專利名稱：表達(dá)乳鐵蛋白的基因工程重組菌株及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種全新的產(chǎn)品，它能在體內(nèi)傳遞有活性的乳鐵蛋白多肽，并用于預(yù)防和治療多種疾病。本發(fā)明的方法是將乳鐵蛋白基因克隆到益生菌，通常是乳酸菌如乳球菌和乳桿菌的表達(dá)載體上，用電轉(zhuǎn)化方法獲得轉(zhuǎn)乳鐵蛋白基因的重組菌株。通過蛋白雜交及生物活性測定，證明得到的重組菌株確實(shí)能夠產(chǎn)生有生物活性的乳鐵蛋白多肽。然后用一種或多種重組益生菌菌株制成不同的制劑如口服液、凍干粉壓片、膠囊或噴霧劑，提供給患者，使其在消化道和陰道或其它粘膜處及體表能表達(dá)乳鐵蛋白，由于所使用的益生菌不僅不生產(chǎn)任何對(duì)人體有害的毒素，而且對(duì)人體健康還有不同程度的促進(jìn)作用，益生菌在人體內(nèi)能夠不斷地繁殖，因而我們能夠利用這種重組的益生菌成為在體內(nèi)制造這種生物活性蛋白的“工廠”，這也是在體內(nèi)傳遞有生物活性的乳鐵蛋白的一種全新的方法，從而達(dá)到預(yù)防和治療多種疾病的目的。
乳鐵蛋白是一種天然的非血紅素鐵結(jié)合糖蛋白，屬于轉(zhuǎn)鐵蛋白家族的一員。上個(gè)世紀(jì)六十年代首次在牛初乳中發(fā)現(xiàn)的。其分布很廣，主要存在于母乳中，尤其于初乳中含量最高。它是母乳中含量第二多的蛋白質(zhì)，占普通母乳蛋白質(zhì)的10-20％。除乳汁外，其他的消化、呼吸和生殖系統(tǒng)的外分泌液中也含有一定量的乳鐵蛋白，如淚液、精液、唾液、滑液等。血液中也能檢測到乳鐵蛋白的存在。血液中的乳鐵蛋白來自于噬中性粒細(xì)胞，噬中性粒細(xì)胞在炎癥處被激活后會(huì)合成并釋放出乳鐵蛋白。
人乳鐵蛋白是分子量為78kDa的單體糖蛋白，其在不同的種屬中分別含1-4個(gè)多聚糖。牛與人的乳鐵蛋白分別含689和691個(gè)氨基酸，其同源性為69％。兩者的三維結(jié)構(gòu)非常相似。每個(gè)乳鐵蛋白由兩個(gè)相同的葉組成，分別命名為N-和C-葉。每個(gè)葉又可分為兩個(gè)亞葉，亞葉之間形成一個(gè)裂縫。此裂縫通過一個(gè)雙碳酸根離子與Fe3+的協(xié)同作用牢固結(jié)合Fe3+，每分子可結(jié)合兩個(gè)Fe3+。乳鐵蛋白具有促鐵吸收、免疫調(diào)節(jié)、抑菌、殺菌、抗病毒、阻斷氧自由基、調(diào)節(jié)骨隨細(xì)胞的生長和促進(jìn)腸道內(nèi)益生菌生長等功能。最新研究顯示乳鐵蛋白還有預(yù)防和抑制大腸癌發(fā)生和擴(kuò)散的作用。此外，它還能抑制丙型肝炎病毒的增殖，而且沒有副作用?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)去糖基化蛋白保留了天然乳鐵蛋白的所有生物功能。乳鐵蛋白的穩(wěn)定性是隨PH、鹽離子濃度和環(huán)境其它因素而改變。在酸性條件下，乳鐵蛋白非常穩(wěn)定，對(duì)體內(nèi)一些蛋白酶不敏感。大量試驗(yàn)證明被蛋白酶水解的一些乳鐵蛋白多肽仍具有抗菌活性，如lactoferricin H(包含N端1-47氨基酸)，其抑菌和殺菌活性比完整的乳鐵蛋白還高。乳鐵蛋白的N1端參與與LPS的結(jié)合，乳鐵蛋白還與溶菌酶，肝素、和DNA結(jié)合。
由于乳鐵蛋白的重要生理功能，自其發(fā)現(xiàn)的近四十年來，吸引了眾多科學(xué)家的興趣，目前已對(duì)其結(jié)構(gòu)特征和生理功能有相當(dāng)?shù)牧私?，?duì)其進(jìn)行商業(yè)化開發(fā)的時(shí)機(jī)已經(jīng)成熟。由于乳鐵蛋白具有以上的生理功能，所以其在國外得到廣泛的應(yīng)用。多年來乳鐵蛋白主要用作乳制品添加劑和嬰幼兒食品添加劑，模仿母乳，提高抗病菌能力。在乳制品中乳鐵蛋白與益生菌混用，作為運(yùn)動(dòng)員營養(yǎng)的一部分。生產(chǎn)片劑或速溶飼料，用作寵物食品，抗病毒。作為功能食品，增加鐵的可溶性和幫助對(duì)鐵的吸收，用于兒童和孕婦的補(bǔ)鐵制品。添加到化妝品中，用于抗氧化，抗衰老，甚至用于口腔保護(hù)劑和口香糖，改善口腔衛(wèi)口等。市售多種奶粉、鮮奶，多不含乳鐵蛋白，這是因?yàn)槠洚a(chǎn)品制造過程中，加熱、殺菌等程序，破壞了乳鐵蛋白。目前商業(yè)化的乳鐵蛋白來源主要有兩種1)從牛奶中直接提取，用作保健品、飲料、嬰兒食品、口腔護(hù)理以及化妝品等。2)基因工程表達(dá)的重組人乳鐵蛋白。表達(dá)系統(tǒng)有用曲霉菌表達(dá)和轉(zhuǎn)基因牛，表達(dá)后經(jīng)提純?yōu)榈鞍踪|(zhì)純品，用作臨床藥物的開發(fā)。
