植酸酶(Van Gorcom R.F.M.et al.，USPatent No.5436156，1995)更有優(yōu)勢(shì)。
本發(fā)明分離了一種比活性高、耐熱性好而在常溫下具有高酶活性、同時(shí)適合于在單胃動(dòng)物和淡水魚類飼料中使用的新的植酸酶，并進(jìn)一步克隆了其編碼基因。提供了一種在真核表達(dá)系統(tǒng)中高效表達(dá)植酸酶基因的方法。提供了一種利用重組表達(dá)系統(tǒng)廉價(jià)發(fā)酵生產(chǎn)植酸酶的方法。
圖8phyA3中信號(hào)肽編碼序列的和內(nèi)含子序列的去除過程圖9重組酵母表達(dá)載體pFY02的物理圖譜

圖10重組酵母的Sourthern blotting分析1.受體酵母P.pastoris GS115；2，3，4，5分別為重組子P.Pastoris pFY02-8，44，95，147(Sal I酶切)，分別出現(xiàn)1、2、2、1條特異性雜交帶6，7，8，9分別為酵母重組子P.pastoris pFY02-8，44，95，147(EcoRI酶切)，均在1.3kb處出現(xiàn)一條特異性雜交帶特異性雜交帶；圖11重組酵母的Northern blotting分析1.受體酵母P.pastoris GS115；2，3，4.分別為酵母重組子P.pastorispFY02-44，95，147，在約2.0kb處出現(xiàn)一條圖12在搖床水平上重組酵母植酸酶表達(dá)量與誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間的關(guān)系圖13在5L發(fā)酵罐中3批次高細(xì)胞密度發(fā)酵時(shí)表達(dá)產(chǎn)物植酸酶的積累與誘導(dǎo)時(shí)間的關(guān)系圖14.在5L發(fā)酵罐中不同誘導(dǎo)時(shí)間所積累的植酸酶的SDS-PAGE1-7分別為誘導(dǎo)后12、24、36、48、60、72、96小時(shí)；8為標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量
2.酶與試劑盒限制性內(nèi)切酶、連接酶、Taq酶、Mung bean酶為Boehringer公司產(chǎn)品。T7DNA sequence kit購于Pharmacia公司。In vitromutagenesis systems Kit、隨機(jī)引物標(biāo)記Kit和PCR Kit均購于Promega公司。
3.生化試劑DNA合成試劑為Milipore公司產(chǎn)品。引物合成用ABI公司Cyclone DNA合成儀。IPTG、X-Gal、SDS及植酸鈉為Sigma公司產(chǎn)品。TEMED、過硫酸銨、丙烯酰胺及甲叉雙丙烯酰胺為Promega公司產(chǎn)品。
4.培養(yǎng)基黑曲霉生長(zhǎng)培養(yǎng)基為PDA(20％馬鈴薯、2％蔗糖、2％瓊脂)；黑曲霉產(chǎn)酶篩選培養(yǎng)基為AS(0.1％植酸鈣、3％葡萄糖、0.5％NH4NO3、0.05％KCl、0.05％MgSO4.7H2O、0.03％MnSO4.4H2O、0.03％FeSO4.7H2O、1.5％瓊脂，pH5.7)；黑曲霉產(chǎn)酶培養(yǎng)基為AP(1.5％葡萄糖、0.3％蛋白胨、0.2％(NH4)2SO4、0.05％MgSO4.7H2O、0.05％KCl、0.003％FeSO4.7H2O、0.003％MnSO4.4H2O，pH5.7)。大腸桿菌培養(yǎng)基為L(zhǎng)B(1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl，pH7.0)。