專利名稱：人血小板糖蛋白GPIbα的制備方法及其專用引物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種人體蛋白的制備方法及其專用引物，特別是涉及人血小板糖蛋白GPIbα的制備方法及其專用引物。
現(xiàn)已明確，血小板糖蛋白GPIb在血栓形成過程中是一種黏附蛋白，作為vWf因子的受體，激活或促進(jìn)血小板黏附、凝集反應(yīng)。GPIb是由、兩條鏈通過二硫鍵連接組成的異源二聚體，分子量為160,000道爾頓，、兩條鏈分別稱為GPIb和GPIb。與vWf因子的結(jié)合區(qū)位于GPIb的N端1-293位氨基酸殘基。編碼GPIb的全長DNA序列由1881個(gè)核苷酸組成(Genebank，GI450407，J Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84(16)，5615-5619(1987))，編碼vWf因子的讀碼框?yàn)榈?位至第879位的879個(gè)核苷酸。在靜止?fàn)顟B(tài)下，GPIb并不與可溶性vWf因子結(jié)合。體外實(shí)驗(yàn)時(shí)，二者的相互作用能夠被名為瑞斯托菌素(Ristocetin)的抗生素誘導(dǎo)。在高剪切力的作用下，可溶性的vWf因子也能夠與該受體相互作用(Lopez，JA.Blood coagul fibrinolysis；1994，597-119；Cleme tson，KJ，Clemetson JM.Thromb haemost；199778(1)266-270；Handa M，Titani K，Holland LZ，et al.J Biol Chem；1986，26112579-12585)。因此，能夠較大量地獲得GPIb及其vWf因子結(jié)合域的肽段對于深入研究其功能及進(jìn)一步深化利用，具有重要意義。
一種制備人血小板糖蛋白GPIbα的方法，包括以下步驟1)設(shè)計(jì)引物上游5’-CGCGGATCCATGCCTCTCCTCCTCTTGCTG-3’下游5’-CCGGAATTCTCAGAGGCTGTGGCCAGAGTACC-3’
2)以細(xì)胞總RNA為模板利用RT-PCR釣取GPIb的全長cDNA；3)構(gòu)建真核表達(dá)重組質(zhì)粒；4)將重組質(zhì)粒導(dǎo)入真核細(xì)胞中；5)培養(yǎng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞；6)收集轉(zhuǎn)染細(xì)胞分泌的人血小板糖蛋白GPIbα。
所述構(gòu)建真核表達(dá)重組質(zhì)粒，是將全長cDNA插入經(jīng)BamH I和EcoR I雙酶切處理后的真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)，獲得質(zhì)粒pcDNA3.1-GPF。
所述重組質(zhì)粒導(dǎo)入的真核細(xì)胞是CHO。
為了得到更純的人血小板糖蛋白GPIbα，所收集的由轉(zhuǎn)染細(xì)胞分泌的上清液，應(yīng)以凝血酶親合柱純化。
制備人血小板糖蛋白GPIbα的一對專用引物為上游5’-CGCGGATCCATGCCTCTCCTCCTCTTGCTG-3’下游5’-CCGGAATTCTCAGAGGCTGTGGCCAGAGTACC-3本發(fā)明的又一目的是提供一種制備人血小板糖蛋白GPIbα vWf因子結(jié)合域多肽的方法及其專用引物。
一種制備人血小板糖蛋白GPIbαvWf因子結(jié)合域多肽的方法，包括以下步驟1)設(shè)計(jì)引物上游5’-CGCGGATCCATGCCTCTCCTCCTCTTGCTG-3’下游5’-CCGGAATTCTCAGGCTTTGGTGGGGAACTTG-3’2)以GPIb的全長cDNA為模板，用PCR法克隆GPIb vWf因子結(jié)合域的cDNA。
3)構(gòu)建真核表達(dá)重組質(zhì)粒；4)將重組質(zhì)粒導(dǎo)入真核細(xì)胞中；5)培養(yǎng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞；6)收集轉(zhuǎn)染細(xì)胞分泌的人血小板糖蛋白GPIb vWf因子。
所述GPIb的全長cDNA是用下述設(shè)計(jì)引物上游5’-CGCGGATCCATGCCTCTCCTCCTCTTGCTG-3’下游5’-CCGGAATTCTCAGAGGCTGTGGCCAGAGTACC-3以細(xì)胞總RNA為模板利用RT-PCR釣取的。
所述構(gòu)建真核表達(dá)重組質(zhì)粒，是將vWf因子結(jié)合域的全長cDNA插入經(jīng)BamH I和EcoR I雙酶切處理后的真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)，獲得質(zhì)粒pcDNA3.1-GP302。