目前臨床實(shí)驗(yàn)表明，大劑量的乳鐵蛋白才有較好的預(yù)防和治療效果，由于以上兩種方法產(chǎn)量低，生產(chǎn)成本高，不能滿足人們對(duì)乳鐵蛋白的需求。因而，需要發(fā)展一種更有效和更經(jīng)濟(jì)的方法生產(chǎn)乳鐵蛋白。我們發(fā)明的用表達(dá)乳鐵蛋白多肽的基因工程重組益生菌菌株在體內(nèi)傳遞乳鐵蛋白的方法，具有生產(chǎn)工藝簡單、成本低、療效好的巨大優(yōu)勢(shì)，將取代其它幾種方法。
本發(fā)明提供了獲得表達(dá)乳鐵蛋白多肽的重組益生菌的方法，并提供了生產(chǎn)這種重組益生菌菌株的方法和其在動(dòng)物和人體內(nèi)的應(yīng)用。本發(fā)明也提供了新的益生菌表達(dá)載體的構(gòu)建，特別是乳酸菌中乳球菌和乳桿菌質(zhì)粒的構(gòu)建，它使乳鐵蛋白多肽能夠表達(dá)，并具有一定的生物學(xué)活性。
本發(fā)明方法包括以下步驟1.本發(fā)明構(gòu)建了帶有乳鐵蛋白基因的各種不同的益生菌表達(dá)載體。
益生菌主要包括原核革蘭氏陽性細(xì)菌和真核酵母菌，而原核革蘭氏陽性細(xì)菌主要是指一些有利于人和畜牧身體健康的乳酸菌，如雙歧桿菌、乳桿菌、乳球菌和鏈球菌?；蚬こ倘樗峋难芯科鸩捷^晚，由于乳酸菌自身遺傳特性比較復(fù)雜性，其技術(shù)難點(diǎn)主要集中在質(zhì)粒的構(gòu)建和蛋白的表達(dá)。真核蛋白表達(dá)的難度大，與大腸桿菌相比，表達(dá)量極低。不同質(zhì)粒、不同啟動(dòng)子及不同信號(hào)肽都對(duì)外源蛋白的表達(dá)影響很大。
本發(fā)明采用幾種乳酸菌能識(shí)別的強(qiáng)啟動(dòng)子及信號(hào)肽等元件，構(gòu)建了多種誘導(dǎo)和非誘導(dǎo)型胞內(nèi)和胞外表達(dá)的乳酸菌表達(dá)質(zhì)粒，這些質(zhì)?？捎坞x地存在于乳酸菌中。
另外，將這些質(zhì)粒中包括乳鐵蛋白基因在內(nèi)的表達(dá)元件部分通過酶切、連接等方法克隆到乳酸菌整合質(zhì)粒，如pG+host、pJIM2481或Tn916、Tn917、Tn919等轉(zhuǎn)座子上，從而整合到乳酸菌染色體中，構(gòu)建了可持續(xù)、穩(wěn)定表達(dá)乳鐵蛋白基因的重組乳酸菌菌株。
酵母表達(dá)體系最大的優(yōu)點(diǎn)在于它屬于真核生物表達(dá)系統(tǒng)，能夠進(jìn)行蛋白質(zhì)修飾作用，而且酵母為單細(xì)胞生物，生長速度快，便于進(jìn)行分子生物學(xué)操作。
在酵母中表達(dá)外源基因和分泌外源蛋白必須具備下列條件酵母識(shí)別的強(qiáng)啟動(dòng)子，信號(hào)肽序列，轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)，翻譯終止密碼子，合適的表達(dá)框架等。本發(fā)明采用帶有酵母磷酸甘油酸激酶(Phosphoglycerate Kinase，PGK)基因啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)的表達(dá)載體，在啟動(dòng)子后插入酵母天然信號(hào)肽——MFα1信號(hào)肽編碼序列和乳鐵蛋白基因序列，從而構(gòu)建了可在酵母菌中分泌表達(dá)重組乳鐵蛋白或多肽片段的表達(dá)質(zhì)粒。
2.本發(fā)明構(gòu)建了能穩(wěn)定表達(dá)具有生物學(xué)活性的乳鐵蛋白多肽的益生菌菌株。