酵母完全培養(yǎng)基為YPD(1％酵母提取物、2％蛋白胨、2％葡萄糖)；酵母轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基為RDB[18.6％山梨醇、2％葡萄糖、1.34％Yeast Nitrogen Base W/O aminoacids(YNB)、0.00004％Biotin、0.005％谷氨酸、0.005％甲硫氨酸、0.005％賴氨酸、0.005％亮氨酸、0.005％異亮氨酸、2％瓊脂糖)]；酵母選擇培養(yǎng)基為MM(1.34％YNB、0.00004％Biotin、0.5％甲醇、1.5％瓊脂糖)和MD(1.34％YNB、0.00004％Biotin、2％葡萄糖、1.5％瓊脂糖)；酵母誘導(dǎo)培養(yǎng)基BMGY[1％酵母提取物、2％蛋白胨、1.34％YNB、0.00004％Biotin、1％甘油(V/V)]和BMMY(除以0.5％甲醇代替甘油，其余成份相與BMGY相同)。重組酵母發(fā)酵培養(yǎng)基為10×Basal Salts(2.67％磷酸、0.093％硫酸鈣、1.82％硫酸鉀、1.49％硫酸鎂、0.413％氫氧化鉀、4％甘油或葡萄糖)；發(fā)酵中所用的微量鹽溶液PTM1(0.6％硫酸銅、0.008％碘化鈉、0.3％硫酸錳、0.02％鉬酸鈉、0.002％硼酸、0.05％氯化鈷、2％氯化鋅、6.5％硫酸亞鐵、0.025％生物素、0.5％硫酸)。
實(shí)驗(yàn)二本實(shí)驗(yàn)說明產(chǎn)生植酸酶的天然菌株的篩選程序。
土樣按常規(guī)稀釋后涂布于PDA平板上，28℃培養(yǎng)3～5天，待菌落出現(xiàn)后，挑取菌落轉(zhuǎn)接到篩選平板AS上，28℃培養(yǎng)3天。能產(chǎn)生并分泌植酸酶的菌株將會(huì)分解篩選平板中的不溶性植酸鈣，形成透明消解圈(圖1)。挑取產(chǎn)生透明消解圈的菌株接種于5mL液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基AP中，28℃搖振培養(yǎng)2天，按1％接種量轉(zhuǎn)接到50mL產(chǎn)酶培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)3天。濾去菌體，上清液用來進(jìn)行酶活測(cè)定。測(cè)定方法為0.2mL的酶稀釋液加入0.8mL 1.25mmol/L的植酸鈉，37℃保溫30min，加入1mL 10％TCA終止酶活反應(yīng)，然后加入2mL硫酸亞鐵-鉬酸銨顯色液，700nm測(cè)定無機(jī)磷含量。對(duì)照為先在0.2mL的酶稀釋液中加入1mL 10％TCA使酶滅活，再加入同體積的底物保溫。一個(gè)酶活性單位(U)定義為在一定條件下，每分鐘釋放出1nmol無機(jī)磷所需酶量為一個(gè)酶活性單位。篩選到的菌株經(jīng)初步鑒定為曲霉，定名為Aspergillus sp.98。
實(shí)驗(yàn)三本實(shí)驗(yàn)說明植酸酶的純化程序。
含植酸酶的培養(yǎng)液離心去除菌體后用85％硫酸胺沉淀濃縮，純化用KTA FPLC快速液相色譜儀(Pharmacia公司)純化。含酶的濃縮液首先用HiPrep_26/10_Desalting柱脫鹽，緩沖液為20mmol/L HAc-NaAc(pH5.0)，流速為5mL/min，收集洗脫峰，接著用離子交換柱Hitrip_SP_Sepharose_XL(5mL)分離，A泵為20mmol/L HAc-NaAc(pH5.0)，B泵為1mol/L NaCl、20mmol/L HAc-NaAc(pH5.0)高鹽緩沖液，流速為2mL/min，高鹽緩沖液從0～100％梯度洗脫10個(gè)柱床，分部收集洗脫峰，通過酶活性測(cè)定后的洗脫峰進(jìn)一步用凝膠柱Superdex 75 HR 10/30純化，緩沖液同樣為20mmol/L HAc-NaAc(pH5.0)，流速為0.5mL/min，收集洗脫峰得到純蛋白。通過FPLC快速液相色譜儀純化后的植酸酶蛋白樣品在SDS-PAGE上為一單一條帶，其N端的氨基酸序列測(cè)定為S-K-S-C-D-T-V-D-L…。
實(shí)驗(yàn)四本實(shí)驗(yàn)說明植酸酶的酶學(xué)性質(zhì)研究程序。
通過FPLC快速液相色譜儀純化后的植酸酶蛋白用來進(jìn)行詳細(xì)的酶學(xué)性質(zhì)研究。