所述重組質(zhì)粒導(dǎo)入的真核細(xì)胞是CHO。
制備人血小板糖蛋白GPIbα vWf因子結(jié)合域多肽的一對專用引物為
上游5’-CGCGGATCCATGCCTCTCCTCCTCTTGCTG-3’下游5’-CCGGAATTCTCAGGCTTTGGTGGGGAACTTG-3’GPIb與脂質(zhì)體組成的復(fù)合物是一種潛在的血小板代用品，GPIb還可作為一種有效的診斷、檢測和治療血管內(nèi)創(chuàng)傷的診斷試劑。利用本發(fā)明的方法，可以較大量地獲得GPIb及其vWf因子結(jié)合域的肽段，為進(jìn)一步開發(fā)新型血小板代用品以及診斷、檢測和治療血管內(nèi)創(chuàng)傷的診斷試劑提供了堅(jiān)實(shí)的理論及必要的原材料基礎(chǔ)。
下面結(jié)合附圖及具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
圖2為質(zhì)粒pcDNA3.1(+)圖譜。
圖3為重組質(zhì)粒pcDNA3.1-GPF BamH I和EcoR I雙酶切鑒定圖譜。
圖4為用Western-blot檢測rhGPIb表達(dá)的結(jié)果。
圖5為PCR擴(kuò)增的的GP-302電泳圖譜。
圖6為重組質(zhì)粒pcDNA3.1-GP302。
圖7為用Western-blot檢測rhGP-302表達(dá)的結(jié)果。
圖8為瑞斯托菌素誘導(dǎo)的血小板聚集曲線。
圖9為rhGP302對瑞斯托菌素誘導(dǎo)的血小板聚集的抑制作用曲線。


圖10為rhGPIb對瑞斯托菌素誘導(dǎo)的血小板聚集的抑制作用曲線。
4、將GPIb的全長cDNA克隆至質(zhì)粒T-Vector(Promega公司產(chǎn)品)，由上海博亞生物工程公司測定其序列正確；5、以BamH I和EcoR I雙酶切將目的片段自T-Vector切下，回收目的片段，插入與經(jīng)BamH I和EcoR I雙酶切處理后的真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)(其圖譜如圖2所示)構(gòu)建pcDNA3.1-GPF，經(jīng)鑒定正確，如圖3所示，帶1為pcDNA3.1-GPF，帶2為.pcDNA.3.1，帶3為核酸分子量Mark2000，1000，750，500，250，100bp；6、將重組質(zhì)粒pcDNA3.1-GPF以脂質(zhì)體(Lipofectamin)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法導(dǎo)入CHO細(xì)胞中。由于該質(zhì)粒包含Neomycin抗性基因，故以G418篩選抗性克隆，以含800μgG418，10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞以篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞；7、建立細(xì)胞系后，收集細(xì)胞上清以鼠抗人GPIb單克隆抗體(Santacraz公司產(chǎn)品)以Western Blot檢測其表達(dá)，如圖4所示，rhGPIb已正確表達(dá)；8、將細(xì)胞系在含10％胎牛血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)至細(xì)胞80％滿底，以無血清的培養(yǎng)基洗細(xì)胞，并在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時(shí)，收集含GPIb的上清液；9、收集后的上清液以凝血酶親合柱純化，得到產(chǎn)品。
實(shí)施例2、制備人血小板糖蛋白GPIbα vWf因子結(jié)合域多肽制備人血小板糖蛋白GPIbα vWf因子結(jié)合域多肽，包括以下步驟1、設(shè)計(jì)引物上游5’-CGCGGATCCATGCCTCTCCTCCTCTTGCTG-3’下游5’-CCGGAATTCTCAGGCTTTGGTGGGGAACTTG-3’為便于基因定向插入表達(dá)載體pcDNA3.1(+)(Invitro公司產(chǎn)品)，在上游引物中引入BamH I酶切位點(diǎn)序列，在下游引物中引入EcoR I酶切位點(diǎn)序列；2、自人紅白血病細(xì)胞系TF-I細(xì)胞株(CRL-2003 Homo sapiens(human)TF-1)中提取細(xì)胞總RNA；3、下述的上、下游引物，以提取的細(xì)胞總RNA為模板利用RT-PCR釣取GPIb的全長cDNA，上游5’-CGCGGATCCATGCCTCTCCTCCTCTTGCTG-3’下游5’-CCGGAATTCTCAGAGGCTGTGGCCAGAGTACC-34、以GPIb cDNA為模板，用步驟1合成的上、下游引物，PCR法克隆GPIb vWf因子結(jié)合域的cDNA，如圖5所示，其中帶1顯示GPIb vWf因子結(jié)合域，帶2是核酸分子量Mark2000，1000，750，500，250，100bp；該步驟中PCR的條件是50μl總反應(yīng)體系中，依次加入dNTP至終濃度0.2mM，MgCl2至終濃度2.5mM，加入上下游引物至終濃度為0.4μM，加入0.5μg模板，10×RT-PCR緩沖液5μl，Taq酶1μl(5U/μl)。