上述含有乳鐵蛋白基因或基因片段的相應(yīng)表達(dá)載體，通過電轉(zhuǎn)化的方法，分別轉(zhuǎn)入酵母菌、雙歧桿菌、乳桿菌、乳球菌、鏈球菌、腸球菌、明串珠菌、利斯特氏菌、和芽胞桿菌中，游離存在或整合到染色體上，得到能穩(wěn)定表達(dá)具有生物學(xué)活性的乳鐵蛋白多肽的重組益生菌菌株。
重組菌株經(jīng)發(fā)酵誘導(dǎo)后，提純所表達(dá)的乳鐵蛋白，用標(biāo)準(zhǔn)品作對(duì)照，用已建立好的乳鐵蛋白生物活性的檢測方法證明重組益生菌分泌出的乳鐵蛋白本身具有生物活性。
3.提供了利用上述重組益生菌在動(dòng)物或人體內(nèi)生產(chǎn)和傳遞乳鐵蛋白多肽的方法及應(yīng)用。
重組菌株分別用適宜培養(yǎng)基培養(yǎng)，得到的發(fā)酵液可制備成各種劑型，如口服液噴霧劑、膠囊、或片劑，施用于消化道、陰道或其它粘膜處，用于治療或預(yù)防病毒或細(xì)菌引起的傳染病，抑制腫瘤細(xì)胞生長、緩解腫瘤病人經(jīng)放化療后引起的消化道功能紊亂、促進(jìn)患者胃腸道內(nèi)益菌群如雙歧桿菌的生長和提高機(jī)體免疫能力。
本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)1.采用益生菌自身表達(dá)載體，可以穩(wěn)定高效表達(dá)外源基因。
2.所用的益生菌本身對(duì)人和畜牧是安全的，不產(chǎn)生內(nèi)外毒素，同時(shí)對(duì)人和畜牧的身體健康還有促進(jìn)作用，如某些益生菌能夠維持人體腸道內(nèi)固有菌群的平衡，對(duì)腸道致病菌有拮抗和抑制作用，對(duì)調(diào)整腸道菌群失調(diào)和治療急慢性腹瀉有良好的效果，同時(shí)能降低血內(nèi)毒素水平，提高人體免疫力。
3.直接使用能夠表達(dá)人乳鐵蛋白基因的重組益生菌，不需經(jīng)過蛋白純化，此產(chǎn)品生產(chǎn)工藝簡單，成本低。
4.重組益生菌可以在人和動(dòng)物體內(nèi)不斷繁殖，在一定時(shí)期內(nèi)持續(xù)表達(dá)并提供給機(jī)體乳鐵蛋白，具有很好的特異性和有效性。
以下通過實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。這些實(shí)施例和


本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案，因此不被認(rèn)為限制其范圍。此發(fā)明應(yīng)包括其它等效的實(shí)施方案。
圖1表示乳酸菌表達(dá)載體pLA311的構(gòu)建過程。其中，PnisA為啟動(dòng)子，SPusp為信號(hào)肽序列。
圖2表示乳酸菌表達(dá)載體pLA313的構(gòu)建過程。其中，PslpA為啟動(dòng)子，SPslpA為信號(hào)肽序列。
圖3表示乳酸菌表達(dá)載體pLA315的構(gòu)建過程。其中，P59為啟動(dòng)子，SPusp為信號(hào)肽序列。
圖4表示乳酸菌表達(dá)載體pLA317的構(gòu)建過程。其中，P32為啟動(dòng)子，SPusp為信號(hào)肽序列。
實(shí)施例1乳酸菌表達(dá)載體pLA311和pLA319的構(gòu)建質(zhì)粒pLA141來源于乳酸菌質(zhì)粒pGK，有colE1和pWV01復(fù)制子，可以在大腸桿菌和乳酸菌中復(fù)制，帶有乳球菌NisA啟動(dòng)子和乳球菌Usp45信號(hào)肽，在Nisin誘導(dǎo)下可啟動(dòng)其后外源基因的表達(dá)，表達(dá)的重組蛋白在信號(hào)肽的牽引下分泌至胞外。
根據(jù)已發(fā)表的人乳鐵蛋白cDNA序列，設(shè)計(jì)合成兩段引物上游agcgatgcatcaggccgtaggagaaggagtgtt下游agcgactagtttacttcctgaggaattcacaggcttc在兩段引物中分別引入NsiI位點(diǎn)和SpeI位點(diǎn)，以人乳鐵蛋白cDNA為模板，PCR擴(kuò)增人乳鐵蛋白基因。