最適pH的測(cè)定為底物植酸鈉用一系列不同pH值的緩沖液(pH2.0、2.5、3.0、3.5的HCl-Gly緩沖液；pH4.0、4.4、5.0、5.5、5.8的HAc-NaAc緩沖液；pH6.0、6.5的咪唑-HCl；pH7.0、7.5、8.0、9.0的Tris-HCl緩沖液)配制，37℃下在這些不同的緩沖體系中進(jìn)行酶促反應(yīng)，測(cè)定酶活性。結(jié)果(圖2)表明，其最適pH峰較寬且平，5.5～7.5的較大的范圍內(nèi)均有80％以上的酶活性。另外在pH3～8的范圍內(nèi)，植酸酶均具有約50％以上的酶活性。
植酸酶的酸堿穩(wěn)定性測(cè)定為植酸酶蛋白在一系列不同pH值的緩沖液中37℃保溫30分鐘后，稀釋后再在37℃、pH6.5的標(biāo)準(zhǔn)緩沖體系中進(jìn)行酶促反應(yīng)。結(jié)果(圖3)表明，在pH2～9的范圍內(nèi)，植酸酶具有很好的酸堿穩(wěn)定性。
酶促反應(yīng)在pH6.5、不同溫度下保溫所測(cè)定的植酸酶PHYA3的最適溫度(圖4)表明，它的最適溫度為55℃。
植酸酶的熱穩(wěn)定性測(cè)定是將酶在80℃、90℃下保溫不同時(shí)間再在37℃、pH6.5下測(cè)定其酶活性，結(jié)果(圖5)表明，80℃、90℃下處理5分鐘后，植酸酶的剩余酶活性分別為原酶活性的88％和86％，處理30分鐘，剩余酶活性還有85％和81.8％，再延長(zhǎng)處理時(shí)間至60分鐘，80℃處理的酶活性變化不大，還在80％以上，90℃處理的也還在60％以上，具有很好的熱穩(wěn)定性。
取定量純化后的植酸酶蛋白，進(jìn)行酶活性測(cè)定，計(jì)算出酶的比活性為310000U/mg。
以上結(jié)果表明，植酸酶PHYA3在酸性和中性較寬的pH范圍內(nèi)均具有高酶活性，并且具有很好的耐熱性而最適反應(yīng)溫度又在55℃的中溫，具有適合于在單胃動(dòng)物和淡水魚類飼料中使用的優(yōu)良特性，同時(shí)，它的比活性高達(dá)310000U實(shí)驗(yàn)五本實(shí)驗(yàn)說明從Aspergillus sp.98中克隆植酸酶基因phyA3的程序。
菌株Aspergillus sp.98總DNA的提取采用中性裂解法，及菌株培養(yǎng)5天后收集菌絲，用液氮冷凍菌絲并研磨成粉狀，10mg菌絲中加入10mLSDS-TE緩沖液(4％SDS、10mmol/LTris、0.1mmol/LEDTA，pH8.0)在室溫下裂解5min，用等體積的酚、酚—氯仿、氯仿依次抽提，乙醇沉淀。
對(duì)已報(bào)道的來源于曲霉的不同植酸酶基因序列(Kenneth，1993；Piddington，1993；)進(jìn)行比較，設(shè)計(jì)合成克隆植酸酶基因所需的PCR引物P1和P2P15’TCGAATTCAACCCTAATTGTCGGTATC 3’P25’CTGAATTCCTATTGGAGTATAGCATAA 3’這兩段引物序列都設(shè)計(jì)在植酸酶結(jié)構(gòu)基因序列之外，引物上設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)均為EcoRI。以Aspergillus sp.98的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增出的約1.5kb的DNA片斷用EcoRI酶切后通過瓊脂糖凝膠電泳回收純化，與經(jīng)EcoRI酶切的載體pUC18于15℃連接過夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coli DH5a，LB培養(yǎng)基上涂板后挑選陽性重組子，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，得到重組質(zhì)粒pYB-1(圖6)。
通過DNA全序列分析，測(cè)定了植酸酶基因的完整DNA序列(圖7)。phyA3結(jié)構(gòu)基因全長(zhǎng)1455個(gè)核苷酸，其中+48～+104的57個(gè)核苷酸序列是一典型的真菌內(nèi)含子序列，其上有真菌內(nèi)含子的特征保守序列Donor序列、Lariat序列及Acceptor序列(Rambosek，1987)。phyA3基因編碼465個(gè)氨基酸，根據(jù)信號(hào)肽序列的結(jié)構(gòu)規(guī)則(Von Heijne，1986)推斷，N端的25個(gè)氨基酸為信號(hào)肽，信號(hào)肽的切割位點(diǎn)在+25位的Gly之后，這與我們測(cè)定的植酸酶成熟蛋白的N端序列相一致。這同時(shí)也從一個(gè)側(cè)面說明克隆到的這個(gè)基因是我們擬分離的目的基因。