在PE-2400型PCR儀上按下述條件擴(kuò)增94℃，5Min；94℃，45s，60℃，45s，72℃，延伸1Min，共30個(gè)循環(huán)；再在72℃，延伸7Min。
5、將GPIb vWf因子結(jié)合域的cDNA克隆至質(zhì)粒T-Vector(Promega公司產(chǎn)品)，由上海博亞生物工程公司測定其序列正確；6、以BamH I和EcoR I雙酶切將目的片段自T-Vector切下，回收目的片段，插入與經(jīng)BamH I和EcoR I雙酶切處理后的真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)(其圖譜如圖2所示)構(gòu)建pcDNA3.1-GP302，經(jīng)鑒定正確，如圖6所示，帶1為pcDNA3.1-GP302，帶2為.pcDNA.3.1，帶3為核酸分子量Mark2000，1000，750，500，250，100bp；7、將重組質(zhì)粒pcDNA3.1-GP302以脂質(zhì)體(Lipofectamin)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法導(dǎo)入CHO細(xì)胞中。由于該質(zhì)粒包含Neomycin抗性基因，故以G418篩選抗性克隆，以含800μg G418，10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞以篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞；8、建立細(xì)胞系后，收集細(xì)胞上清以鼠抗人GPIb單克隆抗體(Santacraz公司產(chǎn)品)以Western Blot檢測其表達(dá)，如圖7所示，rhGPIb vWf因子結(jié)合域的多肽已正確表達(dá)；9、將細(xì)胞系在含10％胎牛血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)至細(xì)胞80％滿底，以無血清的培養(yǎng)基洗細(xì)胞，并在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時(shí)，收集含GPIb vWf因子結(jié)合域多肽的上清液；10、收集后的上清液以凝血酶親合柱純化，得到產(chǎn)品。
實(shí)施例3、瑞斯托菌素誘導(dǎo)血小板凝集試驗(yàn)的抑制作用從健康人采集全血按1∶10與3.14％的檸檬酸鈉混合，100g離心15分鐘收集富含血小板的上清(PRP)，以無血小板的血清(PPP)調(diào)節(jié)血小板濃度為300×106/ml。上述兩個(gè)實(shí)施例中得到的純化重組蛋白質(zhì)稀釋成不同的濃度，先與PRP在室溫孵育5分鐘后，將瑞斯托菌素加入PRP中至終濃度為1.5mg/ml，在血小板聚集儀上測定凝集率，結(jié)果如圖8、圖9、圖10所示，5分鐘內(nèi)瑞斯托菌素誘導(dǎo)的血小板最大聚集率、rhGP302對瑞斯托菌素誘導(dǎo)的血小板最大聚集率、rhGPIb對瑞斯托菌素誘導(dǎo)的血小板最大聚集率分別為89、39和48，結(jié)果表明兩種重組蛋白質(zhì)均具有對瑞士托菌素誘導(dǎo)的血小板凝集有抑制作用。
權(quán)利要求
1.一種制備人血小板糖蛋白GPIbα的方法，包括以下步驟1)設(shè)計(jì)引物上游5’-CGCGGATCCATGCCTCTCCTCCTCTTGCTG-3’下游5’-CCGGAATTCTCAGAGGCTGTGGCCAGAGTACC-32)以細(xì)胞總RNA為模板利用RT-PCR釣取GPIb的全長cDNA；3)構(gòu)建真核表達(dá)重組質(zhì)粒；4)將重組質(zhì)粒導(dǎo)入真核細(xì)胞中；5)培養(yǎng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞；6)收集轉(zhuǎn)染細(xì)胞分泌的人血小板糖蛋白GPIbα。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備人血小板糖蛋白GPIbα的方法，其特征在于所述構(gòu)建真核表達(dá)重組質(zhì)粒，是將全長cDNA插入經(jīng)BamH I和EcoR I雙酶切處理后的真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)，獲得質(zhì)粒pcDNA3.1-GPF。