反應(yīng)條件為94℃變性5分鐘，以下循環(huán)94℃變性30秒，65℃退火30秒，72℃延伸3分鐘，共30個(gè)循環(huán)。
將PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶NsiI和SpeI消化，將得到的人乳鐵蛋白基因連接到pLA141質(zhì)粒的NsiI-SpeI位點(diǎn)，電轉(zhuǎn)化乳酸乳球菌NZ9000，篩選氯霉素抗性的轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒，經(jīng)酶切鑒定，PCR擴(kuò)增及測序，證明人乳鐵蛋白基因已插入pLA141，序列正確，重組質(zhì)粒命名為pLA311。
具體過程見圖1將重組質(zhì)粒pLA311用限制性內(nèi)切酶BamHI和NsiI消化，切除質(zhì)粒上的usp45信號(hào)肽序列，再加入klenow片段補(bǔ)平酶切后的粘性末端，質(zhì)粒白連后轉(zhuǎn)化乳酸乳球菌NZ9000，篩選氯霉素抗性的轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒，經(jīng)酶切鑒定，PCR擴(kuò)增及測序，證明序列正確，得到的重組質(zhì)粒命名為pLA319實(shí)施例2乳酸菌表達(dá)載體pLA313和pLA321的構(gòu)建質(zhì)粒pLA178來源于乳酸菌質(zhì)粒pGK，有colE1和pWV01復(fù)制子，可以在大腸桿菌和乳酸菌中復(fù)制，帶有乳球菌slpA啟動(dòng)子和slpA信號(hào)肽，可高效啟動(dòng)外源基因的表達(dá)。將PCR得到的人乳鐵蛋白基因用限制性內(nèi)切酶NsiI和SpeI消化，得到的片段連接到pLA178質(zhì)粒啟動(dòng)子和信號(hào)肽后的的NsiI-SpeI位點(diǎn)，構(gòu)建出可在乳酸菌中持續(xù)高效表達(dá)乳鐵蛋白基因的重組表達(dá)載體，電轉(zhuǎn)化乳酸乳球菌MG1363，篩選氯霉素抗性的轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒，經(jīng)酶切鑒定，PCR擴(kuò)增及測序，證明人乳鐵蛋白基因已插入pLA178，序列正確，重組質(zhì)粒命名為pLA313。pLA313在乳酸菌中表達(dá)的乳鐵蛋白可分泌至胞外。
具體過程見圖2將重組質(zhì)粒pLA313用限制性內(nèi)切酶BamHI和NsiI消化，切除質(zhì)粒上的slpA信號(hào)肽序列，再加入klenow片段補(bǔ)平酶切后的粘性末端，質(zhì)粒自連后轉(zhuǎn)化乳酸乳球菌MG1363，篩選氯霉素抗性的轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒，經(jīng)酶切鑒定，PCR擴(kuò)增及測序，證明序列正確，得到的重組質(zhì)粒命名為pLA321實(shí)施例3乳酸菌表達(dá)載體pLA315和pLA323的構(gòu)建質(zhì)粒pLA136來源于乳酸菌質(zhì)粒pIL252，有colE1和p AMβ1復(fù)制子，在大腸桿菌和乳酸菌中都能復(fù)制，帶有乳球菌P59啟動(dòng)子和乳球菌Usp45信號(hào)肽，將PCR得到的人乳鐵蛋白基因用限制性內(nèi)切酶NsiI和SpeI消化，得到的片段接入啟動(dòng)子和信號(hào)肽后的NsiI-SpeI位點(diǎn)，構(gòu)建帶有乳鐵蛋白基因的重組表達(dá)載體，電轉(zhuǎn)化乳酸乳球菌MG1363，篩選氯霉素抗性的轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒，經(jīng)酶切鑒定，PCR擴(kuò)增及測序，證明人乳鐵蛋白基因已插入pLA136，序列正確，重組質(zhì)粒命名為pLA315。。該載體在乳酸菌中可持續(xù)表達(dá)乳鐵蛋白，生成的乳鐵蛋白能夠分泌到胞外。