來源于曲霉的植酸酶是一糖基化蛋白，在phyA3編碼的氨基酸序列上，發(fā)現(xiàn)了7個(gè)潛在的N-糖基化位點(diǎn)(Asn-X-Ser/Thr，X為任意氨基酸)。從氨基酸推斷出的理論分子量約為60kDa。通過對(duì)氨基酸序列進(jìn)行分析，推斷出植酸酶的活性位點(diǎn)序列(Active-site sequence)為CRITLVQVLSRHGARYPTSSKSK，它位于氨基酸序列的+70～+92。RHGERYPS是不同微生物來源的植酸酶活性位點(diǎn)中最保守的序列(Ullah，1993)，其中核心序列RHGARYPT高度保守。
植酸酶基因phyA3中G+C含量達(dá)到56％，密碼子第三位堿基的G+C含量更高達(dá)70.6％，在密碼子第三位堿基上高頻使用G和C堿基是曲霉中高表達(dá)蛋白編碼序列所具有的特征之一(Lloyd，1991)。
植酸酶蛋白與來源于絲狀真菌的酸性植酸酶在氨基酸序列上有一定的同源性，與曲霉來源的酸性植酸酶同源性較高，其中與來源于Aspergillus niger(ficuum)的PHYA(Van Gorcom R F M et al.，1995)同源性最高，為66％。與細(xì)菌來源的植酸酶無同源性。
實(shí)驗(yàn)六本實(shí)驗(yàn)說明植酸酶基因phyA3的改造程序。
為了使phyA3能在酵母中順利異源表達(dá)，本研究去掉了phyA3中信號(hào)肽編碼序列和內(nèi)含子序列，具體方法為，參照信號(hào)肽編碼序列之后的核苷酸序列合成一個(gè)23個(gè)堿基的寡聚核苷酸片斷P3(5’GCGAATTCATGTCCAAGTCCTGC 3’)作為PCR引物，另一引物(5’TCGAATTCTCAACTAAAGCACTC 3’)參照phyA3的3’端序列合成。由于內(nèi)含子序列是包含在信號(hào)肽編碼序列之中，所以用這對(duì)引物通過PCR的方法擴(kuò)增到的phyA3基因就是除去信號(hào)肽編碼序列和內(nèi)含子序列的完整的植酸酶結(jié)構(gòu)基因編碼序列。擴(kuò)增出的DNA片斷用引物上設(shè)計(jì)的EcoRI酶切后插入到載體pUC18的EcoRI位點(diǎn)上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后篩選陽性重組子。這樣就將無信號(hào)肽編碼序列和內(nèi)含子序列的phyA3基因克隆到了pUC18上，得到重組質(zhì)粒pYB-2，通過序列測(cè)定證實(shí)其序列的正確性(圖8)。
實(shí)驗(yàn)七本實(shí)驗(yàn)說明phyA3在酵母表達(dá)載體上的構(gòu)建程序。
用于構(gòu)建酵母表達(dá)載體的質(zhì)粒是pFY01(帶有α-因子分泌信號(hào))。首先將植酸酶基因插入到上述表達(dá)載體的信號(hào)肽序列的下游，與信號(hào)肽形成正確的閱讀框架，然后通過載體與酵母P.pastoris染色體基因組之間的同源重組事件使目的基因穩(wěn)定整合到酵母染色體上。具體的過程是將去除內(nèi)含子和信號(hào)肽編碼序列的植酸酶基因phyA3用EcoRI從質(zhì)粒pYB-2上酶切下后，電泳回收約1.3Kb的DNA片段，再將它們插入到載體pFY01上的EcoRI位點(diǎn)，得到了用于酵母轉(zhuǎn)化的重組表達(dá)載體—pFY02(圖9)。這樣就將帶有α-因子分泌信號(hào)的植酸酶基因克隆到了AOX1啟動(dòng)子(Cregg，1988；Tschopp，1987)下游。
實(shí)驗(yàn)八本實(shí)驗(yàn)是說明酵母轉(zhuǎn)化及篩選重組酵母株系的程序。