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備人血小板糖蛋白GPIbα的方法，其特征在于所述重組質(zhì)粒導(dǎo)入的真核細(xì)胞是CHO。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備人血小板糖蛋白GPIbα的方法，其特征在于收集由轉(zhuǎn)染細(xì)胞分泌的上清液，以凝血酶親合柱純化后，得到人血小板糖蛋白GPIbα。
5.一種制備人血小板糖蛋白GPIbαvWf因子結(jié)合域多肽的方法，包括以下步驟1)設(shè)計(jì)引物上游5’-CGCGGATCCATGCCTCTCCTCCTCTTGCTG-3’下游5’-CCGGAATTCTCAGGCTTTGGTGGGGAACTTG-3’2)以GPIb的全長cDNA為模板，用PCR法克隆GPIb vWf因子結(jié)合域的cDNA。3)構(gòu)建真核表達(dá)重組質(zhì)粒；4)將重組質(zhì)粒導(dǎo)入真核細(xì)胞中；5)培養(yǎng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞；6)收集轉(zhuǎn)染細(xì)胞分泌的人血小板糖蛋白GPIb vWf因子。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備人血小板糖蛋白GPIbα vWf因子結(jié)合域多肽的方法，其特征在于所述GPIb的全長cDNA是用下述引物上游5’-CGCGGATCCATGCCTCTCCTCCTCTTGCTG-3’下游5’-CCGGAATTCTCAGAGGCTGTGGCCAGAGTACC-3以細(xì)胞總RNA為模板利用RT-PCR釣取的。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備人血小板糖蛋白GPIbαvWf因子結(jié)合域多肽的方法，其特征在于所述構(gòu)建真核表達(dá)重組質(zhì)粒，是將vWf因子結(jié)合域的全長cDNA插入經(jīng)BamH I和EcoR I雙酶切處理后的真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)，獲得質(zhì)粒pcDNA3.1-GP302。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備人血小板糖蛋白GPIbα vWf因子結(jié)合域多肽的方法，其特征在于所述重組質(zhì)粒導(dǎo)入的真核細(xì)胞是CHO。
9.制備人血小板糖蛋白GPIbα的一對專用引物上游5’-CGCGGATCCATGCCTCTCCTCCTCTTGCTG-3’下游5’-CCGGAATTCTCAGAGGCTGTGGCCAGAGTACC-3
10.制備人血小板糖蛋白GPIbαvWf因子結(jié)合域多肽的一對專用引物上游5’-CGCGGATCCATGCCTCTCCTCCTCTTGCTG-3’下游5’-CCGGAATTCTCAGGCTTTGGTGGGGAACTTG-3’
全文摘要
本發(fā)明的名稱為人血小板糖蛋白GPIbα的制備方法及其專用引物。本發(fā)明的目的是提供一種制備人血小板糖蛋白GPIbα的方法及其專用引物。本發(fā)明的技術(shù)方案包括以下步驟1)設(shè)計(jì)引物上游5’－CGCGGATCCATGCCTCTCCTCCTCTTGCTG－3’；下游5’－CCGGAATTCTCAGAGGCTGTGGCCAGAGTACC－3；2)以細(xì)胞總RNA為模板利用RT－PCR釣取GPIb的全長cDNA；3)構(gòu)建真核表達(dá)重組質(zhì)粒；4)將重組質(zhì)粒導(dǎo)入真核細(xì)胞中；5)培養(yǎng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞；6)收集轉(zhuǎn)染細(xì)胞分泌的人血小板糖蛋白GPIbα。本發(fā)明為進(jìn)一步開發(fā)新型血小板代用品以及診斷、檢測和治療血管內(nèi)創(chuàng)傷的診斷試劑提供了堅(jiān)實(shí)的理論及必要的原材料基礎(chǔ)。
文檔編號C12N15/11GK1408725SQ0114189
公開日2003年4月9日 申請日期2001年9月18日 優(yōu)先權(quán)日2001年9月18日
發(fā)明者張克強(qiáng), 王字玲, 王波 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院野戰(zhàn)輸血研究所