具體過程見圖3將重組質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶BamHI和NsiI消化，切除質(zhì)粒上的Usp45信號(hào)肽序列，再加入klenow片段補(bǔ)平酶切后的粘性末端，質(zhì)粒自連后轉(zhuǎn)化乳酸乳球菌MG1363，篩選氯霉素抗性的轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒，經(jīng)酶切鑒定，PCR擴(kuò)增及測序，證明序列正確，得到的重組質(zhì)粒命名為pLA323實(shí)施例4乳酸菌表達(dá)載體pLA317和pLA325的構(gòu)建質(zhì)粒pLA176來源于乳酸菌質(zhì)粒pGK，有colE1和pWV01復(fù)制子，可以在大腸桿菌和乳酸菌中復(fù)制，帶有乳球菌P32啟動(dòng)子和乳球菌Usp45信號(hào)肽，可啟動(dòng)外源基因的表達(dá)。將PCR得到的人乳鐵蛋白基因用限制性內(nèi)切酶NsiI和SpeI消化，得到的片段接入該質(zhì)粒啟動(dòng)子和信號(hào)肽后的NsiI-SpeI位點(diǎn)，構(gòu)建帶有乳鐵蛋白基因的重組表達(dá)載體，電轉(zhuǎn)化乳酸乳球菌MG1363，篩選氯霉素抗性的轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒，經(jīng)酶切鑒定，PCR擴(kuò)增及測序，證明人乳鐵蛋白基因已插入pLA176，序列正確，重組質(zhì)粒命名為pLA317。該載體在乳酸菌中可持續(xù)表達(dá)乳鐵蛋白基因，生成的乳鐵蛋白能夠分泌到胞外。
具體過程見圖4將重組質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶BamHI和NsiI消化，切除質(zhì)粒上的Usp45信號(hào)肽序列，再加入klenow片段補(bǔ)平酶切后的粘性末端，質(zhì)粒自連后轉(zhuǎn)化乳酸乳球菌MG1363，篩選氯霉素抗性的轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒，經(jīng)酶切鑒定，PCR擴(kuò)增及測序，證明序列正確，得到的重組質(zhì)粒命名為pLA325實(shí)施例5重組表達(dá)載體pLA312和pLA320的構(gòu)建根據(jù)已發(fā)表的人乳鐵蛋白cDNA序列，設(shè)計(jì)合成兩段引物上游agcgatgcatcaggccgtaggagaaggagtgtt下游agcgaggttcttagatacactggatgggggagtctct在兩段引物中分別引入NsiI位點(diǎn)和EcoRI位點(diǎn)，以人乳鐵蛋白cDNA為模板，PCR擴(kuò)增人乳鐵蛋白基因編碼前47個(gè)氨基酸的基因片段。
反應(yīng)條件為94℃變性5分鐘，以下循環(huán)94℃變性30秒，65℃退火30秒，72℃延伸30秒，共30個(gè)循環(huán)。
將PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶NsiI和EcoRI消化，將得到的基因片段連接到pLA141質(zhì)粒的NsiI-EcoRI位點(diǎn)，電轉(zhuǎn)化乳酸乳球菌NZ9000，篩選氯霉素抗性的轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒，經(jīng)酶切鑒定，PCR擴(kuò)增及測序，證明人乳鐵蛋白基因片段已插入pLA141，序列正確，重組質(zhì)粒命名為pLA312。
將重組質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶BamHI和NsiI消化，切除質(zhì)粒上的信號(hào)肽序列，再加入klenow片段補(bǔ)平酶切后的粘性末端，質(zhì)粒自連后轉(zhuǎn)化乳酸乳球菌NZ9000，篩選氯霉素抗性的轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒，經(jīng)酶切鑒定，PCR擴(kuò)增及測序，證明序列正確，得到的重組質(zhì)粒命名為pLA320。