質(zhì)粒pFY02的DNA經(jīng)DraI酶切后電擊轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞后，通過體內(nèi)重組，目的基因?qū)⒄系绞荏w酵母基因組中。在外源誘導(dǎo)物甲醇存在的條件下，AOX1啟動(dòng)子可以啟動(dòng)其下游基因的表達(dá)，并且信號(hào)肽可以指導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)入酵母的分泌途徑，經(jīng)過切割，外源蛋白產(chǎn)物最終分泌至胞外，所產(chǎn)生的植酸酶PHYA3氨基酸序列按設(shè)計(jì)應(yīng)與天然存在的成熟植酸酶完全相同。外源蛋白經(jīng)過這樣的代謝途徑，可以進(jìn)行翻譯后修飾，例如糖基化等，從而得到具有生物活性的蛋白產(chǎn)物。
首先用2～3倍過量的內(nèi)切酶DraI消化質(zhì)粒pFY02的DNA，使之線性化，電泳檢測(cè)酶切是否完全。用酚抽提，乙醇沉淀，70％乙醇洗兩次，冷凍干燥，無菌水溶解，取1～5μgDNA轉(zhuǎn)化畢赤酵母細(xì)胞，在RDB固體培養(yǎng)基上涂板，每板涂0.1mL，30℃下將培養(yǎng)皿倒置培養(yǎng)至轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)。
轉(zhuǎn)化子可在基本培養(yǎng)基RDB(不含His)上生長(zhǎng)，而非轉(zhuǎn)化子不能生長(zhǎng)，這是因?yàn)槭荏w菌GS115為組氨酸缺陷型，而載體上雖然帶有his4基因，但沒有酵母復(fù)制子，所以載體上的his4基因必須整合進(jìn)酵母基因組中才能表達(dá)。另外，由于重組的酵母細(xì)胞中AOX1基因受到破壞，所以它就不能再利用甲醇作為碳源。這樣，在以甲醇作為唯一碳源的培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)化子就不會(huì)生長(zhǎng)(或者生長(zhǎng)極緩慢)，表現(xiàn)為甲醇利用缺陷型(mut-)。
用無菌牙簽從轉(zhuǎn)化平板RDB上挑取his+重組子，首先接種到MM固體培養(yǎng)基上，再接種到MD固體培養(yǎng)基上，如此挑取his+重組子，30℃培養(yǎng)2天。篩選在MD平板上生長(zhǎng)正常但在MM平板上有一點(diǎn)生長(zhǎng)或完全不生長(zhǎng)的克隆子(his+mut-)即為陽性克隆子。
為了篩選得到高表達(dá)的重組酵母菌株，直接檢測(cè)誘導(dǎo)培養(yǎng)基中植酸酶的表達(dá)情況。將his+mut-轉(zhuǎn)化子首先在BMGY培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待其生長(zhǎng)至飽和狀態(tài)，離心棄BMGY，換入誘導(dǎo)培養(yǎng)基BMMY，在誘導(dǎo)培養(yǎng)36h后取上清液進(jìn)行植酸酶酶活性分析。通過表達(dá)植酸酶的酶活性測(cè)定，從200株重組酵母中初步篩選到42株表達(dá)植酸酶的重組子，其中表達(dá)量最高的4株重組子，分別定名為P.pastoris pFY02-8，44，95，147。
實(shí)驗(yàn)九本實(shí)施例是說明在分子水平上證實(shí)植酸酶基因在酵母中的重組、轉(zhuǎn)錄的方法。
重組酵母菌株的甲醇利用缺陷型說明外源基因已經(jīng)準(zhǔn)確整合到酵母基因組中AOX1基因位點(diǎn)，從而破壞了該基因的功能。通過分子檢測(cè)也證實(shí)了這一點(diǎn)。通過酶解的方法破壞酵母的細(xì)胞壁，再用SDS破壞細(xì)胞膜從而釋放出染色體DNA，再經(jīng)過進(jìn)一步的純化處理得到較純的酵母基因組DNA。