實(shí)施例6重組表達(dá)載體pLA314和pLA322的構(gòu)建將PCR得到的人乳鐵蛋白前47個(gè)氨基酸的基因片段用限制性內(nèi)切酶NsiI和EcoRI消化，得到的片段連接到pLA178質(zhì)粒的NsiI-EcoRI位點(diǎn)，電轉(zhuǎn)化乳酸乳球菌MG1363，篩選氯霉素抗性的轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒，經(jīng)酶切鑒定，PCR擴(kuò)增及測序，證明基因片段已插入pLA178，序列正確，重組質(zhì)粒命名為pLA314。
將重組質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶BamHI和NsiI消化，切除質(zhì)粒上的信號(hào)肽序列，再加入klenow片段補(bǔ)平酶切后的粘性末端，質(zhì)粒自連后轉(zhuǎn)化乳酸乳球菌MG1363，篩選氯霉素抗性的轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒，經(jīng)酶切鑒定，PCR擴(kuò)增及測序，證明序列正確，得到的重組質(zhì)粒命名為pLA322。
實(shí)施例7采用電轉(zhuǎn)化法，將上述幾種重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入乳球菌中。
將重組表達(dá)載體pLA313、pLA314、pLA315、pLA317、pLA321、pLA322、pLA323、pLA325分別與乳酸乳球菌MG1363感受態(tài)細(xì)胞在電轉(zhuǎn)杯中混勻，電擊，涂到含氯霉素的培養(yǎng)基上，篩選轉(zhuǎn)入重組質(zhì)粒的菌株。
乳酸乳球菌NZ9000是將Nisin抗性基因轉(zhuǎn)入MG1363染色體中得到的工程菌，可在Nisin存在的條件下正常生長，將帶有PnisA啟動(dòng)子的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入NZ9000中，可加入Nisin誘導(dǎo)質(zhì)粒表達(dá)外源基因。將重組表達(dá)載體pLA311、pLA312、pLA319、pLA320與乳酸乳球菌NZ9000感受態(tài)細(xì)胞在電轉(zhuǎn)杯中混勻，電擊，涂到含氯霉素的培養(yǎng)基上，篩選轉(zhuǎn)入重組質(zhì)粒的菌株。
實(shí)施例8采用電轉(zhuǎn)化法，將上述幾種重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入乳桿菌中。
將重組表達(dá)載體pLA313、pLA314、pLA315、pLA317、pLA321、pLA322、pLA323、pLA325分別與干酪乳桿菌感受態(tài)細(xì)胞在電轉(zhuǎn)杯中混勻，電擊，涂到含氯霉素的MRS培養(yǎng)基上，在厭氧箱中培養(yǎng)，篩選轉(zhuǎn)入重組質(zhì)粒的菌株。
干酪乳桿菌NY1000是將Nisin抗性基因轉(zhuǎn)入干酪乳桿菌染色體中得到的工程菌，可在Nisin存在的條件下正常生長，將帶有PnisA啟動(dòng)子的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入NY1000中，可加入Nisin誘導(dǎo)質(zhì)粒表達(dá)外源基因。將重組表達(dá)載體pLA311、pLA312、pLA319、pLA320與干酪乳桿菌NY1000感受態(tài)細(xì)胞在電轉(zhuǎn)杯中混勻，電擊，涂到含氯霉素的培養(yǎng)基上，在厭氧箱中培養(yǎng)，篩選轉(zhuǎn)入重組質(zhì)粒的菌株。
實(shí)施例9重組菌株表達(dá)乳鐵蛋白將得到的重組乳球菌、乳桿菌分別在含有對(duì)應(yīng)抗生素的GM17和MRS培養(yǎng)基中靜置培養(yǎng)過夜，對(duì)帶有NisA啟動(dòng)子的重組菌株，待其達(dá)到生長對(duì)數(shù)期O.D.值為0.5左右時(shí)，加入誘導(dǎo)劑Nisin，誘導(dǎo)2-3個(gè)小時(shí)，收獲菌體。對(duì)非誘導(dǎo)的重組菌株，待其生長到達(dá)平臺(tái)期時(shí)收獲。收獲的菌株經(jīng)常規(guī)處理后，進(jìn)行Western雜交驗(yàn)證蛋白表達(dá)首先進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后轉(zhuǎn)膜，與兔抗人乳鐵蛋白抗體雜交。
結(jié)果證明，在轉(zhuǎn)入分泌型重組質(zhì)粒pLA311、pLA313、pLA315、pLA317、pLA312、pLA314的菌株培養(yǎng)液上清中有重組乳鐵蛋白，蛋白大小與從Sigma購買的人乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)品大小相同。在轉(zhuǎn)入非分泌型重組質(zhì)粒pLA319、pLA321、pLA323、pLA325、pLA320、pLA322的菌株細(xì)胞內(nèi)有重組乳鐵蛋白，蛋白大小與從Sigma購買的人乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)品大小相同。
實(shí)施例10重組益生菌菌株表達(dá)的乳鐵蛋白多肽的生物活性測定采用從Sigma購買的人乳鐵蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)品，通過體外分析測定標(biāo)準(zhǔn)品及重組乳鐵蛋白對(duì)大腸桿菌及弗氏志賀菌的抗微生物作用。
將大腸桿菌和弗氏志賀菌在適宜培養(yǎng)基上培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期，分別加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品及重組乳鐵蛋白，37℃震蕩培養(yǎng)，在各個(gè)時(shí)間段等份取出，連續(xù)稀釋并鋪板培養(yǎng)過夜用于計(jì)數(shù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)重組乳鐵蛋白和標(biāo)準(zhǔn)品的抗微生物作用基本相同。
實(shí)施例11重組菌株的應(yīng)用。
重組乳球菌、乳桿菌分別用GM17和MRS培養(yǎng)基靜置培養(yǎng)，口服液、或?qū)⒕w凍干制成膠囊和片劑。得到的發(fā)酵液可直接制備成口服液、噴霧劑、或加入保護(hù)劑制成凍干粉，然后制成膠囊或片劑，施用于消化道、陰道或其它粘膜處，用于治療或預(yù)防病毒或細(xì)菌引起的傳染病，抑制腫瘤細(xì)胞生長、緩解腫瘤病人經(jīng)放化療后引起的消化道功能紊亂、促進(jìn)患者胃腸道內(nèi)益菌群如雙歧桿菌的生長和提高機(jī)體免疫能力。
權(quán)利要求
1.一種新的表達(dá)乳鐵蛋白多肽的基因工程重組益生菌菌株，其特征為帶有乳鐵蛋白基因的表達(dá)元件整合到其染色體上或存在于游離質(zhì)粒中。
2.權(quán)利要求1中所述的乳鐵蛋白來自人、?；蜇i的乳鐵蛋白，包括天然的全長的乳鐵蛋白、乳鐵蛋白多肽片段。
3.權(quán)利要求1中所述的益生菌為原核革蘭氏陽性細(xì)菌和真核酵母菌。
4.權(quán)利要求3中所述的原核革蘭氏陽性細(xì)菌為乳酸菌，包括雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、乳球菌屬(Lactococcus)、鏈球菌屬(Streptococcus)、腸球菌屬(Enterococcus)、明串珠菌屬(Leuconostoc)、利斯特氏菌屬(Listeria)、或芽胞桿菌屬(Bacillus)。
5.權(quán)利要求4中所述的雙歧桿菌為青春雙歧桿菌(B.adolescentis)或長雙歧桿菌(B.longum)。
6.權(quán)利要求4中所述的乳桿菌為干酪乳桿菌(L.casei)或米酒乳桿菌(L.sake)或植物乳桿菌(L.plantarum)。
7.權(quán)利要求4中所述的乳球菌為乳酸乳球菌(L.lactis)。