取5μg重組酵母基因組DNA分別進(jìn)行EcoRI和SalI全酶解，酶解產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，將凝膠中的DNA轉(zhuǎn)移到尼龍膜上進(jìn)行Southenblotting分析。雜交所用探針為用從重組質(zhì)粒pYB-2上切下的長(zhǎng)約1.0Kb的EcoRI+SalI植酸酶基因片斷。探針酶切后電泳回收，用隨機(jī)引物標(biāo)記Kit標(biāo)記探針。結(jié)果(圖10)表明，不同的重組子(P.pastoris pPIC9A-8，44，95)DNA用phyA3基因兩端的EcoRI酶切后，在1.3kb處有一phyA3基因特異雜交帶，這證明phyA3基因已整合到酵母基因組中。用SalI酶切phyA3基因內(nèi)的單一SalI酶切點(diǎn)后進(jìn)行Southern blotting分析，外源基因整合到酵母基因組中的不同位點(diǎn)會(huì)出現(xiàn)不同的雜交帶，結(jié)果表明，4個(gè)重組酵母P.pastoris pFY02-8，44，95，147中，植酸酶基因的拷貝數(shù)分別為1、2、2、1個(gè)。
破碎經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)的重組酵母細(xì)胞提取酵母mRNA，取5μg mRNA進(jìn)行甲醛變性凝膠電泳，將凝膠上的mRNA吸印到尼龍膜上進(jìn)行Northernblotting分析。所用探針與Southen blotting分析使用的探針相同。結(jié)果(圖11)表明，重組酵母中的植酸酶基因均得到了正常的轉(zhuǎn)錄。
實(shí)驗(yàn)十本實(shí)驗(yàn)是說明在搖床水平上重組酵母中植酸酶的表達(dá)研究程序重組酵母于30℃下誘導(dǎo)培養(yǎng)36h后，在37℃、pH6.5的條件下，對(duì)含表達(dá)產(chǎn)物的培養(yǎng)液進(jìn)行植酸酶酶活性測(cè)定，結(jié)果表明，不同的轉(zhuǎn)化子所表達(dá)的酶量有所差異，其中表達(dá)量最高的4個(gè)重組子P.pastoris pFY02-8，44，95，147的酶活性分別為23488U/mL、28656U/mL、29636U/mL、22456U/mL。重組酵母表達(dá)的植酸酶的性質(zhì)研究表明，在最適pH、最適溫度、酸堿穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性等酶學(xué)性質(zhì)方面均基本一致。
為了研究重組酵母中植酸酶的表達(dá)量與誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間的關(guān)系，酵母重組子P.pastoris FY02-44從誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)起每隔12h取1mL培養(yǎng)液測(cè)定植酸酶活性，研究表明(圖12)，在誘導(dǎo)培養(yǎng)48h之內(nèi)，表達(dá)的植酸酶隨誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，48h之后，再增加誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間，植酸酶的表達(dá)量?jī)H緩慢增加。
實(shí)驗(yàn)十一本實(shí)施例是說明重組酵母在5升發(fā)酵罐中高密度發(fā)酵生產(chǎn)植酸酶的程序。
優(yōu)化后的重組酵母發(fā)酵方法如下5％接種Basal Salts培養(yǎng)基C源4％葡萄糖菌體生長(zhǎng)階段N源氨水無機(jī)鹽↓24h流加25％葡萄糖流量36mL/h/L碳源飼喂階段↓4h流加25％葡萄糖∶甲醇(8∶1)，碳源—誘導(dǎo)劑流量9ml/h/L混合飼喂階段↓4h甲醇誘導(dǎo)(維持終濃度為0.3％左右)誘導(dǎo)表達(dá)階段發(fā)酵過程分為四個(gè)階段。具體如下1)菌株培養(yǎng)階段。發(fā)酵培養(yǎng)基10×Basal Salts接種前先加入28％氨水使培養(yǎng)基的pH達(dá)到5.0(氨水同時(shí)也做為菌株生長(zhǎng)的氮源)，再按每升培養(yǎng)基加入4.37mL PTM1，5-10％接種種子液，通氣攪拌培養(yǎng)18～24h，在培養(yǎng)過程中隨著菌株的生長(zhǎng)，培養(yǎng)基中的溶氧量由100％逐漸降低，當(dāng)碳源消耗完后溶氧量將再度升高至80％以上，此時(shí)菌體濕重達(dá)到90～110g/L。