8.權(quán)利要求4中所述的鏈球菌為格氏鏈球菌(S.gordoni)。
9.權(quán)利要求4中所述的腸球菌為糞腸球菌(E.faecalis)。
10.權(quán)利要求4中所述的利斯特氏菌為無害利斯特氏菌(L.innocua)。
11.權(quán)利要求4中所述的芽胞桿菌為枯草芽孢桿菌(B.subtilis)或蠟樣芽孢桿菌(B.cereus)。
12.權(quán)利要求4中所述的真核酵母菌為釀酒酵母(Saccharomyces serevisiae)。
13.一種用于轉(zhuǎn)化益生菌的質(zhì)粒，其特征在于含有下列從5’到3’連接的調(diào)控因子啟動(dòng)子、編碼乳鐵蛋白基因序列、轉(zhuǎn)錄終止子。
14.權(quán)利要求13中所述啟動(dòng)子，是適用于相應(yīng)重組益生菌菌株的啟動(dòng)子，包括選自乳球菌NisA基因、短乳桿菌SlpA基因、乳球菌P59、乳球菌P32啟動(dòng)子、乳球菌P23啟動(dòng)子或酵母磷酸甘油酸激酶(Phosphoglycerate Kinase，PGK)基因啟動(dòng)子。
15.權(quán)利要求13中所述轉(zhuǎn)錄終止子，是適用于相應(yīng)重組益生菌菌株的轉(zhuǎn)錄終止子，包括選自人乳頭瘤病毒E7基因、乳球菌Usp45基因、短乳桿菌SlpA基因或酵母磷酸甘油酸激酶(Phosphoglycerate Kinase，PGK)基因轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)。
16.權(quán)利要求13中所述的質(zhì)粒，可進(jìn)一步包含分泌信號(hào)肽。
17.權(quán)利要求16中所述分泌信號(hào)肽，是適用于相應(yīng)重組益生菌菌株的分泌信號(hào)肽，包括選自短乳桿菌SlpA基因、乳球菌Usp45基因或酵母MFα1信號(hào)肽編碼序列。
18.權(quán)利要求13中所述的質(zhì)粒，可進(jìn)一步包含適用于相應(yīng)重組益生菌菌株的復(fù)制起始子，包括選自乳酸菌pWV01、pAMβ1復(fù)制子或大腸桿菌colE1復(fù)制子。
19.含有權(quán)利要求13所述的重組質(zhì)粒的益生菌菌株，包括重組乳酸乳球菌CGMCC-0622、CGMCC-0623。
20.一種新的傳遞乳鐵蛋白多肽的方法，其特征是利用可接受藥用載體在消化道、女性生殖道、或其它粘膜處及體表施用權(quán)利要求1或權(quán)利要求19所述的表達(dá)乳鐵蛋白多肽的重組益生菌菌株。
21.權(quán)利要求1中所述重組益生菌菌株經(jīng)發(fā)酵后，一種或多種菌株混合制成口服液、噴霧劑、膠囊、或片劑，用于治療或預(yù)防病毒或細(xì)菌引起的傳染病，抑制腫瘤細(xì)胞生長、緩解腫瘤病人經(jīng)放化療后引起的消化道功能紊亂、促進(jìn)患者胃腸道內(nèi)益生菌群的生長和提高機(jī)體免疫能力；并可用于食品、保健品。
全文摘要
本發(fā)明闡述用分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建含有乳鐵蛋白基因的表達(dá)載體，并通過電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入益生菌中，得到穩(wěn)定表達(dá)人內(nèi)皮細(xì)胞抑制素基因的重組益生菌菌株。一種或多種重組菌株經(jīng)發(fā)酵處理后作為口服制劑，通過口服，在體內(nèi)表達(dá)有活性的乳鐵蛋白及其多肽片段。所表達(dá)的乳鐵蛋白及其多肽片段能夠治療和預(yù)防病毒引起的傳染病，抑制腫瘤細(xì)胞的生長，緩解腫瘤病人經(jīng)放化療后引起的消化道功能紊亂、促進(jìn)患者胃腸道內(nèi)益生菌群的生長和提高機(jī)體免疫能力；并可用于食品、保健品。
文檔編號(hào)C12P21/00GK1407108SQ0114200
公開日2003年4月2日 申請(qǐng)日期2001年9月6日 優(yōu)先權(quán)日2001年9月6日
發(fā)明者胡放, 王春香 申請(qǐng)人:胡放, 王春香