2)碳源飼喂階段。流加25％葡萄糖(每升中含12mL PTM1)，流加量為36mL/h/L，培養(yǎng)4h。調(diào)整通氣量使溶氧量始終大于20％。此步結(jié)束時(shí)菌體濕重達(dá)到180～220g/L。3)碳源-甲醇混合飼喂階段。流加50％葡萄糖∶甲醇(8∶1)培養(yǎng)4h，流加量為9mL/h/L，控制溶氧量始終大于20％。4)誘導(dǎo)表達(dá)階段。加入誘導(dǎo)劑甲醇(每升中含12mL PTM1)，使甲醇終濃度維持在0.3％，溶氧量始終大于20％。在誘導(dǎo)過程中每12h取樣一次測(cè)定表達(dá)的植酸酶的積累量并進(jìn)行表達(dá)蛋白的SDS-PAGE。
從連續(xù)3批次的誘導(dǎo)時(shí)間與表達(dá)產(chǎn)物積累量的關(guān)系(圖13)來看，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加，單位體積發(fā)酵液中的植酸酶的活性隨之增加，直到直到誘導(dǎo)120小時(shí)左右達(dá)到高峰，此時(shí)酶活性達(dá)到5.0～6.0×105U/mL發(fā)酵液，隨后產(chǎn)物積累量不再隨誘導(dǎo)時(shí)間的增加而顯著增加。三批次發(fā)酵之間，表達(dá)產(chǎn)物隨時(shí)間積累的曲線基本一致，說明植酸酶的表達(dá)具有很好的穩(wěn)定性和可重復(fù)性。隨誘導(dǎo)時(shí)間增加發(fā)酵液中表達(dá)積累的植酸酶的SDS-PAGE分析見圖14。結(jié)果表明，表達(dá)的植酸酶分子量大小約為70kD，比植酸酶的理論分子量大10kDa左右，這證明植酸酶基因不僅得到了表達(dá)、有效分泌，而且表達(dá)產(chǎn)物還能進(jìn)行蛋白翻譯后修飾—糖基化，而糖基化修飾是植酸酶具備正常酶活性所必需的。
在重組P.pastoris生長(zhǎng)、誘導(dǎo)表達(dá)的一個(gè)發(fā)酵周期結(jié)束后，直接取這種經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后的菌液做為種子液(接種量為1％)進(jìn)行下一輪的發(fā)酵過程，累計(jì)共進(jìn)行5輪，在每輪中均對(duì)菌株生長(zhǎng)的生物量和植酸酶表達(dá)量進(jìn)行測(cè)定。另外，取每輪發(fā)酵完的菌體鋪完全培養(yǎng)基平板，挑取10個(gè)單菌落提取基因組DNA進(jìn)行phyA3的PCR檢測(cè)。結(jié)果表明(表1)，菌株生長(zhǎng)的生物量、速度及植酸酶的表達(dá)量在各輪中基本保持穩(wěn)定。PCR的結(jié)果也證明，經(jīng)過5輪的連續(xù)培養(yǎng)，phyA3依然穩(wěn)定整合在P.pastoris基因組中，這些結(jié)果證明重組P.pastoris不僅具有良好的遺傳穩(wěn)定性而且具有良好的植酸酶表達(dá)的穩(wěn)定性。
表1.重組畢赤酵母(P.pastoris pPFY02-44)的遺傳穩(wěn)定性及植酸酶基因表達(dá)的穩(wěn)定性傳種代數(shù) PCR陽性生長(zhǎng)24h的生物量誘導(dǎo)120h植酸酶表達(dá)量(菌體濕重g/L)(U/mL)1 100％ 98.2 5.2×1052 100％ 110.1 5.7×1053 100％ 107.5 5.2×1054 100％ 104.0 5.1×1055 100％ 115.3 5.5×105
序列表<110> 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所<120>一種廣譜、耐高溫的高比活植酸酶以及編碼該酶的基因<130>I2001243<160>6<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1455<212>DNA<213>Aspergillus<220><221>CDS<222>(1)..(47)<223><220><221>Intron<222>(48)..(104)<223><220><221>mat_peptide<222>(136)..()<223><220><221>CDS<222>(105)..(1452)<223><400>1atg gtg act ctg act ttc ctg ctt tcg gcg gcg tat ctg ctt tct gg47Met Val Thr Leu Thr Phe Leu Leu Ser Ala Ala Tyr Leu Leu Ser Gly-25 -20 -15gtgagtggct tggatctatt gctcggatag ggctgtggtg ctgattctga aacggag t 105aga gtg tct gcg gca cct agt tct gct ggc tcc aag tcc tgc gat acg 153Arg Val Ser Ala Ala Pro Ser Ser Ala Gly Ser Lys Ser Cys Asp Thr-10 -5 -1 1 5gta gac ctc ggg tac cag tgc tcc cct gcg act tct cat cta tgg ggc 201Val Asp Leu Gly Tyr Gln Cys Ser Pro Ala Thr Ser His Leu Trp Gly10 15 20cag tac tcg cca ttc ttt tcg ctc gag gac gag ctg tcc gtg tcg agt 249Gln Tyr Ser Pro Phe Phe Ser Leu Glu Asp Glu Leu Ser Val Ser Ser25 30 35aag ctt ccc aag gat tgc aga atc 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1.一種植酸酶，它具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。
2.一種編碼權(quán)利要求1所述的植酸酶的基因。
3.按照權(quán)利要求2所述的基因，它具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
4.一種表達(dá)載體，它含有權(quán)利要求2或3所述的基因。
5.一種轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞，它含有權(quán)利要求4所述的表達(dá)載體。
6.按照權(quán)利要求5所述的轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞，其中所述的酵母細(xì)胞是畢赤酵母細(xì)胞。
7.一種飼料，它含有權(quán)利要求5所述的酵母細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種高比活、耐高溫、可同時(shí)適用于單胃動(dòng)物和淡水魚類飼料的廣譜植酸酶及其編碼基因。本發(fā)明還提供了含有本發(fā)明的植酸酶基因的表達(dá)載體和含有該表達(dá)載體的重組酵母細(xì)胞。本發(fā)明的重組酵母中植酸酶的表達(dá)量可達(dá)到520000U/mL發(fā)酵液。高效表達(dá)植酸酶的重組酵母可用來大規(guī)模工業(yè)化廉價(jià)生產(chǎn)飼料用植酸酶。
文檔編號(hào)C12N1/19GK1405303SQ0114216
公開日2003年3月26日 申請(qǐng)日期2001年9月14日 優(yōu)先權(quán)日2001年9月14日
發(fā)明者姚斌, 范云六, 王亞茹, 操時(shí)樹, 袁鐵錚, 史秀云 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所, 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所